孟曦男，周恒達(dá)，徐素宏

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CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)在秀麗線蟲中的應(yīng)用

孟曦男，周恒達(dá)，徐素宏

浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，浙江杭州 310058

孟曦男, 周恒達(dá), 徐素宏. CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)在秀麗線蟲中的應(yīng)用. 生物工程學(xué)報(bào), 2017, 33(10): 1693–1699.Meng XN, Zhou HD, Xu SH. CRISPR-Cas9 mediated genome editing in Caenorhabditis elegans. Chin J Biotech, 2017, 33(10): 1693–1699.

基于細(xì)菌基因組規(guī)律成蔟的間隔短回文重復(fù) (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)發(fā)展而來的新型基因編輯方法 (CRISPR-Cas9) 對(duì)生物醫(yī)學(xué)研究是一場(chǎng)劃時(shí)代的革命。它幾乎可用于大多數(shù)生物體的基因編輯。秀麗線蟲是一種非常經(jīng)典的遺傳學(xué)模式生物，CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)進(jìn)一步加速了對(duì)其基因功能及各種生物學(xué)問題的研究。文中主要總結(jié)CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)在遺傳學(xué)模式生物秀麗線蟲中的發(fā)展和應(yīng)用。

基因編輯，CRISPR-Cas9，非同源末端連接，同源重組，遺傳篩選，組織特異性

生物學(xué)研究的一個(gè)重要目標(biāo)是精確剖析基因在生物體生長(zhǎng)發(fā)育和疾病中的功能。常用的技術(shù)手段是改變基因的表達(dá)以觀察其對(duì)生物體的影響，并進(jìn)一步研究其發(fā)揮作用的分子細(xì)胞學(xué)機(jī)制。幾十年來，多種技術(shù)手段被用于制造基因功能缺失，例如基因敲降技術(shù)RNAi，基因敲除技術(shù) (包括時(shí)空特異性和組織特異性敲除)，以及多種化學(xué)誘變劑誘導(dǎo)基因突變的手段等。這些技術(shù)構(gòu)成了正向遺傳和反向遺傳學(xué)解決生物學(xué)問題的基礎(chǔ)。另一種研究基因功能的方法是觀察基因表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的動(dòng)態(tài)運(yùn)動(dòng)，例如利用抗體染色或內(nèi)源性熒光蛋白標(biāo)記技術(shù)。這兩種研究基因功能的策略是現(xiàn)代生物學(xué)研究的常規(guī)策略，在多種模式生物中的研究取得了巨大的成功。

秀麗線蟲 (, 以下簡(jiǎn)稱線蟲) 是一種經(jīng)典的遺傳學(xué)模式生物，具有生命周期短、基因組小、基因數(shù)目多、便于遺傳操作、通體透明易于顯微觀察等優(yōu)勢(shì)，被廣泛用于發(fā)育生物學(xué)和神經(jīng)生物學(xué)的研究。制造線蟲基因突變的方法有化學(xué)誘變劑甲磺酸乙酯 (Ethyl methane sulfonate，EMS) 引起的基因突變，物理輻射引起的基因突變等，以及利用轉(zhuǎn)座子Tc1和Mos1插入的方法改變基因組等多種手段[1-3]。近年來，鋅指核糖核酸酶 (Zinc finger nucleases，ZFNs) 和轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)蛋白核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases，TALENs)也被用于改造線蟲的基因組[4-5]。但由于ZFNs和TALENs前期工具質(zhì)粒構(gòu)建較為繁瑣和昂貴，并沒有在線蟲中被廣泛應(yīng)用。自2013年以來，從細(xì)菌免疫現(xiàn)象中發(fā)現(xiàn)和發(fā)展的CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)由于其構(gòu)造簡(jiǎn)單、易于操控和改造以及價(jià)格低廉等優(yōu)勢(shì)，迅速成為基因編輯領(lǐng)域的主要研究技術(shù)[6-7]。該方法幾乎在所有模式生物中得到了廣泛應(yīng)用，大力推動(dòng)了反向遺傳學(xué)解決生物學(xué)問題的研究[8]。關(guān)于CRISPR-Cas9在線蟲中的應(yīng)用，國(guó)內(nèi)外期刊已有多篇詳盡的綜述論文[9-11]。此篇論文主要針對(duì)中文讀者以及線蟲領(lǐng)域的一線研究人員，介紹CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)在線蟲中的最新發(fā)展和應(yīng)用。

