鞣質(zhì)聯(lián)合環(huán)丙沙星對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌生物膜形成的影響*

彭丹 ，宋麗 ，陳澤慧 ，董澤令 ，周小仙 ，陳安林 ，李亞男

（1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，貴州 遵義 563000；2.遵義醫(yī)學(xué)院，貴州 遵義 563003）

鞣質(zhì)聯(lián)合環(huán)丙沙星對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌生物膜形成的影響*

彭丹1，宋麗2，陳澤慧1，董澤令1，周小仙2，陳安林1，李亞男2

（1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，貴州 遵義 563000；2.遵義醫(yī)學(xué)院，貴州 遵義 563003）

目的 研究石榴皮提取物鞣質(zhì)聯(lián)合環(huán)丙沙星（CIP）對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌（Ab）生物膜形成的影響。方法采用2倍稀釋法測(cè)得石榴皮提取物鞣質(zhì)和CIP對(duì)Ab ATCC19606的最低抑菌濃度（MIC）；將1/2MIC、MIC、2MIC濃度的鞣質(zhì)和CIP單獨(dú)及聯(lián)合用藥作用于Ab生物膜4、8、24和48 h，采用結(jié)晶紫法和熒光顯微鏡法觀察生物膜的形成。結(jié)果 鞣質(zhì)和CIP對(duì)Ab的MIC值為1.95和0.50 mg/ml；聯(lián)合用藥較單獨(dú)用藥對(duì)Ab生物膜的形成影響大，且2MIC鞣質(zhì)+2MIC CIP聯(lián)合作用24 h，對(duì)生物膜形成影響最大。結(jié)論 石榴皮提取物鞣質(zhì)和CIP聯(lián)合用藥對(duì)生物膜形成的影響比單獨(dú)用藥明顯，且2MIC鞣質(zhì)+2CIP聯(lián)合用藥對(duì)Ab生物膜作用24 h影響效果最佳。

鮑曼不動(dòng)桿菌；生物膜；石榴皮提取物鞣質(zhì)；環(huán)丙沙星

鮑曼不動(dòng)桿菌（acinetobacter baumanni，Ab）為革蘭陰性非發(fā)酵菌，廣泛存在于自然界、醫(yī)院環(huán)境及健康人的皮膚；該菌生存力及黏附力極強(qiáng)，可長(zhǎng)期定植于醫(yī)院，易形成生物膜，使耐藥性大大增加，導(dǎo)致感染難以控制[1]。生物膜是細(xì)菌生長(zhǎng)過(guò)程中為適應(yīng)環(huán)境的一種優(yōu)勢(shì)生存方式。生物膜一旦形成，保護(hù)細(xì)菌不受抗菌藥物和消毒劑的影響，其膜內(nèi)細(xì)菌耐藥性比浮游菌增加10～1 000倍[2]。如今，新開(kāi)發(fā)一種抗生素周期長(zhǎng)，不利于感染的控制，而且西藥容易產(chǎn)生耐藥，那么尋找新的治療方案刻不容緩。我國(guó)中草藥資源豐富，來(lái)源范圍廣、價(jià)格便宜、毒副作用小、不輕易產(chǎn)生耐藥性、在病原體內(nèi)有多方面的作用及藥效，為西藥抗菌藥物之后的一個(gè)新藥方向。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，五倍子、大蒜素、苦參等中藥影響細(xì)菌生物膜[3-5]。鞣質(zhì)是石榴皮主要成分，主要藥理作用是收斂、抗菌，本實(shí)驗(yàn)將研究其是否對(duì)生物膜有破壞作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源 實(shí)驗(yàn)菌株：鮑曼不動(dòng)桿菌ATCC1 9606；質(zhì)控菌株：大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853、金黃色葡萄球菌ATCC25923，以上購(gòu)自上海寶錄生物有限公司。

1.1.2 藥物 石榴皮購(gòu)自遵義樹(shù)林大藥房，經(jīng)遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科鑒定為合格品；環(huán)丙沙星（Ciprofloxacin，CIP）購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。1.1.3 主要儀器及試劑 日本Olympus熒光顯微鏡，法國(guó)梅里埃公司的VITEK2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定及藥敏分析儀、配套藥敏卡，北京百靈威科技有限公司結(jié)晶紫，美國(guó)Thermo酶標(biāo)儀等。

1.2 方法

1.2.1 鞣質(zhì)的提取及原液的制備 石榴皮粉碎后，經(jīng)過(guò)加熱回流法提取鞣質(zhì)，粗提物分別經(jīng)5%三氯化鐵乙醇溶液和紫外分光光度計(jì)做定性和定量檢測(cè)，按照2010版藥典以沒(méi)食子酸的含量作為質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)；鞣質(zhì)提取成功后，稱(chēng)取0.1875 g溶于3 ml M-H肉湯中，配制濃度為62.50 mg/ml。

