謝 春(商丘醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南 商丘 476000)

苦參素對HeLa細胞自噬性死亡的影響

謝 春
(商丘醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南 商丘 476000)

目的探討苦參素對人宮頸癌HeLa細胞自噬的影響，初步探討其作用機制。方法不同濃度(1.0、1.5、2.0 g·L-1)的苦參素作用于HSV-2感染的人宮頸癌HeLa細胞，RFP-GFP-LC3和HPV16 DNA共轉(zhuǎn)染后12 h和36 h收集細胞，透射電子顯微鏡觀察細胞自噬活性的改變，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳以及Western Blot檢測在HeLa細胞中HSV-2感染引起自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ的變化。結(jié)果病毒感染組自噬小體明顯增多，多于對照組(P<0.05)；病毒感染組自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ明顯升高，高于對照組(P<0.05)；與對照組比較，作用72 h 后, 1.0、1.5、2.0 g·L-1苦參素組均能不同程度提高HeLa細胞的自噬活性，均可見到自噬小體的增加，其自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ蛋白表達量明顯增加(P<0.05)，HSV-2釋放滴度明顯降低(P<0.05)。結(jié)論苦參素能通過增強HeLa細胞自噬活性，減少HSV-2感染后的釋放與產(chǎn)生。

HeLa細胞；宮頸癌；苦參素；細胞自噬；單純皰疹病毒2型

單純皰疹病毒2型(herpes simplex virus 2 type, HSV-2)主要通過性接觸傳播,引起生殖器官的炎癥和皰疹。最近發(fā)現(xiàn)HSV-1和人類巨細胞病毒(human giant cell virus，HCMV)可誘導(dǎo)自噬，進一步證明病毒DNA能夠促進自噬。有研究用透射電鏡發(fā)現(xiàn)HSV感染的交感神經(jīng)和鼠成纖維細胞樣品存在大量包裹有病毒粒子的自噬泡；隨后將病毒內(nèi)部的自噬抑制蛋白缺失發(fā)現(xiàn)病毒滴度顯著下降；如果將自噬形成的控制基因沉默后，病毒滴度會顯著上升，這表明自噬可能是通過自噬泡降解病毒從而有抗感染作用。

苦參素是以苦參堿為代表的骨架結(jié)構(gòu),對苦參素提純測定和藥效作用的深入研究發(fā)現(xiàn),苦參素具有抗腫瘤、抗病毒、抗炎作用,還具有升高白細胞和Th細胞, 調(diào)節(jié)免疫等作用[1]。但關(guān)于苦參素對人宮頸癌HeLa細胞自噬活性的影響國內(nèi)外文獻報道較少。本研究通過探討不同濃度苦參素對HeLa細胞自噬活性的影響, 為苦參素治療宮頸癌提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要材料與細胞

1.1.1 主要材料 HeLa細胞株和HSV-2病毒株由鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院腫瘤病理研究室提供；苦參素(氧化苦參堿含量≥98%)購自陜西昂盛生物醫(yī)藥科技有限公司；小牛血清購自杭州四季青生物材料工程有限公司；所有實驗用試劑盒均購自美國Sigma公司。

1.1.2 細胞分組及處理方法 本研究將細胞分為HSV-2病毒感染組和空白對照組，并進一步按照苦參素的不同濃度對病毒感染組進行分組。

1.2方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及傳代 HeLa細胞于含體積分數(shù)10%的胎牛血清和100 u·mL-1青霉素及100 mg·mL-1鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基中，在37 ℃、體積分數(shù)5%CO2條件下培養(yǎng)。

1.2.2 HSV-2的CCID50滴定及感染 接種濃度為1×105·mL-1的HeLa細胞培養(yǎng)，5 d后觀察并記錄全部孔的細胞病變再根據(jù)卡波氏公式計算出病毒滴度；在攻毒實驗前測定病毒的CCID50，換算成空斑形成單位，在細胞傳代24 h后進行染毒實驗，將病毒加入培養(yǎng)基中，十字交叉搖動培養(yǎng)板混勻。

