羅科學(xué)　王欽賢　陳富興

[摘要] 目的 調(diào)查長(zhǎng)期夜班工作醫(yī)務(wù)人員腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化，探討腸道菌群與長(zhǎng)期夜班工作所致慢性疾病的關(guān)系。方法 采集30例有5年以上夜班工作經(jīng)歷的醫(yī)務(wù)人員（試驗(yàn)組）及30例非夜班工作的健康志愿者（健康對(duì)照組）的糞便，利用熒光定量PCR方法定量分析兩組人群腸道主要菌群結(jié)構(gòu)的變化。 結(jié)果 試驗(yàn)組與健康對(duì)照組相比，長(zhǎng)期夜班工作的醫(yī)護(hù)人員的擬桿菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌含量均有下降，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。而腸球菌和腸桿菌則較健康對(duì)照組有所升高，其中腸球菌組間比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），腸桿菌組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論 長(zhǎng)期夜班工作醫(yī)務(wù)人員腸道內(nèi)益生菌擬桿菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌減少，條件致病菌腸球菌和腸桿菌增多，存在較明顯的腸道菌群結(jié)構(gòu)失調(diào)。

[關(guān)鍵詞] 長(zhǎng)期夜班工作醫(yī)務(wù)人員；腸道菌群；熒光定量PCR；調(diào)查

[中圖分類號(hào)] R378 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701（2017）28-0126-04

[Abstract] Objective To investigate the changes of intestinal flora structure in medical staff taking long-term night shift， and to explore the relationship between intestinal flora and chronic diseases caused by long-term night work. Methods Faeces of 30 cases of medical personnel with more than 5 years working experience of night work（experimental group） and 30 healthy volunteers who had no night work（healthy control group） were collected. Fluorescence quantitative PCR method was used to quantitatively analyze the changes of main intestinal flora structure in the two groups. Results Compared with the healthy control group， the contents of Bacteroides， Bifidobacterium and Lactobacillus in the medical staff taking long-term night shift were all decreased in the experimental group. There were statistically significant differences between the two groups（P<0.01）. The contents of Enterococcus and Enterobacteriaceae were higher than those in the healthy control group， and there was significant difference in Enterococcus between two groups（P<0.01）. The difference in Enterobacteriaceae was significant between two groups（P<0.05）. Conclusion The contents of intestinal probiotics such as Bacteroides， Bifidobacterium and Lactobacillus are decreased in the medical staff taking long-term night shift， while the conditioned pathogens such as Enterococcus and Enterobacteria are increased. There are more significant intestinal flora structural disorders.

[Key words] Medical staff taking long-term night shift； Intestinal microflora； Fluorescence quantitative PCR； Investigation

醫(yī)務(wù)工作者工作繁忙，工作節(jié)奏快，職業(yè)壓力大，會(huì)影響到本身的心身健康。尤其是長(zhǎng)期夜班工作的醫(yī)護(hù)人員，長(zhǎng)期的睡眠-覺醒周期不規(guī)律，缺乏運(yùn)動(dòng)，飲食不規(guī)律，以及經(jīng)常面對(duì)夜班突發(fā)應(yīng)激事件，不但會(huì)引起職業(yè)倦怠，導(dǎo)致亞健康狀態(tài)，使醫(yī)療工作效率下降，甚至?xí)霈F(xiàn)醫(yī)療差錯(cuò)。而且也會(huì)導(dǎo)致疲勞綜合征、肥胖、高血壓、慢性胃炎、抑郁癥等疾病[1]。

