楊俊鴻 代華友 黃霞 駱展鵬 彭楷 何大莉 陳政

·試劑與儀器評價·

人類嗜T淋巴細(xì)胞病毒抗體ELISA試劑盒使用期間穩(wěn)定性評價*

楊俊鴻 代華友 黃霞 駱展鵬 彭楷 何大莉 陳政

目的 對人類嗜T淋巴細(xì)胞病毒（HTLV）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒使用期間的穩(wěn)定性進(jìn)行評價，為監(jiān)測HTLV選擇檢測試劑提供部分參考。方法 采用變異系數(shù)評價4個批次檢測抗-HTLV的ELISA試劑盒室內(nèi)質(zhì)控結(jié)果的批內(nèi)、日間和批間的差異性，采用箱式圖分析批內(nèi)和日間結(jié)果出現(xiàn)極值的情況，評價試劑盒使用期間的批內(nèi)穩(wěn)定性、日間穩(wěn)定性和批間穩(wěn)定性三方面性能。結(jié)果 試劑批內(nèi)CV=6.5%，無極值出現(xiàn)；4批次試劑日間CV分別為6.8%、7.1%、8.8%和8.6%，有2個批次試劑出現(xiàn)極值，概率分別為3.2%和5.3%；批間CV=8.7%。結(jié)論 連續(xù)監(jiān)測室內(nèi)質(zhì)控批內(nèi)、批間和日間結(jié)果，能夠評價抗-HTLV酶聯(lián)免疫診斷試劑盒使用期間的批內(nèi)穩(wěn)定性、日間穩(wěn)定性和批間穩(wěn)定性三方面性能。

人類嗜T淋巴細(xì)胞病毒 酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒 穩(wěn)定性 評價

HTLV Enzyme-linked Immunosorbent Assays Kit Stability Evaluation

《血站技術(shù)操作規(guī)程》（2015版）增加了檢測“地方性、時限性”輸血相關(guān)傳染病標(biāo)志物的內(nèi)容[1]。國家衛(wèi)生計生委在2015年12月下發(fā)通知，在全國范圍內(nèi)開展無償獻(xiàn)血人群HTLV感染監(jiān)測。本中心承擔(dān)了重慶市無償獻(xiàn)血人群HTLV感染監(jiān)測任務(wù)。由于目前HTLV抗體（抗-HTLV）不屬于國家規(guī)定的血液篩查法定檢測項目，因此對國內(nèi)市場上相關(guān)的酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒還未有性能評價的報道。為此，對中心使用的4個批次檢測抗-HTLV的ELISA試劑盒室內(nèi)質(zhì)控結(jié)果進(jìn)行分析，評價試劑盒使用期內(nèi)的批內(nèi)穩(wěn)定性、日間穩(wěn)定性和批間穩(wěn)定性三方面性能。

材料與方法

1 檢測血清 2 U/ml抗-HTLV標(biāo)準(zhǔn)血清（北京康徹思坦，批號201512005）。

2 試劑與儀器 ①抗-HTLV ELISA檢測試劑盒（北京萬泰生物有限公司，批號：T20160101，T20160502，T20160503，T20160804）；②Xiril全自動加樣儀（瑞士）和BEP Ⅲ全自動酶免后處理系統(tǒng)（德國）。

3 檢測方法 標(biāo)準(zhǔn)血清和檢測試劑盒從保存冰箱取出后在18℃～25℃室溫平衡30 min。標(biāo)準(zhǔn)血清充分混勻后，按照試劑說明書參數(shù)要求，采用Xiril全自動加樣儀加樣，BEP Ⅲ全自動酶免后處理系統(tǒng)進(jìn)行檢測。根據(jù)說明書提供的公式計算每次檢測的Cut off值和S/Co值。

4 批內(nèi)穩(wěn)定性評價 在一塊酶標(biāo)板內(nèi)對一次混勻的標(biāo)準(zhǔn)血清重復(fù)進(jìn)行40孔檢測，根據(jù)檢測結(jié)果S/Co值之間的差異性評價試劑盒的批內(nèi)穩(wěn)定性。

5 日間穩(wěn)定性評價 連續(xù)收集每一批試劑使用期內(nèi)每天檢測標(biāo)準(zhǔn)血清的結(jié)果，對檢測結(jié)果進(jìn)行日間差異分析，評價試劑使用期的穩(wěn)定性。