1.2.3 透射電子顯微鏡觀察細胞自噬 用普通培養(yǎng)、RFP-GFP-LC3和HPV16 DNA共轉(zhuǎn)染后12 h和36 h后收集細胞，離心，細胞沉淀，用含有質(zhì)量分數(shù)3%戊二醛的0.1 mol·L-1PBS固定2 h。用PBS清洗之后，用質(zhì)量分數(shù)1%四氧化鋨固定2 h，再用濃度梯度(50%～90%)的乙醇脫水，然后用丙酮進一步脫水，用環(huán)氧樹脂包埋，浸透過夜，聚合，超薄切片機切片，然后用乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛對超薄切片進行負染色。在透射電子顯微鏡下觀察。

1.2.4 苦參素調(diào)控自噬活性 取對數(shù)生長期的HeLa細胞, 按1×105·mL-1的濃度接種于96 孔培養(yǎng)板, 每孔總反應(yīng)體系為200 μL。實驗組分別加入不同濃度的苦參素, 使其終濃度達到工作濃度,分別為0.0、1.0、1.5、2.0 g·L-1。每個濃度組設(shè)3個復(fù)孔, 用RPMI-1640培養(yǎng)基200 μL設(shè)為調(diào)零點, 加入不含苦參素的細胞培養(yǎng)基(細胞液、培養(yǎng)基各為100 μL)為空白對照組,將各組細胞繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h；然后進行相關(guān)蛋白的測定。

1.2.5 Western Blot檢測自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳以及Western Blot檢測在HeIa細胞中HSV-2感染引起自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ的變化。

2 結(jié)果

2.1細胞自噬情況變化病毒感染組自噬小體明顯增多，多于對照組(P<0.05)。

2.2自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ的變化HeIa細胞中HSV-2病毒感染引起自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ的變化，發(fā)現(xiàn)病毒感染組自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ明顯升高，高于對照組(P<0.05)，提示HeLa細胞中出現(xiàn)自噬活性增強現(xiàn)象。

2.3苦參素對Hela細胞自噬活性的影響與空白對照組比較，作用72 h 后, 1.0、1.5、2.0 g·L-1苦參素組自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ蛋白表達量明顯增加(P<0.05)，而各濃度苦參素組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.4苦參素對Hela細胞病毒釋放表達的影響與對照組比較，作用72 h 后, 1.0、1.5、2.0 g·L-1苦參素組HSV-2釋放滴度明顯降低(P<0.05)，而各濃度苦參素組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 苦參素對HeLa細胞自噬活性和HSV-2滴度的影響

3 討論

皰疹病毒是已知感染人類病毒種類最多的一類病毒，為雙鏈DNA病毒。HSV-2主要通過性接觸傳播引起生殖器官的炎癥和皰疹。HSV-2感染機體后能否致病取決于HSV-2的毒力，即HSV-2在靶細胞的內(nèi)增殖及播散的能力。美國孕婦HSV-2感染率為35.17%，在發(fā)展中國家，HSV-2的感染率更高。該病毒與宮頸癌的發(fā)生有密切的關(guān)系。但目前尚無特效藥物控制HSV-2感染的發(fā)生和復(fù)發(fā)[2]。HSV-2具有很大的危害性，其感染已成為醫(yī)學(xué)上一個十分棘手的問題。

宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤之一, 嚴重威脅女性的生命健康。自噬是真核細胞普遍存在的生命現(xiàn)象,在自噬過程中,首先是在細胞質(zhì)內(nèi)形成雙層膜結(jié)構(gòu)包裹的成分(受損的、變性或衰老的蛋白質(zhì)以及細胞器)稱為自噬體。腫瘤細胞在放、化療過程中可活化自噬信號,作為一種存活機制介導(dǎo)獲得性耐藥而保護細胞免遭死亡[3]。最近發(fā)現(xiàn)HSV-1和HCMV可誘導(dǎo)自噬，進一步證明病毒DNA能夠促進自噬。因此,通過抑制自噬信號增強腫瘤細胞對放、化療治療的敏感性成為當前國內(nèi)外抗腫瘤治療研究的熱點之一[4]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，病毒感染組自噬小體明顯增多，說明HeLa細胞被HSV-2感染后激活其自噬活性，進行相應(yīng)的修復(fù)。

