賈喜婷，韋一昊，谷明鑫，石愛博，王小純,

1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450002；

2 河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 河南糧食作物協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450002

過表達(dá)TaGS1/TaGS2對煙草抗鹽能力的影響及其機(jī)制

賈喜婷1，韋一昊2，谷明鑫1，石愛博1，王小純1,2

1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450002；

2 河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 河南糧食作物協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450002

為了闡明提高谷氨酰胺合成酶（GS）活性是否可以提高煙草的耐鹽能力，本試驗(yàn)以煙草栽培品種K326為對照，研究TaGS1/TaGS2轉(zhuǎn)基因煙草抗鹽能力及其機(jī)制。結(jié)果表明，鹽脅迫條件下，過表達(dá)TaGS1/TaGS2煙草與對照相比，根系較發(fā)達(dá)，煙株生物量較高，TaGS2轉(zhuǎn)基因煙草尤為顯著；轉(zhuǎn)基因煙草的葉綠素含量、氣孔導(dǎo)度、凈光合速率、GS活性、可溶蛋白含量等碳氮代謝功能均顯著優(yōu)于野生型K326；且轉(zhuǎn)基因株系脯氨酸含量及含水量較高，MDA含量較低，葉片滲透調(diào)節(jié)能力和質(zhì)膜保護(hù)能力比K326強(qiáng)。研究表明TaGS1/TaGS2的過表達(dá)提高了煙草的耐鹽能力，其高GS活性是維持碳氮代謝抵抗鹽脅迫的生理基礎(chǔ)。

煙草；GS；轉(zhuǎn)基因；耐鹽性

鹽堿、干旱、高溫、凍害等脅迫環(huán)境是限制植物生長發(fā)育、影響作物產(chǎn)量的重要因素[1]。我國土壤鹽堿化問題很嚴(yán)重，往往由環(huán)境污染、不合理灌溉、過量施用化肥等因素引發(fā)[2-3]。煙草是重要的模式植物，也是重要的經(jīng)濟(jì)作物，提高煙草抗鹽能力是提高煙草產(chǎn)量的重要手段之一。因此，研究煙草抗鹽機(jī)制具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。

脯氨酸作為兼性溶質(zhì)和滲透保護(hù)劑，是植物細(xì)胞應(yīng)對鹽脅迫等非生物脅迫產(chǎn)生的最常見的化合物[4]。在鹽脅迫條件下，植物組織通過積累脯氨酸減輕過量氨對機(jī)體的毒害作用、清除自由基以保護(hù)質(zhì)膜的完整性、調(diào)節(jié)滲透壓防止質(zhì)膜透性變化，脯氨酸充當(dāng)植物受脅迫時(shí)有效的N、C源和還原劑，但并不干擾細(xì)胞代謝[4-7]。

植物脯氨酸的合成有兩條途徑：一條途徑是以谷氨酸（Glu）為底物，經(jīng)吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）和吡咯啉-5-羧酸還原酶（P5CR）等酶的作用合成[8]，該合成途徑存在于細(xì)胞質(zhì)和葉綠體中[4]，且該途徑中的谷氨酸主要來源于谷氨酰胺合成酶-谷氨酸合成酶（GS-GOGAT）。另一條途徑是以鳥氨酸（Orn）為底物，經(jīng)鳥氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（OAT）作用合成[9]，由于煙草和擬南芥中敲除OAT編碼基因?qū)Ω彼岷繘]有明顯影響[10]，因此，該途徑仍有爭議。在水分脅迫條件下，植物主要通過增強(qiáng)GSGOGAT循環(huán)促進(jìn)以谷氨酸為前體的脯氨酸合成途徑，積累脯氨酸以維持機(jī)體正常代謝與生長[11]。

