楊振麗 卞曉翠 馮海涼 劉玉琴

100005 北京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 細(xì)胞資源中心

人源細(xì)胞系中6種主要病毒的檢測

楊振麗 卞曉翠 馮海涼 劉玉琴

100005 北京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 細(xì)胞資源中心

目的檢測人源細(xì)胞系中EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)、乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)、丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV)、人乳頭瘤病毒(Human pappilomavirus, HPV)、人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus, HIV)、人T淋巴細(xì)胞白血病病毒(Human T-cell leukemia virus, HTLV)的感染情況。方法對中心庫藏常用的135株人源細(xì)胞系分別提取細(xì)胞DNA及RNA，采用PCR方法對細(xì)胞中的EBV、HBV、HPV、HIV、HTLV進(jìn)行檢測；采用RT-PCR方法對細(xì)胞中的HCV進(jìn)行檢測；利用透射電鏡觀察細(xì)胞中是否有病毒顆粒；對經(jīng)PCR檢測HPV核酸片段陽性的細(xì)胞系，再利用特異性引物采用PCR方法檢測5種高危型HPV(HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV45)。結(jié)果經(jīng)PCR檢測，135株細(xì)胞系中，有4株細(xì)胞系(Daudi、Raji、EB-3、NCI-BL2009)中檢測到EBV 核酸片段；2株細(xì)胞系(Hep3B、PLC/PRF/5)中檢測到HBV核酸片段；7株細(xì)胞系(HeLa、HeLa 229、H1HeLa、HeLaS3、SiHa、Ca Ski、CNE-2Z)中檢測到HPV核酸片段，其中2株(SiHa、Ca Ski)基因型為HPV16，5株(HeLa、HeLa 229、H1HeLa、HeLaS3、CNE-2Z)基因型為HPV18；1株細(xì)胞系(HUT 102)中檢測到HTLV核酸片段；沒有細(xì)胞系中檢測到HIV核酸片段；經(jīng)RT-PCR檢測，沒有細(xì)胞系攜帶HCV核酸片段。透射電鏡下，病毒核酸陽性的細(xì)胞系中未觀察到病毒顆粒，部分細(xì)胞系內(nèi)可見病毒包涵體類似物。結(jié)論P(yáng)CR或RT-PCR可以用于檢測細(xì)胞系中病毒核酸的攜帶情況；細(xì)胞系中病毒核酸以基因組整合的形式存在。

細(xì)胞系在生命科學(xué)研究中是不可或缺的，其中大部分人源細(xì)胞系來源于患者組織，特別是腫瘤細(xì)胞系。病毒與某些疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[1-4]，如乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)與肝癌、丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV)與丙型肝炎、EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)與淋巴瘤及鼻咽癌、人乳頭瘤病毒(Human pappilomavirus, HPV)與宮頸癌、人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus, HIV)與艾滋病、人T淋巴細(xì)胞白血病病毒(Human T-cell leukemia virus, HTLV)與T淋巴細(xì)胞白血病等。細(xì)胞中所攜帶的病毒或因細(xì)胞來源的患者本身感染了某種病毒，也或是由于某些原因而人為引入的外源病毒，如應(yīng)用EBV感染B淋巴細(xì)胞從而建立B淋巴細(xì)胞系作為細(xì)胞模型用于實驗研究。本文通過PCR或RT-PCR及透射電鏡等方法對本中心庫藏的135株人源細(xì)胞系進(jìn)行了檢測，并應(yīng)用PCR的方法檢測了攜帶HPV核酸片段的細(xì)胞系中HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV45等5種高危型的感染情況。

1 材料與方法

1.1材料所用細(xì)胞系及其培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶等均由國家實驗細(xì)胞資源共享服務(wù)平臺中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心提供。DNA提取試劑盒Pure linkTMGenomic DNA Mini Kit購自Invitrogen公司；RNA提取試劑盒RNeasy? Mini kit及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒QuantiTect? Reverse Transcription Kit購自Qiangen公司；所用引物由Invitrogen公司合成；2×EasyTaq PCR SuperMix for PAGE及100 bp DNA Ladder購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；HCV RNA由北京大學(xué)肝病研究所提供。

