堯人山國家森林公園蟲生真菌資源初步調(diào)查

周家喜+鄒曉+周葉鳴

摘要：于2015年9月對貴州省堯人山國家森林公園蟲生真菌資源進行初步調(diào)查，共采集16個標本，基于ITS1-5.8S-ITS2 rDNA 基因序列，對采集標本分離菌株進行培養(yǎng)鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，標本分屬3科7屬10種，主要有白僵菌屬、棒束孢屬、蠟蚧菌屬、線性蟲草屬、被毛包屬、多頭霉屬、枝穗霉屬，其中白僵菌屬為優(yōu)勢屬，寄主以鱗翅目昆蟲為主。調(diào)查結(jié)果為該地區(qū)蟲生真菌資源的分布、多樣性和利用提供了參考。

關(guān)鍵詞：蟲生真菌；資源調(diào)查；分類鑒定；堯人山國家森林公園；寄主；多樣性；標本統(tǒng)計；分子鑒定

中圖分類號： Q-9 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）18-0244-05

收稿日期：2016-04-21

基金項目：國家自然科學基金（編號：31360031）；國家自然科學基金重大項目（編號：31093440）；貴州省農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)項目（編號：黔科合NY[2013]3034）。

作者簡介：周家喜（1990—），男，云南保山人，碩士研究生，主要從事微生物生態(tài)學研究。E-mail：1552047449@qq.com。

通信作者：鄒 曉，博士，教授，主要從事真菌資源與利用及生態(tài)學研究。E-mail：coprinus@126.com。 蟲生真菌指一類能寄生在寄主體內(nèi)和體表的真菌，包括引起寄主致死的昆蟲病原真菌如白僵菌，專性寄生昆蟲體表降低寄主活力的蟲寄生菌如蟲囊菌，與各種昆蟲共生的共生菌如多毛菌[1]，寄生在線蟲、變形蟲、輪蟲等小動物上的捕食性真菌如捕食線蟲性真菌Duddingtonia flagran[2]。蟲生真菌寄主范圍較廣，除多種昆蟲外，還包括蜘蛛、螨類、線蟲、輪蟲、蜈蚣等多種動物[3]。

自然界中蟲生真菌資源極為豐富，廣泛分布于壺菌門、子囊菌門、接合菌門、擔子菌門、半知菌門等各個亞門中[4]。據(jù)不完全統(tǒng)計，目前世界上報道的蟲生真菌約有100多個屬800多種[2]。我國蟲生真菌資源也很豐富，已發(fā)現(xiàn)記載的昆蟲病原真菌涉及40多個屬400多種[5]，其中捕食和寄生線蟲真菌140種，蟲草屬真菌120種[6-7]。蟲生真菌與人類生活關(guān)系密切，涉及食用、藥用、生防等多個方面。在古代，我國就曾有食用白僵蠶、冬蟲夏草、蟬花等蟲生真菌的記載[8]。研究發(fā)現(xiàn)，部分蟲生真菌（蛹蟲草、冬蟲夏草、蟬花等）具有強腎、潤肺、通精氣及抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗疲勞、抗衰老、降血脂血糖、提高人體免疫力等藥用功效[9-10]。由于蟲生真菌種類多、安全有效、容易大量生產(chǎn)，所以在害蟲防治、植物病害、雜草防治等生物防治方面可發(fā)揮重要作用[11]，常見的真菌殺蟲劑有球孢白僵菌[12]、金龜子綠僵菌[13]、玫煙色擬青霉[14]、蠟蚧輪枝菌[15]、湯普生被毛孢[16]等。此外，蟲生真菌還含有蟲草多糖、蟲草酸、腺苷等多種活性成分，在醫(yī)藥保健品、化妝品及其他領(lǐng)域用品的開發(fā)應(yīng)用上具有很大潛力[17]。但由于蟲生真菌分布十分廣泛，不同生境條件下分離獲得的同一種類的菌株間在數(shù)量和致病性上存在顯著差異[18]。實踐中，多數(shù)蟲生真菌的產(chǎn)孢量、生長速度、活性產(chǎn)物的產(chǎn)生、毒力等方面存在差異，而且存在退化比較嚴重的現(xiàn)象[11]。因此，開展蟲生真菌種類資源及分布研究，對發(fā)現(xiàn)新資源、開發(fā)新的生物制品及篩選高效生防菌具有十分重要的理論意義和應(yīng)用價值。