1.2.2 鞣質(zhì)對(duì)Ab最低抑菌濃度的測(cè)定 將Ab ATCC19606配制成0.5麥?zhǔn)暇簼舛?，然后將菌液稀?00倍；準(zhǔn)備8支無(wú)菌試管，1～6號(hào)試管分別加入1 ml肉湯，將1 ml鞣質(zhì)原液加入1號(hào)試管，混勻后再吸出1 ml于第2管，依次進(jìn)行2倍稀釋?zhuān)?號(hào)管吸出1 ml棄去；7號(hào)管作為陰性對(duì)照，8號(hào)管為陽(yáng)性對(duì)照，進(jìn)行孵育培養(yǎng)，觀察最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）。

1.2.3 CIP原液的配制 使用VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定儀，使用大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853、金黃色葡萄球菌ATCC259 23進(jìn)行質(zhì)控，用藥敏卡檢測(cè)CIP對(duì)Ab的藥敏結(jié)果，根據(jù)其敏感范圍（＜1μg/μl），稱(chēng)取 0.04 g CIP，溶于10ml M-H肉湯當(dāng)中，配制濃度為4mg/ml CIP溶液。

1.2.4 CIP對(duì)Ab的MIC測(cè)定 將Ab ATCC19606配制成0.5麥?zhǔn)暇簼舛?，然后將菌液稀?00倍；準(zhǔn)備8支無(wú)菌試管，1～6號(hào)試管分別加入1 ml肉湯，將1 ml CIP原液加入1號(hào)試管，混勻后再吸出1 ml于第2管，依次進(jìn)行2倍稀釋?zhuān)?號(hào)管吸出1 ml棄去；7號(hào)管作為陰性對(duì)照，8號(hào)管為陽(yáng)性對(duì)照，進(jìn)行孵育培養(yǎng)，觀察MIC值。

1.2.5 生物膜的建立 吸取一定量菌液濃度為1×106CFU/ml的Ab加入孔板內(nèi)，37℃靜置培養(yǎng)48 h，形成生物膜。

1.2.6 結(jié)晶紫微孔板法 將形成生物膜的孔板內(nèi)加入 100 μl 1/2MIC、1MIC、2MIC 鞣質(zhì)溶液，1/2MIC、1MIC、2MIC的CIP溶液，以及聯(lián)合用藥鞣質(zhì)和CIP各50 μl，100 μl PBS 為對(duì)照組，37℃分別培養(yǎng) 4、8、24和48 h，在相應(yīng)的時(shí)間將抗菌藥物吸出，清洗掉抗菌藥物；每孔加入200 μl 0.25 g/L結(jié)晶紫染液，染色20 min，洗掉多余的染液；每孔加入200 μl 95%乙醇脫色15 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)微孔板在570 nm處的光密度值。

1.2.7 FITC-ConA標(biāo)記顯微鏡技術(shù) 將形成生物膜的孔板中加入1ml 1/2MIC、1MIC、2MIC鞣質(zhì)溶液，1/2MIC、1MIC、2MIC 的 CIP 溶液，以及聯(lián)合用藥鞣質(zhì)和CIP各0.5 ml。對(duì)照孔加入1 ml無(wú)菌PBS溶液，37℃培養(yǎng)24 h；用50 μl FITC-ConA熒光染料染色，在熒光顯微鏡波長(zhǎng)為480 nm處觀察不同濃度鞣質(zhì)和CIP對(duì)Ab生物膜形成的影響。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鞣質(zhì)和CIP對(duì)Ab的MIC值

石榴皮提取物鞣質(zhì)和CIP對(duì)Ab ATCC19696的MIC分別為1.95和和0.50 mg/ml。

2.2 鞣質(zhì)和CIP對(duì)Ab已形成生物膜的破壞作用

2.2.1 結(jié)晶紫微孔板法結(jié)果 各組4、8、24和48 h對(duì)生物膜形成影響比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。單用組對(duì)形成的生物膜作用4 h后，與空白組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；單用組作用8 h后，不同濃度的CIP與空白組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而不同濃度的鞣質(zhì)單用組與空白組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；單用組分別作用24和48 h后，不同濃度的鞣質(zhì)、CIP單用組與空白組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。不同濃度的鞣質(zhì)和CIP聯(lián)合組對(duì)Ab生物膜的影響，與空白組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且隨著藥物濃度逐漸增加，光密度值逐漸降低，其中以2MIC鞣質(zhì)+2MIC CIP組作用24 h效果最好。見(jiàn)附表和圖1。