1.2方法

1.2.1 細(xì)胞DNA及RNA提取:取對數(shù)生長期的細(xì)胞，按DNA提取試劑盒(Pure linkTMGenomic DNA Mini Kit)說明書提取細(xì)胞DNA，用于檢測EBV、HBV、HPV、HIV、HTLV核酸片段； 按RNA提取試劑盒(RNeasy? Mini kit)說明書提取細(xì)胞RNA，用于檢測HCV核酸片段。DNA及RNA分裝后-80 ℃保存。

1.2.2 cDNA合成:按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(QuantiTect? Reverse Transcription Kit)說明書將細(xì)胞RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用于RT-PCR檢測HCV核酸片段，分裝后-80 ℃保存。

表1 PCR或RT-PCR檢測病毒核酸攜帶情況所用引物

1.2.3 引物設(shè)計:根據(jù)文獻(xiàn)報道及NCBI數(shù)據(jù)庫信息選取，并利用primer5.0軟件設(shè)計相應(yīng)引物。所用引物經(jīng)Blast比對驗證(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)。

1.2.4 PCR反應(yīng):HBV陽性對照為Hep3B細(xì)胞的DNA；HCV陽性對照為HCV RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄而獲得的cDNA；EBV陽性對照為B95-8細(xì)胞的DNA；HPV陽性對照為HeLa細(xì)胞的DNA; HIV 陽性對照為含HIV gag片段的質(zhì)粒；HTLV 陽性對照為HUT 102細(xì)胞的DNA；以ddH2O為模板作為陰性對照。PCR體系為20 μl，其組份為：PCR super mix 10 μl，上下游引物各1 μl，模板DNA或cDNA 1 μl (100 ng)，ddH2O補(bǔ)足至20 μl。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性15 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72 ℃最終延伸10 min。

1.2.5 透射電鏡觀察:每種細(xì)胞約1×107個細(xì)胞，移入1.5 ml EP管中，離心，棄上清，加入1.5 ml新鮮配制的2.5%戊二醛固定液，4 ℃固定。由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所儀器中心電鏡室進(jìn)行樣品制備，經(jīng)透射電子顯微鏡TEM-1010進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果

2.1攜帶EBV核酸片段的細(xì)胞系對135株人源細(xì)胞系的DNA分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以EBV引物擴(kuò)增得到陽性產(chǎn)物的只有Daudi、Raji、EB-3、NCI-BL2009 細(xì)胞。而這4種細(xì)胞DNA，以其他引物進(jìn)行擴(kuò)增，沒有擴(kuò)增出相應(yīng)大小的陽性條帶。結(jié)果見圖1。

2.2攜帶HBV核酸片段的細(xì)胞系細(xì)胞DNA分別以HBV引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，只有Hep3B和PLC/PRF/5細(xì)胞可擴(kuò)增出與陽性對照相應(yīng)大小的條帶，而這2種細(xì)胞系以其他引物沒有擴(kuò)增出陽性條帶。結(jié)果如圖2所示。

圖1 經(jīng)PCR檢測攜帶EB病毒核酸片段的細(xì)胞系Fig.1 Detection of cell lines harbored EBV DNA sequences by PCR

圖2 經(jīng)PCR檢測攜帶乙型肝炎病毒核酸片段的細(xì)胞系Fig.2 Detection of cell lines harbored HBV DNA sequences by PCR

圖3 經(jīng)PCR檢測攜帶人乳頭瘤病毒核酸片段的細(xì)胞系Fig.3 Detection of cell lines harbored HPV DNA sequences by PCR