堯人山國家森林公園位于貴州省黔南布依族苗族自治州三都水族自治縣都柳江畔（107°53′～107°58′E、24°54′～25°59′N），海拔560～1 365 m，總面積5 718.5 hm2；公園內(nèi)群山連綿，峰巒疊嶂，堪稱“水鄉(xiāng)綠海，黔南明珠”；氣候溫和濕潤，屬中亞熱帶季風氣候，年平均溫度為18 ℃，年降水量為 1 349.5 mm[19]。該區(qū)森林資源豐富，約有5/6的面積尚處于原始森林狀態(tài)，森林覆蓋率達90.87%，素有“百里林?！敝Q；園內(nèi)生態(tài)環(huán)境穩(wěn)定，林深樹密，樹種繁多，動物資源豐富，是野生動物的樂園[20]。公園特殊的生態(tài)環(huán)境和優(yōu)越的氣候條件，蘊藏著豐富的蟲生真菌資源；豐富多樣的植被，溫暖濕潤的氣候，為昆蟲、蜘蛛、螨等節(jié)肢動物的生長、繁衍提供了場所和適宜的環(huán)境；濕暖的氣候、茂密的植被和豐富的動物區(qū)系，為病原菌的流行提供了良好的條件。

筆者所在課題組于2015年9月對貴州省黔南布依族苗族自治州三都水族自治縣堯人山國家森林公園蟲生真菌資源進行初步調(diào)查，并根據(jù)ITS1-5.8S-ITS2系統(tǒng)發(fā)育及寄主分布分析其多樣性，以期豐富當?shù)氐纳镔Y源，為當?shù)叵x生真菌資源的開發(fā)利用和合理保護提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯20 g切塊煮沸，過濾取液，葡萄糖 20 g，瓊脂18 g，補水至1 L，121 ℃滅菌30 min。

1.2 調(diào)查方法

根據(jù)堯人山國家森林公園面積廣、森林植被覆蓋面大且受人為干擾程度低、山勢陡峻、溝谷交錯、水熱充沛的特點，采用定點調(diào)查、沿路踏查、普查等方式，詳細采集地表層、枯枝落葉及灌木叢中的蟲生真菌，并在采集中記錄蟲生真菌生長環(huán)境情況和罹病個體數(shù)。

1.3 標本分離、鑒定

1.3.1 標本分離 先用自來水將標本蟲體表面沖洗干凈，再用無菌水沖洗標本3次，接著用75%乙醇表面消毒5 s。掰斷蟲體部分，用已滅菌的接種針挑取蟲體斷面組織塊，接種到加有抗生素的PDA平板上，16 ℃培養(yǎng)30 d。挑取已分離得到的純菌落接種于PDA試管斜面中進行保存。

1.3.2 DNA提取、擴增、測序 用接種針從PDA平板上挑取菌絲體，根據(jù)OMEGA試劑盒方法提取總DNA，并于-20 ℃保存。選用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS2（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）[21]擴增ITS區(qū)的rRNA。反應(yīng)體系25 μL：master mix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，引物ITS1和ITS2均為1.0 μL，DNA模板2.0 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，50 ℃退火 1 min，72 ℃延伸1 min，循環(huán)35次；最后72 ℃延伸 10 min，擴增產(chǎn)物送往上海的美國英杰生命技術(shù)有限公司純化測序并獲取序列。endprint

1.3.3 分子鑒定 將得到的ITS序列提交GenBank的Blast程序進行比對，下載相似性大于93%的序列及其相關(guān)近緣屬菌株的ITS序列，首先用MEGA 5.2對序列進行比對剪切，然后通過最大似然法（ML），運行1 000次Bootstrap驗證，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[22]。

1.4 寄主多樣性分析

將采集到的罹病個體按寄主屬性進行分類整理，根據(jù)寄主的豐富度及種類分析蟲生真菌的多樣性及分布情況。

1.5 多樣性指數(shù)分析

采用辛普森指數(shù)（Simpson）、香農(nóng)-威納指數(shù)（Shannon-Wiener）及均勻度指數(shù)（Pielou）研究分析堯人山國家森林公園蟲生真菌的多樣性[23]。