腸道菌群參與人體的消化、營養(yǎng)物質(zhì)的吸收、能量的供應(yīng)、脂肪代謝、免疫調(diào)節(jié)等諸多環(huán)節(jié)，不管是在健康狀態(tài)還是在疾病狀態(tài)下的人體代謝過程均會(huì)受腸道菌群的影響[2-3]。長(zhǎng)期夜班工作有可能會(huì)導(dǎo)致腸道菌群的變化，而這種變化可能是導(dǎo)致亞健康狀態(tài)和相關(guān)慢性疾病產(chǎn)生的關(guān)鍵因素。因此，研究夜班工作醫(yī)務(wù)人員腸道菌群的變化，不但對(duì)相關(guān)慢性疾病有預(yù)防意義，同時(shí)可以進(jìn)一步針對(duì)腸道菌群為靶點(diǎn)進(jìn)行治療。然而專門針對(duì)醫(yī)護(hù)人員腸道菌群變化的研究較少，單純細(xì)菌培養(yǎng)方法有很大局限性，已有研究顯示腸道菌群結(jié)構(gòu)失調(diào)是在“種屬”的水平發(fā)生的，因此，必須用不同種屬的細(xì)菌比例研究腸道菌群結(jié)構(gòu)變化[4]。本文利用熒光定量PCR方法通過研究5年以上夜班工作經(jīng)歷醫(yī)務(wù)人員的腸道菌群變化，比較其與健康人群腸道菌群的差異。endprint

1 資料與方法

1.1一般資料

選取我院工作的醫(yī)護(hù)工作者，納入及排除標(biāo)準(zhǔn)：①年齡20～50歲之間；②1周內(nèi)需輪值夜班1次，連續(xù)5年以上；③排除既往有心臟病、肝臟、腎臟等重要器官以及內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病者；④排除消化系統(tǒng)疾病病史，未進(jìn)行過胃腸道手術(shù)，1個(gè)月內(nèi)無急性腹瀉癥狀的急性腸傳染??；⑤前3個(gè)月內(nèi)未使用各種抗生素，1個(gè)月內(nèi)未服用腸道益生菌、質(zhì)子泵抑制劑、膠體鉍劑。最終入選30例為試驗(yàn)組。并隨機(jī)選取沒有輪值夜班的符合上述①、③、④、⑤條件的健康志愿者30例為健康對(duì)照組。其中試驗(yàn)組平均年齡（36.0±5.2）歲，健康對(duì)照組平均年齡（36.0±7.2）歲，男女比例均為1∶1，兩組年齡、性別等一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本的收集 采集試驗(yàn)組和健康對(duì)照組成員糞便樣品，樣品均用無菌容器收集，置于干冰上，30 min內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室，-80℃凍存。

1.2.2 糞便DNA提取 ①標(biāo)本于常溫下融凍，取0.2 g大便，加1 mL磷酸鹽緩沖液（PBS），0.05 mol/L，pH7.4，充分混勻5 min；②1000 rpm離心10 min，取上清液，按上述方法重復(fù)3次；③收集全部上清液14000 rpm離心10 min后，棄上清留取沉渣；④加1 mL PBS混勻沉渣，14000 r/min離心15 s，棄上清；反復(fù)用PBS洗滌4次。⑤DNA的純化：將上述菌體液14000 r/min離心15 s后，取200 μL上清，為分離出的細(xì)菌。⑥取200 μL DNA提取A液于0.5 mL離心管中，每管分別加入待檢細(xì)菌液50 μL，顛倒數(shù)次充分混勻，室溫靜置3 min。⑦加入250 μL DNA提取B液，顛倒數(shù)次充分混勻。⑧13000 rpm離心10 min，取上清。⑨加入200 μL DNA提取C液，顛倒數(shù)次混勻。⑩13000 rpm離心5 min，吸棄上清，室溫或55℃放置2～5 min晾干。加入20 μL樣品稀釋液混懸沉淀物，短暫離心使液體落于管底，取上清行PCR。