附表 不同藥物組合對(duì)Ab生物膜形成的影響 （±s）

附表 不同藥物組合對(duì)Ab生物膜形成的影響 （±s）

注：1）與空白組比較，P ＜0.05；2）與鞣質(zhì)、CIP 單用組比較，P ＜0.05

組別 4 h 8 h 24 h 48 h空白組 2.01±0.24 2.15±0.13 2.20±0.42 2.23±0.48 1/2MIC鞣質(zhì)組 1.71±0.28 1.76±0.251） 1.63±0.141） 1.65±0.231）MIC鞣質(zhì)組 1.58±0.43 1.54±0.511） 1.53±0.221） 1.62±0.171）2MIC鞣質(zhì)組 1.62±0.18 1.68±0.181） 1.66±0.451） 1.58±0.281）1/2MIC CIP組 1.94±0.31 1.90±0.18 1.71±0.301） 1.73±0.321）MIC CIP組 1.87±0.17 1.88±0.16 1.76±0.191） 1.86±0.311）2MIC CIP組 1.90±0.42 1.94±0.41 1.74±0.251） 1.63±0.181）1/2MIC鞣質(zhì) +1/2MIC CIP 組 1.45±0.441）2） 1.43±0.471）2） 1.33±0.331）2） 1.23±0.381）2）1/2MIC 鞣質(zhì) +MIC CIP 組 1.45±0.141）2） 1.36±0.401）2） 1.34±0.341）2） 1.15±0.141）2）1/2MIC鞣質(zhì) +2MIC CIP 組 1.30±0.251）2） 1.31±0.161）2） 1.21±0.381）2） 1.11±0.321）2）MIC鞣質(zhì) +1/2MIC CIP 組 1.14±0.301）2） 1.12±0.281）2） 0.73±0.191）2） 0.72±0.241）2）MIC鞣質(zhì) +MIC CIP 組 1.08±0.141）2） 1.06±0.341）2） 0.76±0.241）2） 0.66±0.261）2）MIC鞣質(zhì) +2MIC CIP 組 1.03±0.291）2） 1.03±0.251）2） 0.65±0.351）2） 0.68±0.171）2）2MIC鞣質(zhì) +1/2MIC CIP 組 0.87±0.111）2） 0.85±0.271）2） 0.51±0.221）2） 0.53±0.301）2）2MIC 鞣質(zhì) +MIC CIP 組 0.83±0.271）2） 0.84±0.331）2） 0.48±0.131）2） 0.49±0.161）2）2MIC 鞣質(zhì) +2MIC CIP 組 0.76±0.141）2） 0.72±0.141）2） 0.40±0.171）2） 0.46±0.11）2）F值 1602.32 820.61 478.50 520.13 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

圖1 不同藥物組合對(duì)Ab生物膜形成的影響

2.2.2 FITC-ConA標(biāo)記顯微鏡技術(shù)結(jié)果 不同濃度的鞣質(zhì)和CIP單用及聯(lián)合用藥對(duì)Ab生物膜作用24 h后，經(jīng)FITC-ConA熒光染色后在熒光顯微鏡480 nm處觀察細(xì)菌生物膜的形成情況?？瞻捉M、不同濃度鞣質(zhì)和CIP單用，顯微鏡下均可見(jiàn)大片明亮綠色熒光；當(dāng)1/2MIC鞣質(zhì)與不同濃度CIP聯(lián)用后，可見(jiàn)較疏松的綠色熒光；1MIC鞣質(zhì)與不同濃度CIP聯(lián)用后，可見(jiàn)篩網(wǎng)狀綠色熒光；2MIC鞣質(zhì)與不同濃度的CIP聯(lián)用后，綠色熒光明顯減少，以2MIC鞣質(zhì)與2MIC CIP聯(lián)用作用最明顯。見(jiàn)圖2。