植物谷氨酰胺合成酶具有多種同工酶，根據(jù)亞細(xì)胞定位，分為胞液型谷氨酰胺合成酶（GS1）和質(zhì)體型谷氨酰胺合成酶（GS2）[12]。GS是植物氮素同化的關(guān)鍵酶[13]，催化谷氨酸與NH4+結(jié)合產(chǎn)生谷氨酰胺，其活性與脯氨酸累積密切相關(guān)。研究表明，添加GS抑制劑，煙草脯氨酸合成受到抑制[14]。煙草GS1反義基因片段Gln1-5轉(zhuǎn)化煙草，其韌皮部GS1表達(dá)受到抑制，脯氨酸合成減弱，對鹽脅迫敏感[15]。干旱脅迫條件下，百脈根GS2突變體脯氨酸積累和復(fù)水能力都低于野生型[16]。因此，植物可能通過提高GS活性來應(yīng)對鹽脅迫和水分脅迫[17-20]

鹽脅迫引起的水分脅迫導(dǎo)致無機(jī)氮吸收受阻，進(jìn)而破壞碳、氮代謝平衡[21-22]。GS1參與衰老葉片中氮素轉(zhuǎn)移利用[23-24]，GS2參與光呼吸釋放出的氨的再同化[25]。因此，提高GS活性有利于實(shí)現(xiàn)植物氮素的再利用，從而提高植物抗鹽能力。鹽脅迫條件下，植物為維持體內(nèi)水分而關(guān)閉氣孔，導(dǎo)致細(xì)胞二氧化碳濃度減少、光合作用降低。過表達(dá)GS2可以提高水稻光合強(qiáng)度和光呼吸強(qiáng)度，增強(qiáng)水稻的抗鹽能力[26]。

本研究以煙草栽培品種K326為對照，研究了鹽脅迫條件下過表達(dá)TaGS1/TaGS2基因?qū)煵萏嫉x、脯氨酸積累、膜脂氧化以及生長發(fā)育的影響，探究過表達(dá)TaGS1/TaGS2基因?qū)煵菘果}能力的影響及其分子基礎(chǔ)，為抗鹽及干旱等非生物脅迫品種選育提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

煙草品種K326（Nicotiana tabacumL.cv.K326）、過表達(dá)TaGS1煙草株系GS1-B和GS1-6-1及過表達(dá)TaGS2基因煙草株系GS2-11和GS2-611，轉(zhuǎn)基因煙草均以K326為受體，由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 煙草幼苗的培養(yǎng)及鹽脅迫處理

T2代轉(zhuǎn)基因煙草種子及K326種子用75%酒精消毒4min，然后用6.25%次氯酸鈉處理10min，最后用相同體積的無菌水沖洗5次，將轉(zhuǎn)基因煙草種子轉(zhuǎn)入含40mg·L-1潮霉素（Hyg）的MS滅菌培養(yǎng)基中，將K326煙草種子轉(zhuǎn)入MS滅菌培養(yǎng)基中，封口后置于溫度為25℃，光照為16 h的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d。將煙草幼苗從MS培養(yǎng)基移栽到內(nèi)徑10cm，高度9cm的育苗盆中（營養(yǎng)土和蛭石以1:1.5混勻）每盆5株，培養(yǎng)兩周后，將生長一致的煙苗分栽到育苗盆中，每盆1株，繼續(xù)培養(yǎng)到10片真葉完全展開（苗齡3個(gè)月），每個(gè)株系分別選取3棵長勢均勻一致的煙草進(jìn)行鹽脅迫實(shí)驗(yàn)，每2 d用50mL 的300mmol·L-1NaCl溶液澆灌煙草，處理28 d后[27]，拍照地上部分形態(tài)，并取頂部功能葉進(jìn)行生理指標(biāo)測定。煙苗根系清洗后進(jìn)行拍照。

1.3 光合作用氣體交換參數(shù)

采用LI-6400便攜式光合儀（Li-Cor Inc.，USA）測定凈光合速率（Pn，μmol·m-2·s-1），氣孔導(dǎo)度（Gs，mmol·m-2·s-1），使用紅藍(lán)光源，葉室溫度設(shè)定為25℃，空氣相對濕度為60%，CO2濃度為400 μmol·mol-1，光照強(qiáng)度為l000 μmol·m-2·s-1。各株系隨機(jī)選取長勢一致、生長良好的煙株，測定頂部功能葉片，每隔1 h測定1次，測定5次，取其平均值。