1 基因編輯的原理

基因組在進(jìn)行自我復(fù)制以及遭受環(huán)境壓力下均會(huì)發(fā)生突變，其中大多數(shù)情況下能得到精確修復(fù)。整條基因組雙鏈DNA斷裂 (Double strand break，DSB) 的情況下，生物體內(nèi)源性的修復(fù)機(jī)制啟動(dòng)并修復(fù)基因組序列。目前已知存在兩種機(jī)制參與修復(fù)雙鏈DNA斷裂[6]，一種為非同源性末端連接 (Non-homologous end joining，NHEJ)，修復(fù)結(jié)束后可能會(huì)造成DNA上堿基的隨機(jī)缺失和插入，引起基因開放閱讀框的突變；另一種為同源序列指導(dǎo)修復(fù)(Homology-directed repair，HDR)，即基于模板存在情況下的同源重組，可以利用外源提供的同源序列實(shí)現(xiàn)精確修復(fù)。無論是ZFNs、TALENs還是CRISPR-Cas9系統(tǒng)，都以這兩種修復(fù)機(jī)制為基礎(chǔ)實(shí)現(xiàn)對(duì)特定基因的靶向編輯。

2 CRISPR-Cas9系統(tǒng)

CRISPR-Cas9系統(tǒng)最先于細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)，是細(xì)菌抵御外界病毒感染的一種有效方式。CRISPR重復(fù)序列間有不同的居間序列，表達(dá)出引導(dǎo)RNA，可以通過堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式指導(dǎo)Cas蛋白家族 (現(xiàn)在主要是SpCas9) 特異地在病毒的基因組上進(jìn)行切割從而阻斷病毒基因組的復(fù)制從而達(dá)到抑制病毒生長(zhǎng)的目的。這一工作模式最早被Jennifer Doudna、Emmanuelle Charpentier和張鋒等科學(xué)家設(shè)計(jì)用來人工控制特異性地切割外源和內(nèi)源DNA[12-13]。CRISPR-Cas9系統(tǒng)的核心組分為識(shí)別靶向DNA的引導(dǎo)RNA (sgRNA)和核酸酶Cas9。這種簡(jiǎn)易而且高效的基因編輯方法迅速成為現(xiàn)代生物學(xué)研究重要的工具。

CRISPR-Cas9基因編輯手段的優(yōu)點(diǎn)在于其設(shè)計(jì)方便，利用堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則理論上可以設(shè)計(jì)出任何基因特異性的sgRNA，結(jié)合Cas9對(duì)特定位點(diǎn)處DNA造成雙鏈斷裂[7]。一直以來，在線蟲中，外源DNA可以通過顯微注射的方法注射到生殖腺中獲得轉(zhuǎn)基因[14]，對(duì)于CRISPR- Cas9系統(tǒng)，顯微注射也是最方便和快捷的方 式[8]。研究人員發(fā)現(xiàn)，注射體外純化的Cas9核酸酶或表達(dá)Cas9核酸酶的質(zhì)粒混合sgRNA質(zhì)?；蝮w外轉(zhuǎn)錄的sgRNA都可以獲得相應(yīng)的突變體[15-18](圖1A)，這為后期改良系統(tǒng)奠定了基礎(chǔ)。在考慮到經(jīng)濟(jì)成本和工作量的情況下，如今大多數(shù)線蟲實(shí)驗(yàn)室都通過直接注射編碼Cas9和sgRNA的質(zhì)粒的方法來改造基因組 (圖1)?，F(xiàn)今CRISPR- Cas9基因編輯技術(shù)一個(gè)最為關(guān)鍵的問題是其脫靶率較高，但是通過全基因組測(cè)序及脫靶基因預(yù)測(cè)，該編輯技術(shù)在線蟲中至今鮮有脫靶現(xiàn)象，這可能和線蟲相對(duì)簡(jiǎn)單的基因組有關(guān)[8]。