圖2 不同藥物組合對(duì)Ab生物膜形成的影響（熒光顯微鏡×400）

3 討論

近年來(lái)Ab發(fā)病率和致病率日趨增多，且對(duì)多種抗菌藥物耐藥，其主要的原因之一是產(chǎn)生生物膜。有研究表明，Ab的耐藥性與生物膜的產(chǎn)生密切相關(guān)，膜內(nèi)細(xì)菌耐藥性比浮游菌增加10～1 000倍，給臨床抗感染帶來(lái)極大挑戰(zhàn)和困難[6]。目前使用較為廣泛的藥物就是抗生素，但是單獨(dú)使用某種抗生素，Ab很快出現(xiàn)耐藥；而且新開(kāi)發(fā)一種抗生素周期長(zhǎng)，很不利于感染的控制，聯(lián)合用藥成為目前首選方案。石榴皮提取物鞣質(zhì)，具有收斂、抗菌作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)鞣質(zhì)對(duì)Ab具有較好的抑菌效果；CIP為合成的第3代喹諾酮類(lèi)，為治療Ab感染常用藥物。國(guó)內(nèi)學(xué)者殷網(wǎng)虎等[7]研究白藜蘆醇對(duì)Ab生物膜具有破壞作用；史鵬等[8]研究得出抗菌肽LL-37對(duì)Ab生物膜具有破壞作用；國(guó)外學(xué)者LUíS等[9]研究沒(méi)食子酸、咖啡酸及綠原酸對(duì)葡萄球菌生物膜的破壞作用；ALVES等[10]研究芫荽精油成分對(duì)Ab生物膜的影響。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)結(jié)晶紫微孔板法和FITC-ConA標(biāo)記顯微鏡技術(shù)，探討石榴皮提取物鞣質(zhì)與CIP單獨(dú)及聯(lián)合用藥對(duì)生物膜的作用。在結(jié)晶紫微孔板法中，單用組對(duì)生物膜作用4h后，與空白組比較無(wú)差異；單用組作用8 h后，不同濃度的CIP單用組與空白組比較無(wú)差異，不同濃度的鞣質(zhì)單用組比較有差異；單用組在分別作用24和48 h后，不同濃度的鞣質(zhì)和CIP單用組與空白組比較有差異。不同濃度的鞣質(zhì)和CIP聯(lián)用對(duì)Ab生物膜形成，與空白組比較有差異。聯(lián)合用藥對(duì)生物膜形成影響較為明顯。FITC-ConA標(biāo)記顯微鏡技術(shù)結(jié)果標(biāo)明，空白組、不同濃度鞣質(zhì)和CIP單用，顯微鏡下均可見(jiàn)大片明亮綠色熒光；當(dāng)1/2 MIC鞣質(zhì)與不同濃度的CIP聯(lián)用后，可見(jiàn)較疏松的綠色熒光；1MIC鞣質(zhì)與不同濃度的CIP聯(lián)用后，可見(jiàn)篩網(wǎng)狀綠色熒光；2MIC鞣質(zhì)與不同濃度的CIP聯(lián)用后，綠色熒光明顯減少，以2MIC鞣質(zhì)與2MIC CIP聯(lián)用作用最明顯。聯(lián)合用藥對(duì)生物膜影響明顯。

本研究只進(jìn)行了體外實(shí)驗(yàn)，以后還需進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，最終為控制Ab的感染提供科學(xué)依據(jù)。

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Tannin combination with Ciprofloxacin could effect on biofilm ofAcinetobacter baumanni*

Dan Peng1,Li Song2,Ze-hui Chen1,Ze-ling Dong1,Xiao-xian Zhou2,An-lin Chen1,Ya-nan Li2
(1.The Affiliated Hospital of Zunyi Medical College,Zunyi,Guizhou 563000,China;2.Zunyi Medical College,Zunyi,Guizhou 563003,China)

Objective To explore the effect of tannin extracted from Pomegranaterind combined with Ciprofloxacin (CIP)on thebiofilm ofAcinetobacterbaumanni (Ab).MethodsTheminimalinhibitory concentrations (MIC)of tannin and CIP to Ab ATCC19606 were determined by broth dilution method.The 1/2MIC,MIC and 2MIC of tannin,CIP and their combination acted on Ab for 4,8,24 and 48 h,respectively;then the biofilm formation of Ab was observed by crystal violet staining assay and fluorescence microscopy.Results The MIC of tannin and CIP to Ab ATCC19606 were 1.95 mg/ml and 0.50 mg/ml respectively.The effect of tannin or CIP separately on the biofilm of Ab was weaker than that of their combination.And their combination could have some effect on the biofilms,of which the combined use of 2MIC tannin and 2MIC CIP for 24 h had the greatest effect on biofilm formation of Ab.Conclusions Combined use of tannin extracted fromPomegranaterind and CIP has more obvious effect on the biofilm formation of Ab,moreover,the combination of 2MIC tannin and 2MIC CIP for 24 h has the best effect.

Acinetobacter baumanni;biofilm;tannin extracted fromPomegranaterind;Ciprofloxacin

R446.5

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.26.006

1005-8982（2017）26-0030-05

2017-01-04

貴州省科技廳合作計(jì)劃[No：黔科合 LH（2015）7480）]；遵義醫(yī)學(xué)院基金[No：院字（2009）22 號(hào)][

陳澤慧，E-mail：941291773@qq.com

（童穎丹 編輯）