2.3攜帶HPV核酸片段的細(xì)胞系及高危型HPV檢測細(xì)胞DNA分別以HPV引物(MY09和MY11)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，宮頸癌細(xì)胞HeLa、SiHa、Ca Ski的細(xì)胞DNA經(jīng)HPV引物擴(kuò)增后，可出現(xiàn)與陽性對照相一致的條帶，而其他引物沒有擴(kuò)增出陽性條帶；HeLa 229、H1HeLa、HeLaS3細(xì)胞與HeLa細(xì)胞結(jié)果一致；其中HeLa、HeLa 229、H1HeLa、HeLaS3細(xì)胞在基因型HPV18引物擴(kuò)增下，可出現(xiàn)相應(yīng)大小的陽性條帶，其他基因型引物無陽性擴(kuò)增產(chǎn)物；SiHa、Ca Ski細(xì)胞經(jīng)基因型HPV16引物擴(kuò)增后，出現(xiàn)相應(yīng)大小的陽性條帶，而其他基因型無陽性條帶。鼻咽癌細(xì)胞CNE-2Z細(xì)胞在HPV引物擴(kuò)增下，可產(chǎn)生與陽性對照大小一致的條帶，而在其他引物擴(kuò)增下沒有相應(yīng)大小的陽性條帶；經(jīng)基因型HPV18引物擴(kuò)增后，可產(chǎn)生相應(yīng)大小的陽性條帶。HPV檢測結(jié)果見圖3，高危型HPV檢測結(jié)果如表2所述。

表2 高危型人乳頭瘤病毒PCR檢測結(jié)果

2.4透射電鏡觀察細(xì)胞內(nèi)病毒顆粒經(jīng)透射電鏡觀察，未發(fā)現(xiàn)病毒核酸陽性的細(xì)胞中有病毒顆粒存在。但在細(xì)胞核和/或細(xì)胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)了大小不均、個數(shù)不等的類似病毒包涵體的結(jié)構(gòu)。高倍放大后觀察，可見該結(jié)構(gòu)為大小均一的顆粒樣物質(zhì)聚集而成，周圍無膜類物質(zhì)包裹，但與周圍成份分界明顯。其中，該結(jié)構(gòu)在Ca Ski、HeLa、HUT 102等細(xì)胞中較多(如圖4，黑色箭頭所示)；Daudi細(xì)胞中也有少量該結(jié)構(gòu)；NCI-BL2009、PLC/PRF/5中沒有發(fā)現(xiàn)明顯的以上結(jié)構(gòu)。同時，在Raji細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)含有類似管狀膜樣結(jié)構(gòu)的包涵體樣結(jié)構(gòu)(如圖4，白色箭頭所示)。

3 討論

細(xì)胞系多取材于患者的病灶組織，這些組織可能攜帶有病人自身感染的某些與疾病相關(guān)的病毒，導(dǎo)致細(xì)胞系中也會攜帶該病毒。因此，本研究選取部分人類易感染的致病病毒，如EBV、HBV、HCV、HPV、HIV、HTLV等作為檢測目標(biāo)，應(yīng)用PCR或RT-PCR及透射電鏡等方法對庫藏人源細(xì)胞系的病毒感染情況進(jìn)行了檢測。

圖4 經(jīng)透射電鏡觀察細(xì)胞內(nèi)有病毒包涵體類似物Fig.4 Detection of viral inclusion bodies in cell lines by TEM

PCR或RT-PCR可用于檢測細(xì)胞系的病毒核酸攜帶情況。EBV、HBV、HPV為DNA病毒，HIV、HTLV為逆轉(zhuǎn)錄病毒，因此本研究采用PCR的方法檢測了細(xì)胞DNA；HCV為RNA病毒，因此本研究提取了細(xì)胞RNA采用RT-PCR的方法進(jìn)行檢測。經(jīng)檢測，本中心庫藏的135株人源細(xì)胞系中，共發(fā)現(xiàn)14株細(xì)胞系中存在相應(yīng)病毒核酸片段。其中，攜帶EBV核酸片段的細(xì)胞系中，除NCI-BL2009細(xì)胞為EBV轉(zhuǎn)化的外周血B淋巴細(xì)胞外，其余3株均來自Burkitt淋巴瘤患者；攜帶HBV核酸片段的Hep3B和PLC/PRF/5細(xì)胞均來自肝癌患者；攜帶HPV18核酸片段的HeLa、HeLa 229、H1HeLa、HeLaS3細(xì)胞及攜帶HPV16核酸片段的SiHa、Ca Ski細(xì)胞均來自宮頸癌患者；鼻咽癌細(xì)胞CNE-2Z中未檢測到EBV核酸片段，但HPV擴(kuò)增陽性，基因型為HPV18。由此可見，病毒在某些疾病的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用[1-4，8]。