為進(jìn)一步提高CRISPR-Cas9基因編輯的效率，減少后續(xù)突變體篩選上的工作量以及力求更經(jīng)濟(jì)便捷的手段，研究人員利用線蟲的遺傳學(xué)優(yōu)勢(shì)，對(duì)CRISPR-Cas9在線蟲上的應(yīng)用做了諸多改良。CRISPR-Cas9系統(tǒng)原理簡(jiǎn)單，關(guān)鍵影響因素取決于Cas9蛋白、sgRNA和模板DNA，研究人員通過對(duì)以下5個(gè)方面的改良，力求更高效地獲得所需要的突變體。

2.1 Cas9核酸酶的優(yōu)化

現(xiàn)在大多實(shí)驗(yàn)室利用的都是CRISPR-Cas9系統(tǒng)進(jìn)行基因編輯。通常情況下Cas9特異性識(shí)別的PAM序列是5′-NGG-3′序列。在基因組上，NGG序列出現(xiàn)的概率較高，但是在特定情況下，例如需要做定點(diǎn)突變，可能很難尋找到合適的sgRNA。最近，Andrew Fire實(shí)驗(yàn)室針對(duì)性地將Cas9的PAM識(shí)別區(qū)域進(jìn)行定點(diǎn)突變，發(fā)現(xiàn)可以改變Cas9對(duì)PAM序列的識(shí)別[19]。新型的Cas9突變(VQR和VRER突變體Cas9) 在線蟲基因組上可以分別識(shí)別PAM序列5′-NGA-3′和5′-NGCG-3′，為研究人員提供了更多的Cas9可編輯位點(diǎn)的選擇 (圖1B)[19]。

2.2 sgRNA的優(yōu)化

CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)最為關(guān)鍵的是尋找到合適的sgRNA，一方面需要sgRNA非常特異，另一方面需要sgRNA和靶向DNA可以穩(wěn)定結(jié)合。通過對(duì)眾多已發(fā)表的sgRNA所作用的效率進(jìn)行比較，研究人員發(fā)現(xiàn)3′端為GG的sgRNA的基因編輯效果顯著高于3′端非GG的sgRNA，即在緊鄰PAM序列的5'端還存在另一GG序列，即5′-GGNGG-3′類型序列[20]。實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)也表明這一sgRNA的設(shè)計(jì)可以顯著提高基因編輯的成功 率[20-21]。另外sgRNA改良型sgRNA (F+E)，其上延伸出一段缺少PolIII終止子與Cas9的結(jié)合域，亦能提高CRISPR-Cas9系統(tǒng)基因編輯的成功 率[22-23]。此外，由于生物體內(nèi)大量重復(fù)基因的存在，根據(jù)DNA序列的保守性，單條sgRNA即可在線蟲基因組中實(shí)現(xiàn)多個(gè)同源基因的編輯[24]。

2.3 修復(fù)模板的載體優(yōu)化

在外源模板存在的情況下，斷裂的雙鏈DNA可以通過同源重組的方式進(jìn)行精確修復(fù)。這一DNA修復(fù)的機(jī)制在基因編輯上得到了極大的應(yīng)用，例如用熒光蛋白標(biāo)記目標(biāo)蛋白質(zhì)以觀察其在細(xì)胞內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化等。線蟲里可以直接注射外源質(zhì)粒DNA作為模板，同源序列長(zhǎng)度大于500 bp的質(zhì)粒DNA都能發(fā)生有效的同源重組，但是同源重組的效率不同的基因有所不同[18]。最近的研究也發(fā)現(xiàn)，DNA的PCR產(chǎn)物片段或者單鏈DNA也可以被用作同源重組的模板，并且同源臂的長(zhǎng)度可短至30個(gè)核苷酸，且同源重組的效率并不受顯著的影響[25-26]。由此所進(jìn)行的修復(fù)模板改良，給以線蟲為模型的研究人員提供了更多選擇，同時(shí)節(jié)省了時(shí)間和成本，加速了實(shí)驗(yàn)的進(jìn)程。

