雷麗萍，吳玉萍，莫笑晗，周駿，夏振遠(yuǎn)

1 云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 昆明 630021；

2 上海煙草集團(tuán)北京卷煙廠 北京 010000

生物技術(shù)

TSNAs降解菌05-5402的篩選及其降解特性研究

雷麗萍1，吳玉萍1，莫笑晗1，周駿2，夏振遠(yuǎn)1

1 云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 昆明 630021；

2 上海煙草集團(tuán)北京卷煙廠 北京 010000

為分離篩選能夠降解TSNAs的微生物，探討其降解特性，本研究采用替代底物平板稀釋法分離和靶標(biāo)底物點(diǎn)接法篩選相結(jié)合的分離篩選策略，篩選到能夠利用NNK為唯一碳源和氮源而生長的細(xì)菌05-5402菌株，鑒定為短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）。白肋煙浸提液經(jīng)05-5402菌株處理后，TSNAs含量降低了22.2%，其中NNK和NAT的含量分別降低了47.4%和55.7%。晾制的煙葉經(jīng)05-5402菌株處理后，TSNAs降低17.3%，其中，NAB的含量降低了52.2%。發(fā)酵過程中的煙絲經(jīng)05-5402菌株處理，TSNAs含量下降12.2%。05-5402菌株能實(shí)現(xiàn)煙草特有亞硝胺的高效定向降解，具有較大的應(yīng)用潛力。

煙草；煙草特有亞硝胺；短小芽孢桿菌；降解特性

煙草特有亞硝胺（TSNAs）是煙草特有的N-亞硝基類化合物，是煙葉中重要的有害成分[1]，NNN、NNK、NAB、NAT是煙草和煙氣中主要的TSNAs[2-3]。煙葉是卷煙的主要原料，也是卷煙煙氣中TSNAs的主要來源[4]。影響煙葉中TSNAs含量的因素很多，其中主要有煙草類型[5]、煙草組織[6]、栽培方式[7]、調(diào)制方法[8]、微生物降解[9]、氮肥施用量[10]、硝酸還原酶及亞硝化酶的活性等。目前已有的有效方法通過改變上述影響因子從而降低TSNAs的含量，例如選育良種、控制氮肥、適時(shí)采收等農(nóng)業(yè)栽培措施，及利用馬來酰肼、維生素C和α-生育酚等化學(xué)制劑等。利用微生物也是一個(gè)具有應(yīng)用前景的TSNAs調(diào)控措施，日本煙草產(chǎn)業(yè)株式會社[11]利用少動鞘氨醇單胞菌和熒光假單胞菌減少煙葉中TSNAs含量；張玉芹等[9]利用反硝化細(xì)菌降低煙絲中硝酸鹽、亞硝酸鹽和TSNAs含量；張玉玲等[12]用放線根瘤菌(Rhizobium radiobacter）對煙株進(jìn)行灌根處理，采收時(shí)噴灑煙葉處理，結(jié)果為兩種處理的煙葉TSNAs含量明顯降低。據(jù)現(xiàn)有的研究，推測某些微生物能夠降低煙草TSNAs含量的機(jī)制主要包括兩個(gè)方面，一是這些微生物具有還原硝酸鹽和亞硝酸鹽的能力，使TSNAs合成的前體物質(zhì)減少，導(dǎo)致煙草TSNAs含量下降；另一種可能是接種微生物數(shù)量大或產(chǎn)生抗生素類物質(zhì)，抑制引起TSNAs積累的微生物類群，從而降低TSNAs的含量[13]。綜上，目前有關(guān)微生物降低煙草TSNAs含量的研究主要集中在微生物對TSNAs合成的環(huán)節(jié)，而對TSNAs降解的作用未見報(bào)道。本研究試圖從微生物降解TSNAs的角度出發(fā)，研究降低煙草TSNAs微生物的資源和降解特性，為通過微生物降低煙草TSNAs含量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基

分離培養(yǎng)基（g/L）：瓊脂15.0、K2HPO41.5、KH2PO40.4、NaCl 0.1、MgSO4.7H2O 0.1、CaCl20.04、MnSO4.H2O 0.002、CuSO4.5H2O 0.001、ZnSO4.7H2O 0.002、NaMoO4.2H2O 0.002、 尼 古 丁1.0。