1.4 GS同工酶活性測定

稱0.5 g煙草葉片在液氮中研磨成粉，加入1mL提取緩沖液（100mmol·L-1Tris，1mmol·L-1EDTA，1mmol·L-1MgCl2，1mmol·L-1PMFS 和 10mmol·L-1β-巰基乙醇，pH 7.6）研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入2mL離心管。于4℃，12000 rpm離心30min，取上清，即為GS酶液。粗酶液與5×上樣緩沖液（pH 7.6，25mmol·L-1Tris-HCl，5%（W/V）β-巰基乙醇，0.05%（W/V）溴酚藍(lán)，50%（V/V）甘油）混勻后上樣。利用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)（3%的濃縮膠和5%的分離膠）分離葉片可溶性蛋白，并進(jìn)行膠內(nèi)GS活性染色[28]。

1.5 葉綠素、丙二醛MDA、脯氨酸、可溶蛋白含量

參照魯燕等的方法測定葉綠素含量[29]、根據(jù)Hodges等的方法測定MDA含量[30]、參考Bates等的方法測定脯氨酸含量[31]及參照Bradford等的方法測定可溶蛋白含量[32]。

1.6 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 20.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Duncan法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)（P＜0.05），結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫下TaGS1 /TaGS2過表達(dá)對煙草表型的影響

鹽脅迫處理前，過表達(dá)TaGS1 /TaGS2煙草和K326地上部分表型沒有明顯差異（圖1A），鹽脅迫（300mmol·L-1NaCl）處理28 d后，K326葉片嚴(yán)重蜷曲變形，植株矮小且部分葉片出現(xiàn)枯死；過表達(dá)TaGS2煙草僅下部葉片失水萎蔫，上部葉片依然正常生長；過表達(dá)TaGS1煙草葉片雖表現(xiàn)失水，但明顯比野生型高大（圖1B）。過表達(dá)TaGS1 /TaGS2煙草株系根系比較發(fā)達(dá)，側(cè)根多且粗壯，GS2-11和GS2-611尤其明顯，而野生型煙草根系明顯比較弱小，側(cè)根數(shù)目較少（圖1C）。而且過表達(dá)TaGS1 /TaGS2煙草株系株高、地上及地下部干鮮重均顯著大于野生型（表1）。此外，過表達(dá)TaGS1 /TaGS2煙草含水量均高于野生型（表1）?？梢婝}脅迫下，K326失水情況嚴(yán)重，生長受到嚴(yán)重抑制；而過表達(dá)TaGS1 /TaGS2煙草株系耐鹽能力明顯強(qiáng)于K326，過表達(dá)TaGS2煙草尤為明顯。

圖1 鹽脅迫對過表達(dá)TaGS1 /TaGS2煙草和K326煙草生長的影響Fig.1 The effects of salt stress on the growth of the overexpressing TaGS1 /TaGS2 tobacco and K326

表1 鹽脅迫對煙草生物性狀的影響Tab.1 The in fluence of salt stress on tobacco biological traits

2.2 鹽脅迫下 TaGS1 /TaGS2的過表達(dá)對煙草光合特性的影響

光合作用是煙草生長發(fā)育的生理基礎(chǔ)，葉綠素是植物進(jìn)行光合作用的主要色素。長時(shí)間鹽脅迫處理導(dǎo)致葉綠素降解葉片不同程度失綠（圖1B），但轉(zhuǎn)基因株系葉綠素含量均高于野生型（圖2A）。鹽脅迫下，野生型凈光合速率為負(fù)值，而轉(zhuǎn)基因株系凈光合速率均為正值，且顯著高于野生型，過表達(dá)TaGS1煙草株系凈光合速率高于過表達(dá)TaGS2煙草（圖2B），可能是因?yàn)檗D(zhuǎn)基因株系氣孔導(dǎo)度顯著高于K326（圖2C）。鹽脅迫導(dǎo)致煙草葉片氣孔收縮，氣孔導(dǎo)度降低，CO2由外界向細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)散的阻力增加，導(dǎo)致 CO2供應(yīng)減少，光合碳固定的底物減少，從而引起凈光合速率下降。轉(zhuǎn)基因株系在鹽脅迫下仍能保持相對較高凈光合速率和氣孔導(dǎo)度，是其耐鹽的生理基礎(chǔ)。