攜帶病毒核酸片段的細(xì)胞系中沒有完整的病毒顆粒。Uphoff等[6]通過檢測ZEBRA蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)只有個別細(xì)胞系經(jīng)丁酸鈉及TAP誘導(dǎo)后才會產(chǎn)生病毒顆粒，病毒在細(xì)胞中主要以基因組整合及游離形式存在。本研究經(jīng)透射電鏡進(jìn)一步觀察，攜帶病毒核酸片段的細(xì)胞內(nèi)未發(fā)現(xiàn)病毒顆粒，僅部分細(xì)胞系(Ca Ski、HeLa、HUT 102、Raji等)的細(xì)胞質(zhì)和/或核內(nèi)可見大小不等的包涵體類似物。說明在常規(guī)培養(yǎng)過程中，這些細(xì)胞系不會產(chǎn)生完整的病毒顆粒。這些包涵體類似物與細(xì)胞的培養(yǎng)時間等是否有關(guān)，其構(gòu)成、功能及發(fā)生發(fā)展都鮮有報道，李慧弘等[9]在HeLa細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了這種結(jié)構(gòu)，認(rèn)為由HPV L1構(gòu)成。本實驗室也將繼續(xù)研究該結(jié)構(gòu)在細(xì)胞系中的組成及作用。

綜上可見，應(yīng)用針對不同病毒的特異性引物，經(jīng)PCR或RT-PCR的方法檢測細(xì)胞系是否攜帶病毒核酸是可行的；以上檢測結(jié)果與文獻(xiàn)報道一致[6]，也進(jìn)一步驗證了細(xì)胞系的正確性。所檢測到的攜帶病毒核酸片段的細(xì)胞系可作為研究病毒與疾病關(guān)系的細(xì)胞模型。某些細(xì)胞系中含有的病毒包涵體類似物仍需進(jìn)一步研究。

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2017-05-03)

(本文編輯：呂新軍)

Detectionofsixmainspeciesofvirusesinhumancelllines

YangZhenli,BianXiaocui,FengHailiang,LiuYuqin

CellResourceCenter,InstituteofBasicMedicalSciencesChineseAcademyofMedicalSciences,SchoolofBasicMedicinePekingUnionMedicalCollege,Beijing100005,China

LiuYuqin,Email:liuyuqin@pumc.edu.cn

ObjectiveTo clarify the virus hosting status of human cell lines.MethodsThe DNA of Epstein-Barr virus (EBV), Hepatitis B virus (HBV), Human pappilomavirus (HPV), Human immunodeficiency virus (HIV), Human T-cell leukemia virus (HTLV) in 135 human cell lines were checked using PCR, and HCV RNA sequences were checked by RT-PCR. The transmission electron microscopy (TEM) was used to examine the virus particles in cells. The high-risk genotypes of HPV were tested by PCR.ResultsBy PCR assaying, among the 135 human cell lines, four cell lines(Daudi, Raji, EB-3, NCI-BL2009) harbored EBV DNA sequences; two(Hep3B, PLC/PRF/5) harbored HBV DNA sequences; seven (HeLa, HeLa 229, H1HeLa, HeLaS3, SiHa, Caski, CNE-2Z) harbored HPV DNA sequences, including two cell lines (SiHa, Caski) with HPV16, five cell lines(HeLa, HeLa 229, H1HeLa, HeLaS3, CNE-2Z) with HPV18; one cell line(HUT 102) harbored HTLV DNA sequences. No cell line harbored HCV RNA sequences and HIV DNA sequences. No viral particles were observed in the positive cell lines by TEM，but some viral inclusion bodies in certain cell lines.ConclusionsThe virus hosting status of human cell lines can be checked by PCR or RT-PCR. The viral DNA sequences were integrated in the cellular genome.

Cell lines; Virus; Polymerase chain reaction; Electron microscopy

劉玉琴，Email: liuyuqin@pumc.edu.cn

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.05.018

細(xì)胞系；病毒；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；電子顯微鏡