6 批間穩(wěn)定性評價 收集4個批次試劑使用期內(nèi)檢測標(biāo)準(zhǔn)血清的結(jié)果，比較4批試劑之間的差異性，評價試劑的批間穩(wěn)定性。

7 統(tǒng)計學(xué)處理 將數(shù)據(jù)錄入Excel 2010表格，分別計算批內(nèi)數(shù)據(jù)、日間數(shù)據(jù)和批間數(shù)據(jù)的均值和標(biāo)準(zhǔn)差（S），根據(jù)均值和標(biāo)準(zhǔn)差計算變異系數(shù)（CV），以CV作為差異性評價指標(biāo)，以《血站技術(shù)操作規(guī)程》規(guī)定的精密度要求作為判斷依據(jù)。采用SPSS 19.0軟件對批內(nèi)結(jié)果和日間檢測結(jié)果以每孔S/Co值作為縱坐標(biāo)作箱式圖，S/Co值＞3倍四分位數(shù)間距的為極值[2]，分析出現(xiàn)極值的情況。

結(jié) 果

1 批內(nèi)穩(wěn)定性評價結(jié)果 同一次混勻的標(biāo)準(zhǔn)血清40孔重復(fù)檢測結(jié)果S/Co值、均值、標(biāo)準(zhǔn)差S1和變異系數(shù)CV1值見表1；批內(nèi)檢測結(jié)果S/Co值的箱式圖分析結(jié)果顯示，所有結(jié)果均在3倍四分位數(shù)間距范圍內(nèi)，未出現(xiàn)極值，見圖1。

2 日間穩(wěn)定性評價結(jié)果 統(tǒng)計4個批次試劑盒使用期內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)血清檢測結(jié)果，計算得到均值2、標(biāo)準(zhǔn)差S2和變異系數(shù)CV2值見表2；圖2顯示了4個批次試劑盒室使用期間內(nèi)質(zhì)控結(jié)果的中位數(shù)和上、下四分位數(shù)以及3倍四分位范圍，T20160101和T20160502兩個批次試劑未出現(xiàn)極值；T20160503批次試劑在第3天、第33天和第45天出現(xiàn)3個極值；T20160804在第16天和第45天出現(xiàn)2個極值。

表1 批內(nèi)穩(wěn)定性評價結(jié)果（n=40）

圖1 試劑盒批內(nèi)穩(wěn)定性箱式圖分析結(jié)果

表2 日間穩(wěn)定性評價結(jié)果

3 批間穩(wěn)定性評價結(jié)果 統(tǒng)計4個批次試劑使用期內(nèi)檢測標(biāo)準(zhǔn)血清的結(jié)果，計算總體均值=4.38，標(biāo)準(zhǔn)差S=0.38，變異系數(shù)CV=8.7%。

討 論

HTLV可以導(dǎo)致感染者出現(xiàn)成人T淋巴白血病、熱帶痙攣性下肢輕癱等疾病，該病毒主要通過母嬰傳播、性傳播和輸血傳播[3]，我國福建寧德地區(qū)無償獻(xiàn)血人群HTLV感染率達(dá)到0.34%[4]。2016年3～11月對我市30 019份無償獻(xiàn)血者的血液標(biāo)本進(jìn)行抗-HTLV監(jiān)測。試劑穩(wěn)定性作為試劑性能評價的內(nèi)容之一，對血液檢測結(jié)果非常重要，性能穩(wěn)定的檢測試劑是開展血液感染性標(biāo)志物檢測的重要基礎(chǔ)。

圖2 日間穩(wěn)定性箱式圖分析結(jié)果

本研究選用的標(biāo)準(zhǔn)血清含量為2 U/mL，采用本試劑盒檢測的S/Co值在4～5，能夠較靈敏地反映試劑盒的穩(wěn)定性[5]。采用同一批號的標(biāo)準(zhǔn)血清作為評價材料，同時對凍存的標(biāo)準(zhǔn)血清每次檢測前的復(fù)融溫度、復(fù)融時間、混勻方式和顛倒混勻次數(shù)進(jìn)行嚴(yán)格控制，可以減少材料不均一對檢測結(jié)果的影響，達(dá)到客觀評價試劑盒穩(wěn)定性的目的。