2.3 鹽脅迫下過表達(dá)TaGS1 /TaGS2煙草對GS活性及可溶蛋白含量的影響

GS是氮素同化的關(guān)鍵酶，為蛋白質(zhì)的合成提供原料氨基酸。鹽脅迫條件下，TaGS1 /TaGS2轉(zhuǎn)基因煙草的GS活性均高于野生型K326（圖3A、B）；TaGS1 /TaGS2轉(zhuǎn)基因煙草的可溶蛋白含量也比K326高（圖3C）。可見，過表達(dá)TaGS1 /TaGS2煙草株系在鹽脅迫條件下能夠維持較高水平的氮代謝，而可溶蛋白含量高有利于維持高滲透壓，防止水分過度散失。

圖2 鹽脅迫對過表達(dá)TaGS1 /TaGS2煙草株系和K326的葉綠素含量和光合特性的影響Fig.2 The effects of salt stress on the chlorophyll content and photosynthetic characteristics of the overexpressing TaGS1 /TaGS2 tobacco and K326

圖3 鹽脅迫對過表達(dá)TaGS1 /TaGS2煙草株系和K326的GS活性及可溶蛋白含量的影響Fig.3 The effects of salt stress on the GS activity and soluble protein content of overexpressing TaGS1 /TaGS2 tobacco and K326

2.4 鹽脅迫下TaGS1 /TaGS2過表達(dá)對煙草脯氨酸積累和MDA含量的影響

在逆境條件下，植物組織脯氨酸含量是判斷其抗逆能力的重要生理指標(biāo)，丙二醛（MDA）含量是判斷膜脂質(zhì)受損程度的重要指標(biāo)。從圖4可以看出，與K326相比，過表達(dá)TaGS1 /TaGS2煙草株系有明顯較高的脯氨酸含量，尤其是GS1-B和GS2-611株系脯氨酸含量極顯著高于對照；過表達(dá)TaGS1 /TaGS2煙草株系MDA含量顯著低于對照?？梢娺^表達(dá)TaGS1/TaGS2有利于煙草積累脯氨酸，減輕膜脂質(zhì)受損，提高煙草抗鹽脅迫能力。

圖4 鹽脅迫對過表達(dá)TaGS1 /TaGS2煙草和K326脯氨酸含量和MDA含量的影響Fig.4 The effects of salt stress on the proline content and MDA content of the overexpressing TaGS1 /TaGS2 tobacco and wild type K326

3 討論

在鹽脅迫條件下，耐鹽能力強(qiáng)的植物生長情況相對較好，而耐鹽性差的植物，因碳氮代謝嚴(yán)重受阻，導(dǎo)致發(fā)育遲滯甚至死亡，因此，可以從植株外觀形態(tài)判斷其抗逆性[33]。本研究首次發(fā)現(xiàn)在鹽脅迫處理后，轉(zhuǎn)GS基因植物根系發(fā)達(dá)，營養(yǎng)和水分汲取能力較強(qiáng)，且地上部分生長比K326好，“根深葉茂”可能是其抵御鹽脅迫的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。

在干旱及鹽脅迫等逆境條件下，脯氨酸作為滲透調(diào)節(jié)劑、有效的N、C源和還原劑，能解除氨對機(jī)體的毒害及保護(hù)質(zhì)膜的完整性[4,6-7]，因此，脯氨酸累積對植物抗逆非常重要[34]。前人研究表明抑制GS酶導(dǎo)致煙葉失水加劇、丙二醛（MDA）含量增加[35]，脯氨酸含量降低[14]。本研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)TaGS1 /TaGS2煙草能顯著提高GS活性，在鹽脅迫時(shí)促進(jìn)脯氨酸積累，提高可溶性蛋白質(zhì)含量，保持較高的碳氮代謝活性；而且過表達(dá)TaGS1 /TaGS2煙草含水量高，MDA含量低，從而證明GS活性與植物耐鹽能力成正相關(guān) 。