Simpson指數(shù)：D=1-∑Pi2。

式中：Pi為種的個體數(shù)占群落中總個體數(shù)的比例，Pi=ni/N，ni為第i種的個體數(shù)，N為所有種的個體數(shù)。

Shannon-wiener指數(shù)：H′=-∑PilnPi；

Pielou均勻度指數(shù)：E=H′/Hmax。

式中：H′為實際觀察的物種多樣性指數(shù)；Hmax為最大的物種多樣性指數(shù)，Hmax=lnS，S為群落中的總物種數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蟲生真菌標本統(tǒng)計

本次調(diào)查共采集到蟲生真菌罹病個體16個（圖1），并獲得其分離菌株16株，詳細信息見表1。

2.2 蟲生真菌初步鑒定

對于采集的標本，通過形態(tài)學比較，初步鑒定全為肉座菌目真菌，分屬3科7屬10種（表2、表3）。數(shù)量最多的一科為蟲草菌科，占總數(shù)的62.50%，包括棒束孢屬2種、蠟蚧菌屬1種、白僵菌屬2種；其次是線性蟲草菌科，占總數(shù)的31.25%，包括被毛孢屬1種、多頭霉屬1種、線性蟲草屬2種；最少的一科為生赤殼科，占總數(shù)的6.25%，只有枝穗霉屬1種。若以樣本數(shù)超過4為優(yōu)勢屬，那么該地區(qū)蟲生真菌優(yōu)勢屬為白僵菌屬，占總數(shù)的31.25%，主要為球孢白僵菌；其次是棒束孢屬，約占25.00%，主要有細腳棒束孢和環(huán)鏈棒束孢。

2.3 蟲生真菌分子鑒定

在蟲生真菌分離菌株DNA構(gòu)建的ITS1-5.8S-ITS2系統(tǒng)發(fā)育樹中，所有試用序列明顯分為7個不同分支，分別是棒束孢類、蠟蚧菌類、白僵菌類、被毛孢類、多頭霉類、枝穗霉類、線性蟲草類。菌株GZUIFR-SD03、GZUIFR-SD05、GZUIFR-SD06、GZUIFR-SD08、GZUIFR-SD13與球孢白僵菌（JX110371、HQ444271、KM249039、KT280276）和布氏白僵菌（LN886699）聚在白僵菌屬分支中。菌株GZUIFR-SD01、GZUIFR-SD02、GZUIFR-SD04、GZUIFR-SD09與細腳棒束孢（GU194179）、環(huán)鏈棒束孢（JQ425656）等聚在棒束孢屬分支中。菌株GZUIFR-SD15與刀孢蠟蚧菌（EU918702）、絲枝蠟蚧霉（JX241644）等聚在蠟蚧菌屬分支中。菌株GZUIFR-SD11與中國多頭霉（NR119928）、P. tomentosus（KF049666）等聚在多頭霉屬分支中。菌株GZUIFR-SD07與瘤狀被毛孢（EF194146）、鹿兒島被毛孢（KM652172）等一起聚在被毛孢屬分支中。菌株GZUIFR-SD10與粉紅粘帚霉（KT387608）、羅杰斯無性穗霉（KC806290）等聚在枝穗霉屬分支中。菌株GZUIFR-SD14與蟻窩線蟲草（AB222679）聚在一起，菌株GZUIFR-SD12和GZUIFR-SD16與蜂頭線蟲草（JN943351）聚在一起，均屬于線性蟲草屬分支。該結(jié)果與初步形態(tài)鑒定結(jié)果一致，從分子水平表明堯人山國家森林公園蟲生真菌種類豐富（圖2）。

2.4 蟲生真菌寄主多樣性分析

根據(jù)本次調(diào)查結(jié)果可知，該區(qū)蟲生真菌寄主種類多、范圍廣（表4）。如圖3所示，包括鱗翅目、膜翅目、同翅目、鞘翅目、雙翅目等昆蟲及蜘蛛等多種動物。其中，鱗翅目昆蟲最多，占37.50%，主要有鱗翅目幼蟲和蛹、毛蟲、刺蛾幼蟲等；其次是膜翅目和同翅目，均占18.75%，膜翅目主要包括蜂和螞蟻等，同翅目包括蟬和蝽；寄主為蜘蛛的占12.50%；最少的為鞘翅目和雙翅目，各占6.25%，發(fā)現(xiàn)的鞘翅目主要為瓢