1.2.3 引物的設(shè)計(jì)合成 PCR特異擴(kuò)增引物片段長(zhǎng)度和序列見表1。

1.2.4 熒光定量PCR ①陽性標(biāo)準(zhǔn)品及其梯度的制備：（標(biāo)準(zhǔn)曲線定量法）；②陽性標(biāo)準(zhǔn)品的制備：預(yù)實(shí)驗(yàn)PCR擴(kuò)增的陽性產(chǎn)物經(jīng)過2%低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳（含溴化乙胺啶，用TAE緩沖液配制），在長(zhǎng)波紫外燈下，割下目的條帶。用回收試劑盒（QIA quick CEL Extraction KIT）回收純化，克隆。提取陽性克隆質(zhì)粒，即為陽性標(biāo)準(zhǔn)品。③陽性標(biāo)品梯度的制備：取陽性標(biāo)準(zhǔn)品50 μL按10倍稀釋（加水45 μL并充分混勻），依次稀釋下去，制備成陽性定量標(biāo)準(zhǔn)品梯度，倍比稀釋一定要準(zhǔn)確，否則影響定量結(jié)果。每次上機(jī)必須新鮮配置陽性定量標(biāo)準(zhǔn)品梯度，正式上機(jī)時(shí)以包含所有樣本的4個(gè)梯度上機(jī)即可。④反應(yīng)體系及反應(yīng)條件。采用iQTMSYBR Green supermix（Bio-Rad，USA）配置定量PCR反應(yīng)體系，25 μL總體積含2×Supermix 12.5 μL和上下游引物（12.5 μmol）各1 μL。⑤待測(cè)樣本Ct值均落在標(biāo)準(zhǔn)曲線上，通過各Ct值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上所對(duì)應(yīng)的拷貝數(shù)得到待測(cè)樣本拷貝數(shù)。因按照試劑盒提取說明0.2 g糞便組織共提取200 μL基因組，檢測(cè)前待測(cè)樣本按不同倍數(shù)稀釋到同一濃度，最后結(jié)果需乘以總稀釋倍數(shù)，計(jì)算出每克糞便的細(xì)菌拷貝數(shù)，單位換算成1 g copies/g濕便，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用（x±s）表示，非正態(tài)分布參數(shù)經(jīng)自然對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多重組間比較采用單因素方差分析方法，組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)，組內(nèi)治療前后比較采用配對(duì)設(shè)計(jì)t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)相關(guān)分析采用Pearson直線相關(guān)性分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，試驗(yàn)組與健康對(duì)照組比較，長(zhǎng)期夜班工作的醫(yī)護(hù)人員的擬桿菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌含量均有下降，三者組間比較差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。而腸球菌和腸桿菌則較健康對(duì)照組有所升高，其中腸球菌組間比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），腸桿菌組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期夜班工作醫(yī)務(wù)人員的腸道菌群結(jié)構(gòu)與健康對(duì)照組相比發(fā)生了明顯的變化，其中擬桿菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌含量均有下降；而腸球菌和腸桿菌則比健康對(duì)照組數(shù)量有增高。

擬桿菌是腸道中最主要的厭氧菌。有研究發(fā)現(xiàn)，其在幫助宿主分解多糖、促進(jìn)腸黏膜的血管再生和免疫系統(tǒng)的發(fā)育方面有重要作用，有利于維持腸道微生態(tài)的平衡[5]；研究發(fā)現(xiàn)擬桿菌屬中有多種細(xì)菌對(duì)腸黏膜抵抗力有益[6]。擬桿菌門/厚壁菌門這一比值與血糖濃度和肥胖呈正相關(guān)[7-8]。

雙歧桿菌能夠粘附于腸上皮細(xì)胞表面，可以防止病原菌或條件致病菌的定植[9]；作為免疫原可誘導(dǎo)增強(qiáng)機(jī)體的各種免疫功能，從而增強(qiáng)機(jī)體免疫功能[10]；可使膽固醇轉(zhuǎn)化為人體無法吸收的糞甾醇，隨糞便排出體外，因而可以起到降血酯作用[11]；有研究者通過對(duì)高脂膳食喂養(yǎng)的小鼠飼喂寡果糖益生元來改善腸道內(nèi)雙歧桿菌的含量，發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌可以改善糖耐量、降低內(nèi)毒素血癥、減少細(xì)菌移位，使低濃度炎癥好轉(zhuǎn)[12-13]。