篩選培養(yǎng)基：上述分離培養(yǎng)基中的尼古丁替換為NNK。

1.1.2 儀器與器材

恒溫恒濕箱（德國 Memmert公司）、高效液相色譜及三重四級桿質(zhì)譜檢測器（美國Waters公司）、PCR儀（美國Life Technologies公司）、高速大容量冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司）、恒溫?fù)u床（瑞士 INFORS公司）。

1.1.3 試劑

NNK、NNN、NAT、NAB（ ≥ 98%，Toronto Research Chemicals）、乙腈（色譜純，MERCK）、其他試劑（分析純，國產(chǎn)）、Taq酶及細(xì)菌基因組提取試劑盒（大連TaKaRa公司）。

1.1.4 煙絲

由上海煙草集團(tuán)北京卷煙廠提供。

1.2 方法

1.2.1 05-5402菌株的分離篩選

將煙葉或植煙土壤研磨后加入無菌水，于室溫下振蕩提取30min，將提取懸濁液用稀釋平板的方法25℃培養(yǎng)48 h，挑取能在分離培養(yǎng)基上旺盛生長的菌株；共計(jì)分離137個(gè)樣品，得到869個(gè)菌落。將這些菌株以點(diǎn)接的方式轉(zhuǎn)接到篩選培養(yǎng)基平板上，25℃培養(yǎng)48 h，有122株細(xì)菌能夠生長，一株長勢最旺盛的細(xì)菌標(biāo)記為05-5402，菌株已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCC No.7418。

1.2.2 菌株鑒定

通過常規(guī)生物學(xué)、生理生化特性檢測和分子生物學(xué)方法對菌株05-5402進(jìn)行鑒定。菌株05-5402的形態(tài)特征及生理生化性狀分析按照文獻(xiàn)［14］進(jìn)行。16S rRNA 基因序列測定分析方法如下：細(xì)菌基因組DNA的提取用TaKaRa MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.2.0，方法參見試劑盒說明書。PCR擴(kuò)增選用引物F27（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′） 和 R1492（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'），常規(guī)條件擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)TaKaRa Agarose Gel DNA Puri fi cation Kit Ver.2.0回收后，連接于載體pMD18-T Vector，轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α，陽性克隆委托上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測定。測得的16S rDNA全序列經(jīng)EzTaxon server(http://www.ezbiocloud.net/)同源性搜索[15]，并用Mega 4.0軟件將該序列與常見的芽孢桿菌菌株的16S rDNA全序列構(gòu)建立系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 煙草浸提液中TSNAs的降解

按白肋煙末∶蒸餾水=1∶10的比例混勻，超聲波浸提30min后過濾，濾液調(diào)節(jié)pH至7.2～7.4，300mL三角瓶分裝100mL滅菌。挑取05-5402一環(huán)接種，以不接菌作為對照（CK），各處理重復(fù)3次。150 rpm振蕩培養(yǎng)48 h后，浸提液8000 rpm常溫離心10min，經(jīng)0.22 μm水相濾膜過濾，采用UPLCMS / MS 進(jìn)行TSNAs含量分析[16]。

1.2.4 調(diào)制煙葉TSNAs的降解

采用半葉法進(jìn)行調(diào)制煙葉TSNAs的降解實(shí)驗(yàn)，在調(diào)制前，一半葉片噴施4%葉重的05-5402發(fā)酵液，另一半噴施無菌水作為對照（CK）。將煙葉置于培養(yǎng)箱內(nèi)，在30℃、相對濕度80%的條件下調(diào)制7 d，使葉片干燥。

TSNAs含量檢測。將煙葉在65℃烘干研磨后過100目篩，稱取煙末1.0 g（精確到0.1mg），置于100mL的錐形瓶中，加入20mL 100mmol/L的乙酸銨水溶液，超聲萃取60min。靜置后取2mL上層清液經(jīng)0.2 μm水相濾膜過濾，進(jìn)行UPLC-MS/MS檢測TSNAs含量[16]。