蟲，雙翅目主要是蒼蠅。結(jié)果表明，堯人山國家森林公園蟲生真菌資源豐富，廣泛分布于昆蟲、蜘蛛等多種節(jié)肢動物上。

2.5 多樣性分析

從表4中可以看出，堯人山蟲生真菌群落多樣性偏低（D=0.79，H′=1.84），均勻度較高（E=0.95）。寄主多樣性同樣偏低（D=0.77，H′=1.61），均勻指數(shù)較真菌群落均勻指數(shù)低（E=0.88）。

3 結(jié)論與討論

堯人山國家森林公園蟲生真菌資源豐富多樣，分布廣泛，初步調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)包括3科8屬10種，分別是蟲草菌科（棒束孢屬、白僵菌屬、蠟蚧菌屬）、線性蟲草菌科（多頭霉屬、被毛孢屬、線性蟲草屬）、生赤殼科（枝穗霉屬）。其中，白僵菌屬為優(yōu)勢屬，球孢白僵菌為主要種群。

關(guān)于貴州地區(qū)蟲生真菌資源調(diào)查已有報道，該地區(qū)的蟲生真菌種類十分豐富，蟲草屬為優(yōu)勢屬，但在本次調(diào)查中卻沒有發(fā)現(xiàn)，而堯人山優(yōu)勢屬白僵菌屬卻是貴州的廣布屬，廣泛分布于貴陽、湄潭、遵義及梵凈山等地[24-28]。此外，枝穗霉及部分線性蟲草在以上保護區(qū)卻少有發(fā)現(xiàn)。這可能與蟲生真菌的發(fā)生與溫濕度環(huán)境及寄主有關(guān)，蟲草屬和線性蟲草屬真菌多發(fā)生于高濕的闊葉林環(huán)境且對寄主專一（少為廣譜），導(dǎo)致這部分真菌發(fā)生量減少且零星分布，調(diào)查難度增大，而白僵菌屬可寄生多種昆蟲，分布廣泛，容易調(diào)查。

在自然環(huán)境中，蟲生真菌的繁衍、分布與氣候環(huán)境、土壤性質(zhì)、動植被豐富度、海拔高度、人類活動以及歷史環(huán)境變遷等有關(guān)[29]。堯人山地區(qū)植被豐富，鱗翅目、雙翅目、同翅目、鞘翅目、蜘蛛等節(jié)肢動物廣泛分布于原始森林中，其中鱗翅目昆蟲分布最廣，豐富多樣的動物資源為該地區(qū)復(fù)雜的病原真菌附著提供了場所和營養(yǎng)條件。季風氣候顯著，環(huán)境溫和濕潤，大大提高了該地區(qū)病原真菌的寄生率和存活率。此次調(diào)查結(jié)果顯示，該區(qū)蟲生真菌多樣性指數(shù)偏低，均勻度較高，這可能與本次獲得標本數(shù)較少有關(guān)。堯人山國家森林公園蟲生真菌的調(diào)查，豐富了當?shù)氐纳镔Y源，為該地區(qū)蟲生真菌資源的分布、多樣性研究及開發(fā)利用提供了有益參考。endprint

參考文獻：

[1]梁宗琦. 蟲生真菌的多樣性[J]. 生物多樣性，1996，4（4）：235-241.

[2]王 瑞，孫曉燕，馬亞囡，等. 捕食性真菌Duddingtonia flagrans胞外蛋白質(zhì)的生化性質(zhì)研究[J]. 中國獸醫(yī)科學，2015，45（8）：776-780.

[3]梁宗琦，梁建東，陳萬浩，等. 一蟻巢中束梗孢類昆蟲病原真菌的多型現(xiàn)象Ⅱ. 隱存的一個多頭束霉新種：蟻生多頭束霉[J]. 微生物學通報，2015，43（2）：379-385.

[4]王成樹. 蟲生真菌研究與應(yīng)用的發(fā)展與機遇——2012年蟲生真菌?？蜓訹J]. 菌物學報，2012，31（3）：305-306.

[5]王利軍，譚萬忠，羅華東，等. 蟲生真菌及其在害蟲生物控制中的應(yīng)用現(xiàn)狀與展望[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學，2010，39（4）：119-125.

[6]金 娜，劉 倩，簡 恒. 植物寄生線蟲生物防治研究新進展[J]. 中國生物防治學報，2015，31（5）：789-800.

[7]梁宗琦. 中國真菌志[M]. 北京：科學出版社，2007：1-8.