乳酸桿菌可促進(jìn)腸道黏蛋白分泌，抑制大腸桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌等有害菌對(duì)黏液、腸上皮細(xì)胞的粘附，對(duì)維護(hù)、穩(wěn)定腸黏液層屏障功能有重要作用[14]?？梢种朴泻姆敝常瑢?duì)胃腸道的感染具有預(yù)防與治療作用[15]；能激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，特別是巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞（NK）細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞；乳酸菌還具有降低血清膽固醇等作用[16]。上述三種細(xì)菌是有益菌，能夠幫助消化、維持腸道屏障、降血脂、增強(qiáng)免疫功能等，其數(shù)量在長(zhǎng)期夜班工作醫(yī)務(wù)人員的腸道較健康人下降，說明長(zhǎng)時(shí)間頻繁的夜班工作已經(jīng)使腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，使機(jī)體更容易出現(xiàn)腸功能紊亂、高血脂、免疫異常等疾病。endprint

本研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期夜班工作醫(yī)務(wù)人員腸球菌和腸桿菌較健康對(duì)照組有所升高。腸桿菌和腸球菌是人體內(nèi)常駐菌群，正常生理狀態(tài)下不引起疾病，但在一定條件下可導(dǎo)致感染。有研究顯示，腸桿菌細(xì)胞壁可產(chǎn)生LPS，導(dǎo)致脂多糖LPS釋放增加，當(dāng)腸道黏膜屏障功能受損時(shí)，LPS通過腸道屏障吸收入血，易導(dǎo)致內(nèi)毒素血癥，刺激大量炎性因子產(chǎn)生，這些炎性因子參與維持機(jī)體的長(zhǎng)期慢性低度炎性反應(yīng)狀態(tài)[17]；也有研究發(fā)現(xiàn)腸球菌屬與脂代謝水平相關(guān)，腸球菌屬和腸球菌屬占總細(xì)菌的比例與甘油三酯水平呈顯著正相關(guān)關(guān)系，其比例與高密度脂蛋白呈顯著負(fù)相關(guān)[18]。兩種是條件致病菌，其數(shù)量的增加，會(huì)增加腸道的通透性，容易導(dǎo)致慢性低度的炎癥反應(yīng)狀態(tài)，出現(xiàn)胰島素抵抗，從而使長(zhǎng)期頻繁的夜班工作的醫(yī)務(wù)人員更容易出現(xiàn)肥胖、高血壓、冠心病等一系列的代謝紊亂性疾病。

近幾年，腸道菌群對(duì)人體健康的重要性隨著研究的不斷深入已逐漸顯現(xiàn)出來，人類的腸道內(nèi)定值的腸道菌群共約500～1000個(gè)不同的種屬，其細(xì)胞總量超過1000萬億[19]。腸道菌群是與人體共生、相互影響的復(fù)雜系統(tǒng)，幾乎是一個(gè)被遺忘的器官[20]。許多研究表明[21]，腸道菌群失調(diào)不僅會(huì)導(dǎo)致多種胃腸道疾病，如幽門螺桿菌感染、腹瀉、便秘、炎癥性腸病等，同時(shí)還會(huì)誘發(fā)肥胖、糖尿病、代謝綜合征、心血管疾病和過敏疾病等。因此，可以通過調(diào)節(jié)腸道菌群預(yù)防疾病，促進(jìn)健康，改善癥狀，縮短病程。