1.2.5 煙絲中TSNAs的降解

05-5402菌株經(jīng)LB培養(yǎng)基液體培養(yǎng)，離心去培養(yǎng)基后用無菌水重新懸浮，懸浮液含菌量為0.8×1010cfu/mL。煙絲充分混合均勻后分成處理和對照（CK）兩組。處理組噴施煙絲重量4%的05-5402菌懸液，對照組噴施等量的無菌水，處理和對照各設(shè)3次重復(fù)。將煙絲的水分含量調(diào)整到30%（m/m），放置于30℃，相對濕度為80%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱內(nèi)處理5d。處理后煙絲TSNAs含量檢測方法同1.2.4。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)方法

檢測數(shù)據(jù)采用PAST V.3.14進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算和t檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 05-5402菌株的鑒定

05-5402菌株于28℃在NA平板上培養(yǎng)24 h，菌落呈圓形，直徑2～3 mm，扁平無凸起，乳白色，有光澤，邊緣不整齊，為好氧菌。菌株為革蘭氏陽性，芽孢橢圓形中生或端生，不膨大，芽孢比菌體小，存在于菌體中，菌體平均大小為0.61～0.68 μm×2.2～2.8 μm。該菌株過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)、VP實(shí)驗(yàn)、產(chǎn)H2S實(shí)驗(yàn)、明膠液化實(shí)驗(yàn)、卵磷脂酶實(shí)驗(yàn)反應(yīng)呈陽性；水解淀粉實(shí)驗(yàn)、產(chǎn)NH3實(shí)驗(yàn)、甲基紅實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)、水解脂肪實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)反應(yīng)呈陰性。

05-5402菌株經(jīng)核酸提取后，16s rDNA擴(kuò)增測序得到1513 bp的核酸序列，Genbank注冊號KY427112，經(jīng)EzTaxon server(http://www.ezbiocloud.net/)同源性搜索，該菌16s rDNA序列與芽孢桿菌同源性最高，相似性為99.52%。在Ribosomal Database數(shù)據(jù)庫中選取10株屬于Bacillus屬的不同種的芽孢桿菌模式菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，查看屬種間的遺傳進(jìn)化關(guān)系（圖1）。從系統(tǒng)發(fā)育樹看，05-5402與B.pumilus、B.australimaris和B.zhangzhouensis處 于同一分支，說明它們的遺傳進(jìn)化關(guān)系最近，結(jié)合05-5402菌株的生理生化特性，將其鑒定為短小芽孢桿菌（B.pumilus）。

圖1 菌株05-5402的16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Neighbour-joining phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence of 05-5402

2.2 05-5402菌株對煙草浸提液TSNAs的降解

由表1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)可知，菌株05-5402對白肋煙浸提液中的TSNAs具有降解效果。經(jīng)48 h處理，浸提液中TSNAs含量較對照降低了22.2%，處理與對照達(dá)到了極顯著的差異水平，NNK和NAT的含量分別降低了47.4%和55.7%。

2.3 05-5402菌株對煙葉TSNAs的降解

通過半葉法評價(jià)05-5402在煙葉晾制階段對TSNAs的降解作用，由表2數(shù)據(jù)可知，菌株05-5402能使煙葉中的TSNAs含量明顯下降，總體下降幅度為17.3%，t檢驗(yàn)結(jié)果顯示差異顯著。NAB的含量降低了52.2%，達(dá)極顯著水平，其他3種TSNAs也有降低，但t檢驗(yàn)差異不顯著。

表1 菌株05-5402對煙草浸提液中TSNAs的降解效果Tab.1 Effect of strain 05-5042 on the contents of TSNAs of burley tobacco extracts ng/g

表2 菌株05-5402對調(diào)制期煙葉中TSNAs的降解效果Tab.2 Effect of strain 05-5042 on the contents of TSNAs of tobacco during air-curing ng/g

2.4 05-5402菌株對發(fā)酵煙絲中TSNAs的降解

由表3數(shù)據(jù)可知，菌株05-5402能使煙絲中的TSNAs含量明顯下降，總體降低了12.2%，對4種TSNAs均有降解效果。其中，NNN、NAT和NAB的含量分別降低了12.9%、11.0%和10.3%。經(jīng)t檢驗(yàn)，NNN和TSNAs在05-5402菌株處理和對照之間差異達(dá)到了極顯著水平。