本研究除使用傳統(tǒng)的CV值判斷試劑穩(wěn)定性外，還使用了箱式圖分析判斷檢測結(jié)果中的極值，結(jié)果S/Co值＞3倍四分位數(shù)間距時判定為極值。使用CV值判斷試劑穩(wěn)定性可以對試劑的總體穩(wěn)定性做出評價[6]，箱式圖分析能夠更敏感地發(fā)現(xiàn)試劑在使用過程中出現(xiàn)的某一次檢測結(jié)果的異?，F(xiàn)象[7]。綜合兩個指標(biāo)來評價試劑盒在使用過程中的穩(wěn)定性更加科學(xué)、有效。

批內(nèi)穩(wěn)定性代表酶標(biāo)板的孔間差異[8]。本研究同一次混勻的標(biāo)準(zhǔn)血清40孔重復(fù)檢測結(jié)果S/Co值的變異系數(shù)CV=4.9%，試劑盒在對標(biāo)準(zhǔn)血清的檢測中未出現(xiàn)極值，說明被評價的試劑盒孔間差異較小，具有較好的批內(nèi)穩(wěn)定性。試劑盒日間精密度反映試劑的日間穩(wěn)定性[9]，代表試劑盒在本實驗室儲存條件和檢測條件下維持檢測性能的能力。本研究統(tǒng)計4個批次試劑盒使用期內(nèi)連續(xù)檢測同一批號標(biāo)準(zhǔn)血清的結(jié)果，4批試劑CV值均小于10%，滿足常規(guī)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。箱式圖分析結(jié)果中，T20160101和T20160502兩個批次試劑沒有出現(xiàn)極值；T20160503批次試劑在第3天、第33天和第45天出現(xiàn)3個極值，概率為3.2%；T20160804在第16天和第45天出現(xiàn)2個極值，概率為5.3%。結(jié)果說明試劑盒在本實驗室的儲存條件下能夠維持穩(wěn)定的檢測能力，具有較好的日間穩(wěn)定性。批間穩(wěn)定性反映試劑盒每批試劑之間的差異，受試劑盒原材料、制備工藝、運輸條件等因素的影響[10]。本研究統(tǒng)計4個批次試劑使用期內(nèi)檢測標(biāo)準(zhǔn)血清的結(jié)果，總體變異系數(shù)CV=8.7%，滿足批間差異小于20%的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，說明試劑盒具有較好的批間穩(wěn)定性。

血站在選擇酶免診斷試劑時應(yīng)以參考品試驗為依據(jù)，注重試劑的靈敏度、特異性和穩(wěn)定性[11，12]。本研究結(jié)果顯示，連續(xù)監(jiān)測室內(nèi)質(zhì)控批內(nèi)、批間和日間結(jié)果，能夠評價抗-HTLV酶聯(lián)免疫診斷試劑盒使用期間的批內(nèi)穩(wěn)定性、日間穩(wěn)定性和批間穩(wěn)定性三方面性能。

1 國家衛(wèi)生和計劃生育委員會，血站技術(shù)操作規(guī)程，2015.

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R373.9 R446.61

A

1671-2587（2017）05-0510-04

Evaluation of Stability of Enzyme-linked Immunosorbent Assays Kit for Anti-HTLV YANG Jun-hong，DAI Huayou，HUANG Xia，et al. Chongqing Blood Center，Chongqing 400015

【Abastract】 Objective To evaluate the stability of a enzyme-linked Immunosorbent Assays Kit for Anti-HTLV，and to provide references for choosing Anti-HTLV ELISA kits which used in blood screening. Methods Coefficient of variation was used toevaluate intra-assay variation，day-assay variation and inter-assay variation of 4 Lot Numbers. Boxtype diagram was used to analyze extreme value. Results The intra-assay variation was 6.5%，none extreme value in all intra-assay results. Coefficients of variation were 6.8%，7.1%，8.8% and 8.6，respectively. Conclusion The reagent has shown reasonably stability in intra-assay，day-assay and inter-assay，which can satisfy the requirement of blood screening kit.

10.3969/j.issn.1671-2587.2017.05.031

*本課題受重慶市衛(wèi)生計生委醫(yī)學(xué)科研計劃面上項目（No.2016MSXM109）資助

400015 重慶市血液中心

楊俊鴻（1987–），男，重慶人，檢驗師，學(xué)士，主要從事輸血安全工作，（E-mail）359846288@qq.com。

陳政，男，主管技師，主要從事輸血管理研究，（Tel）023-89887301（E-mail）973519080@qq.com。

2017-05-08）

（本文編輯：王敏）