病毒內(nèi)部的自噬抑制蛋白缺失可導(dǎo)致病毒滴度顯著下降；如果將自噬形成的控制基因沉默后，病毒滴度會顯著上升，這表明自噬可能是通過自噬泡降解病毒，從而有抗感染作用。自噬過程受一系列自噬相關(guān)基因的嚴格調(diào)控[5-6]。LC3-Ⅰ在正常情況下是彌散分布在細胞漿中的，轉(zhuǎn)變?yōu)長C3-Ⅱ則特異結(jié)合在自噬泡的內(nèi)外膜上，因此LC3-Ⅱ成為檢測自噬的標志物[3-4]。本研究還發(fā)現(xiàn)病毒感染組的自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ明顯增多。

苦參堿類藥物具有抑制腫瘤增殖、誘導(dǎo)分化和凋亡、抗腫瘤浸潤和遠處轉(zhuǎn)移、抑制腫瘤新生血管形成、減輕腫瘤炎癥和抑制腫瘤耐藥性、減低化療不良反應(yīng)、增強腫瘤宿主免疫等功能[7-8]。本研究結(jié)果顯示,苦參素可以調(diào)節(jié)HeLa細胞自噬活性，不同濃度的苦參素對HeLa細胞的自噬活性改變并無明顯差異。進一步分析其病毒釋放及產(chǎn)生發(fā)現(xiàn)，與對照組比較應(yīng)用苦參素的病毒感染組其病毒滴度明顯降低。

綜上所述,苦參素可能通過調(diào)控HeLa細胞的自噬活性，抑制被感染HSV-2的HeLa細胞釋放與產(chǎn)生病毒，降低病毒滴度?？鄥⑺赜型蔀橹委煂m頸癌的一種藥物,但具體機制仍需進一步深入研究。

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ImpactofSophoraontheAutophagyofHeLaCells

XIE Chun
(ShangqiuMedicalCollege，Shangqiu476000，China)

ObjectiveTo explore the impact of sophora on human cervical cancer HeLa cell autophagy and to explore its action mechanism.MethodsDifferent concentrations (1.0, 1.5, 2.0 g·L-1) of sophora was used for human cervical cancer HeLa cells after HSV-2 infection, The cells were collected in a total of 12 hours and 36 hours after RFP-GFP-LC3 and HPV16 DNA transfection, the autophagy activity change was observed by using transmission electron microscopy, SDS polyacrylamide gel electrophoresis and Western Blot detection were used to detect the autophagy related protein LC3-Ⅱ changes in the HeLa cells after HSV-2 infection.ResultsThe autophagosome was obviously increased in the virus infection group, compared with the control group (P<0.05); the autophagy related proteins LC3-Ⅱ content was increased significantly in the virus infection group, compared with the control group (P<0.05).After 48 hours and 72 hours, compared with the control group, 1.0, 1.5, 2.0 g·L-1of sophora could improve the autophagy activity of HeLa cells (P<0.05); the autophagosome was significant increased (P<0.05); the autophagy related protein LC3-Ⅱ was significantly increased (P<0.05), the HSV-2 release drop degree was decreased obviously (P<0.05).ConclusionSophora can improve the autophagy activity of HeLa cells, reduce the release of HSV-2 after virus infection.

HeLa cells; cervical cancer; sophora; cellautophagy; herpes simplex virus 2 type

商丘市科技攻關(guān)項目(編號：153060)

謝春(1974-)，女，副教授，主要從事微生物與免疫研究。E-mail：674434085@qq.com

10.3969/j.issn.1673-5412.2017.05.001

R737.33;R730.23

A

1673-5412(2017)05-0369-03

2017-01-23)