鹽脅迫下，植物滲透壓下降，從土壤中吸收無機(jī)氮的能力減弱，葉綠素含量下降，葉片開始枯萎，GS1參與衰老葉片中氮素的再轉(zhuǎn)移，維持自身氮素再利用，保持較高的氮代謝[23]。鹽脅迫下氣孔關(guān)閉會使植物體內(nèi)用于光合作用的二氧化碳減少,影響光合作用，而過表達(dá)GS2能提高植物光呼吸能力，為光合作用提供二氧化碳，并參與同化來自光呼吸的氨，從而提高植物光合作用和抗鹽能力[26]。本研究顯示，過表達(dá)TaGS1 /TaGS2煙草在鹽脅迫下能顯著提高GS活性，促進(jìn)氮素的轉(zhuǎn)移利用，保持相對較高凈光合速率和氣孔導(dǎo)度及可溶蛋白含量，這是過表達(dá)GS煙草生長良好、抗鹽能力優(yōu)于K326的分子基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

過表達(dá)TaGS1 /TaGS2煙草根系強(qiáng)壯、GS活性高，在鹽脅迫時(shí)能促進(jìn)脯氨酸積累，提高氮素再利用及光合作用來維持正常生長，積累生物量，從而提高煙草的抗鹽能力。

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E ff ects of overexpressingTaGS1/TaGS2on tobacco salt tolerance and its mechanism

JIA Xiting1,WEI Yihao2,GU Mingxin1,SHI Aibo1,WANG Xiaochun1,2*
1 College of Life Science,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China;
2 Collaborative Innovation Center of Henan Grain Crops,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China

In order to clarify that the increase of glutamine synthetase(GS)activity can improve salt tolerance in tobacco,this paper took cultivar tobacco K326 as control and studiedTaGS1/TaGS2transgenic tobacco salt tolerance and its mechanism.Results showed that under salt stress,TaGS1/ TaGS2transgenic tobaccos,especially TaGS2 transgenic tobacco,had stronger root system and higher biomass than K326,and its ability to resist salt was superior to K326.TaGS1/TaGS2transgenic tobacco had better carbon and nitrogen metabolism with higher chlorophyll content,stomatal conductance,net photosynthetic rate,GS activity,and soluble protein content.Content of proline and water ofTaGS1/TaGS2transgenic tobaccos were higher than that of K326,while content MDA ofTaGS1/ TaGS2transgenic tobaccos were lower than that of K326.Hence TaGS transgenic tobacco had stronger leaf osmotic regulation ability and plasma membrane protection ability.It was concluded that overexpression ofTaGS1/TaGS2could improve salt tolerance in tobacco,and its higher GS activity was the physiological basis to maintain high carbon and nitrogen metabolism and resistance to salt stress.

tobacco; GS; transgene; salt tolerance

賈喜婷，韋一昊，谷明鑫，等.過表達(dá)TaGS1/TaGS2對煙草抗鹽能力的影響及其機(jī)制[J].中國煙草學(xué)報(bào)，2017,23（5）

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃支持項(xiàng)目(2016YFD0300205)；河南省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(S2010-01-G04)

賈喜婷（1992—），碩士，主要從事煙草抗逆研究，Email：xitingjia_005@163.com

王小純（1966—），教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事分子生物學(xué)研究，Email：xiaochun.w@163.com

2017-05-02；< class="emphasis_bold">網(wǎng)絡(luò)出版日期：

日期：2017-09-23

：JIA Xiting,WEI Yihao,GU Mingxin,et al.E ff ects of overexpressingTaGS1/TaGS2on tobacco salt tolerance and its mechanism[J].Acta Tabacaria Sinica,2017,23(5)

*Corresponding author.Email：xiaochun.w@163.com