表3 菌株05-5402對煙絲中TSNAs的降解效果Tab.3 Effect of strain 05-5042 on the contents of TSNAs in cut tobacco ng/g

3 討論與結(jié)論

以往的研究[17-20]，多以細(xì)菌的硝酸還原能力來篩選降解菌株，噴施微生物能降低煙葉中的TSNAs含量，這些研究是建立在TSNAs的形成是以亞硝酸鹽以及氮氧化物(NOX)為底物的理論基礎(chǔ)上，通過微生物的作用降低煙葉中的亞硝酸鹽，而降低煙葉中TSNAs的合成數(shù)量。已有研究證明，某些微生物可以降解TSNAs[21]，按照微生物降解TSNAs的思路，本研究利用替代底物平板稀釋法分離和靶標(biāo)底物點(diǎn)接法篩選相結(jié)合，篩選到能夠利用NNK為唯一碳源和氮源而生長的細(xì)菌。以尼古丁替代TSNAs作為培養(yǎng)基進(jìn)行微生物分離，以靶標(biāo)底物點(diǎn)接法進(jìn)行功能篩選，避免了研究過程中使用大量的靶標(biāo)TSNAs，利于降低研究成本。本研究從有降解尼古丁功能的869株細(xì)菌中篩選到以NNK為唯一碳源和氮源的菌株122株，說明在自然界中存在著大量的能降解NNK的微生物。此結(jié)果將豐富應(yīng)用微生物降低煙草TSNAs含量的資源和途徑。本研究通過對煙葉浸提液、煙葉和煙絲處理后的TSNAs含量檢測，證明05-5402菌株均能降低TSNAs含量，其降解TSNAs的效率表現(xiàn)為溶液中大于煙絲發(fā)酵，其原因可能與菌株增殖和降解環(huán)境有關(guān)。有關(guān)05-5402菌株降解TSNAs的降解途徑和機(jī)理等問題有待于進(jìn)一步研究。

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Isolation and screen of TSNAs-degrading bacillus 05-5402 and its degradation characteristics

LEI Liping1,WU Yuping1,MO Xiaohan1,ZHOU Jun2,XIA Zhenyuan1*
1 Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Science,Kunming 630021,China；
2 Beijing Cigarette Factory,Shanghai Tobacco Group,Beijing 010000,China

The aim of current study was to isolate and screen TSNAs-degrading microorganism,and study its degradation characteristics.TSNAs-degrading Bacillus isolate 05-5402 was obtained by isolating bacillus using dilution-plate method with nicotine as alternative substrate,and was screened by selective medium containing NNK as sole carbon and nitrogen sources.Isolate 05-5402 was identi fi ed asBacillus pumilusby physio-biochemical characteristics and 16S rRNA gene sequence analysis.Isolate 05-5402 could degrade 22.2% of total TSNAs in the extracts of burley tobacco,and 47.4% of NNK and 55.7% of NAT.Isolate 05-5402 could reduce 17.3% of total TSNAs in tobacco during air-curing period,and 52.2% of NAB.Total TSNAs content of cut tobacco was reduced by 12.2% after fermentation with isolate 05-5402.Isolate 05-5402 can degrade TSNAs efficiently,which has application potential.

tobacco; TSNAs;Bacillus pumilus; degradation characteristics

雷麗萍，吳玉萍，莫笑晗，等.TSNAs降解菌05-5402的篩選及其降解特性研究[J].中國煙草學(xué)報(bào)，2017,23（5）

中國煙草總公司卷煙減害技術(shù)重大專項(xiàng)（110201101035（JH-10））

雷麗萍（1963—），碩士，副研究員，主要從事低危害煙草研究，Tel：0871-65183692，Email：lplei@yntsti.com

夏振遠(yuǎn)（1971—），Tel：0871-65106032，Email：zyxia@yntsti.com

2017-01-09；< class="emphasis_bold">網(wǎng)絡(luò)出版日期：

日期：2017-07-18

：LEI Liping,WU Yuping,MO Xiaohan,et al.Isolation and screen of TSNAs-degrading bacillus 05-5402 and its degradation characteristics[J].Acta Tabacaria Sinica,2017,23(5)

*Corresponding author.Email：zyxia@yntsti.com