研究發(fā)現(xiàn)和事實(shí)證明頻繁的夜班，工作量大，長(zhǎng)期在高風(fēng)險(xiǎn)、高壓力下超負(fù)荷、快節(jié)奏的工作，使機(jī)體經(jīng)常處于應(yīng)激狀態(tài)。應(yīng)激狀態(tài)下機(jī)體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生內(nèi)分泌、神經(jīng)生化及免疫功能的變化，長(zhǎng)期的影響會(huì)導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)環(huán)境失衡，出現(xiàn)多系統(tǒng)的功能障礙，進(jìn)一步產(chǎn)生焦慮、抑郁情緒異常[22]。同時(shí)根據(jù)微生態(tài)原理，每一個(gè)人腸道微生態(tài)菌群的形成和結(jié)構(gòu)與其飲食結(jié)構(gòu)和生存環(huán)境密切相關(guān)[23]。醫(yī)務(wù)人員長(zhǎng)時(shí)間在細(xì)菌、病毒高濃度的環(huán)境中工作，也可能引發(fā)腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法從種屬的水平、定量的角度檢測(cè)長(zhǎng)期夜班工作醫(yī)務(wù)人員和非夜班健康人腸道菌群的異常，證實(shí)長(zhǎng)期夜班工作醫(yī)護(hù)人員的腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著地變化，存在失調(diào)情況。這種腸道菌群結(jié)構(gòu)的失調(diào)可能是導(dǎo)致亞健康狀態(tài)、疲勞綜合征、肥胖、代謝紊亂和抑郁癥等一系列疾病的早期病理生理基礎(chǔ)。在臨床治療中，也可以利用微生態(tài)試劑靶向調(diào)控腸道菌群結(jié)構(gòu)，并通過改善腸道菌群結(jié)構(gòu)改善亞健康狀態(tài)及導(dǎo)致的多種疾病。

目前，對(duì)腸道菌群的研究多聚焦于某種特定的疾病，只是針對(duì)長(zhǎng)期夜班工作容易導(dǎo)致的幾種疾病有相關(guān)研究。如對(duì)于肥胖和代謝綜合征，諸多研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群是連接飲食結(jié)構(gòu)異常到肥胖和代謝綜合征發(fā)生的重要橋梁，其基本機(jī)制：影響合成脂肪的基因，導(dǎo)致脂肪過度積累[24]；破壞腸屏障，腸道通透性增加，引發(fā)代謝性內(nèi)毒素血癥，從而引發(fā)宿主全身的低度、系統(tǒng)性的慢性炎癥，誘發(fā)胰島素抵抗，進(jìn)而導(dǎo)致肥胖、代謝綜合征等疾病[25]。關(guān)于慢性疲勞綜合征，研究發(fā)現(xiàn)，與健康人相比，慢性疲勞綜合征患者腸道菌群發(fā)生了改變，包括雙歧桿菌和大腸桿菌的數(shù)量減少，糞鏈球菌則大量增加，部分患者表現(xiàn)有Lactonifactor和Alistipes增多[26]。本研究關(guān)于腸道菌群的研究突破了僅僅圍繞某種疾病的固有范疇，針對(duì)某個(gè)特定的職業(yè)的特定人群，不但拓展了腸道菌群研究的對(duì)象，而且也為更多的職業(yè)病及地方病研究提供了一種新的思路和方法。

盡管本研究顯示長(zhǎng)期夜班工作醫(yī)護(hù)人員的腸道菌群較健康人發(fā)生了變化，揭示了長(zhǎng)期夜班工作所導(dǎo)致的慢性疾病與腸道菌群之間有密切的聯(lián)系，但對(duì)于兩者之間的因果關(guān)系和具體機(jī)制，仍有眾多不確定之處。而且，本研究所用的熒光定量PCR方法，只能檢測(cè)到腸道中的優(yōu)勢(shì)菌，下一步可應(yīng)用更先進(jìn)的高通量測(cè)序的方法進(jìn)行研究，期望能更全面地檢測(cè)腸道中的完整菌群。

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（收稿日期：2017-02-23）endprint