[8]董彩虹，李文佳，李增智，等. 我國蟲草產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀，問題及展望——蟲草產(chǎn)業(yè)發(fā)展金湖宣言[J]. 菌物學報，2016，35（1）：1-15.

[9]劉愛英. 中國蟬花資源研究應(yīng)用[M]. 貴陽：貴州科技出版社，2012，3-9.

[10]余伯成，唐永范，唐 亮，等. 蟲草素的藥理作用研究進展[J]. 現(xiàn)代藥物與臨床，2011，26（5）：349-352.

[11]陳曉琳，樊美珍，李增智. 蟲生真菌育種工作研究進展[J]. 生物學雜志，2008，25（6）：61-62.

[12]劉愛英，鄒 曉，胡海燕，等. 煙草甲致病真菌的初步篩選[J]. 中國生物防治，2008，24（2）：186-188.

[13]何學友，陳順立，楊 希，等. 金龜子綠僵菌在森林土壤中的分布及對松墨天牛致病性測定[J]. 菌物學報，2007，26（2）：289-294.

[14]梁宗琦，劉愛英，陳月碧，等. 昆蟲病原真菌的研究利用——Ⅰ：玫煙色擬青霉不同菌株對菜青蟲的致病效果和固體培養(yǎng)[J]. 植物保護，1980，6：12-14.

[15]袁盛勇，孔 瓊，張 虹，等. 蠟蚧輪枝菌MZ041024菌株對溫室白粉虱和吹棉蚧的室內(nèi)毒力[J]. 西南師范大學學報（自然科學版），2007，32（1）：111-114.

[16]韓智杰，瞿嬌嬌，張曉娜，等. 湯普森被毛孢對二斑葉螨致死率的建模分析[J]. 應(yīng)用昆蟲學報，2013，50（2）：406-412.

[17]黃秀華，方書亮，溫 魯. 用高蟲草素菌粉開發(fā)藥品和保健品[J]. 中國醫(yī)藥科學，2012，2（13）：157-158.

[18]王 爽，李新民，劉春來，等. 東北地區(qū)土壤中高毒力蟲生真菌菌株的篩選[J]. 黑龍江農(nóng)業(yè)科學，2015（1）：50-56.

[19]楊秀標，文光培. 堯人山里好風光[J]. 森林與人類，2015（9）：84-86.

[20]貴州省林業(yè)廳森林管理辦公室. 貴州國家森林公園[J]. 森林與人類，2010（3）：84-96.

[21]White T. Analysis of phylogenetic relationships by amplification and direct sequencing of ribosomal RNA genes. PCR protocols：a guide to methods and applications[M]. New York：Academic，1990，15-22.

[22]Kumar S，Tamura K，Nei M. MEGA3：integrated software for molecular evolutionary genetics analysis and sequence alignment[J]. Briefings in Bioinformatics，2004，5（2）：150-163.

[23]陳名君，劉玉軍，周 娜，等. 皇甫山蟲生真菌物種多樣性研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)大學學報，2009，36（4）：564-567.

[24]梁宗琦，劉愛英，馮冬梅. 梵凈山自然保護區(qū)的一些蟲生真菌[J]. 真菌學報，1993，12（2）：110-117.

[25]梁宗琦，劉愛英，黃建忠，等. 寬闊水自然保護區(qū)的蟲草及其相關(guān)真菌Ⅰ[J]. 真菌學報，1996，15（4）：264-271.

[26]梁宗琦，劉愛英，黃建忠，等. 闊水自然保護區(qū)的蟲草及其相關(guān)真菌Ⅱ[J]. 菌物系統(tǒng)，1997，16（1）：61-67.

[27]梁宗琦，劉愛英，黃建忠，等. 桫欏自然保護區(qū)的蟲草及其相關(guān)真菌[J]. 菌物系統(tǒng)，2002，21（1）：9-14.

[28]梁宗琦. 貴州的部分昆蟲病毒，細菌和原生動物[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學，1984（6）：27-30.

[29]李文英，賀運春，王建明，等. 山西省蟲生真菌生態(tài)多樣性研究[J]. 生物多樣性，2003，11（1）：53-58.臧彩云，沈袁玲，顧敏京，等. 零價鐵對灘涂土壤重金屬鎘形態(tài)及有效性的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2017，45（18）：249-251.endprint