2.4 篩選手段的優(yōu)化

線蟲突變體傳統(tǒng)的篩選方法是借助于表型觀察和基于PCR方法的基因型鑒定。由于大多數(shù)基因的突變不會(huì)造成非常明顯的表型，因此，PCR鑒定成為了最重要的檢測(cè)方法。為了減少PCR檢測(cè)的工作量，利用線蟲自身的遺傳學(xué)優(yōu)勢(shì)，一些前期的篩選方法很快被改造出來，例如co-CRISPR和co-Conversion的方法[27-29]，其原理主要是篩選Cas9核酸酶有活性的突變體。此外，還有直接的篩選方法如藥物篩選一些抗藥基因，熒光觀察直接插入熒光標(biāo)記或缺失的基因等[18, 24]。其中藥物篩選雖然有效，但也引入了更多的外源基因，為除去這些外源不必要的插入序列，一種基于Cre/LoxP或Flp/FRT重組酶系統(tǒng)的自我消除元件 (Self-excising cassette，SEC) 被設(shè)計(jì)出來[30]。這些篩選方法有效地減少了PCR篩選的工作量并提高了基因編輯的效率。

2.5 組織特異性敲除

基因表達(dá)的時(shí)序性和組織特異性為解析基因功能的多效性帶來了很大難度，解決這一問題的方法主要是條件性突變或基因失活。目前，在線蟲里已經(jīng)有一些策略被用于條件性基因失活，例如基于定點(diǎn)重組酶系統(tǒng)的Cre/LoxP和Flp/FRT系統(tǒng)，組織、時(shí)空或溫度特異性的RNA 干擾系統(tǒng)和條件性TALENs系統(tǒng)等[5,18, 31-32]。這些方法極大地方便了對(duì)基因在不同組織中功能的解析，特別是對(duì)于一些早期胚胎致死基因的研究有非常大的貢獻(xiàn)。清華大學(xué)歐光朔課題組首先利用CRISRP-Cas9系統(tǒng)開發(fā)出了更為簡(jiǎn)單而高效的條件性敲除系統(tǒng)。他們利用細(xì)胞和時(shí)空特異性表達(dá)的啟動(dòng)子表達(dá)Cas9核酸酶以及細(xì)胞核定位的sgRNA，可以實(shí)現(xiàn)在特定細(xì)胞或特定時(shí)期敲除基因，確定其在不同生理?xiàng)l件下不同細(xì)胞以及不同時(shí)期的功能[11]。這一方法為研究發(fā)育過程中必需基因的功能創(chuàng)造了條件[33]。

3 總結(jié)與展望

現(xiàn)今主要運(yùn)用于秀麗線蟲中的基因編輯技術(shù)多依賴于CRISPR原理的Cas核酸酶系統(tǒng)，其強(qiáng)大的定點(diǎn)基因編輯能力進(jìn)一步完善了在線蟲中的相關(guān)研究手段，使得對(duì)線蟲基因組的編輯在效率上得到極大提升。對(duì)CRISPR的基因編輯系統(tǒng)的不斷改良也是科學(xué)研究的一個(gè)重要方向。比如全部核酸酶功能失活的Cas9，即dCas9現(xiàn)在也被用于結(jié)合特定位點(diǎn)參與基因調(diào)控。且除了Cas9之外，還有許多新型Cas核酸酶仍在不斷被發(fā)現(xiàn)和修飾，如Cpf1，不需要tracrRNA即可發(fā)生識(shí)別和剪切[34]；新從地下水和土壤中發(fā)現(xiàn)的CasX和CasY，質(zhì)量更小[35]。雖然沒有在線蟲中采用過，但是其應(yīng)用前景廣泛。

從線蟲的基因編輯技術(shù)的發(fā)展歷程來看，起初利用化學(xué)誘變劑、物理高能輻射或者是自然轉(zhuǎn)座隨機(jī)性地制造點(diǎn)突變、基因插入或缺失，得到了很多突變體，為科學(xué)研究提供了大量的材料，幫助科學(xué)家解析這些基因的正常生理功能。現(xiàn)在利用CRISPR-Cas9高效并多能的基因編輯系統(tǒng)，科學(xué)家可以實(shí)現(xiàn)對(duì)特定基因進(jìn)行靶向編輯或標(biāo)記，并能對(duì)單核苷酸進(jìn)行精準(zhǔn)編輯，大大有利于現(xiàn)代生物學(xué)對(duì)基因及其表達(dá)產(chǎn)物在生命體中生理功能的研究。線蟲中CRISPR-Cas9系統(tǒng)的優(yōu)化和改造，也為這一編輯技術(shù)在其他物種中的應(yīng)用提供參考和借鑒。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

CRISPR-Cas9 mediated genome editing in

Xi’nan Meng, Hengda Zhou, and Suhong Xu

School of Medicine, Zhejiang University, Hangzhou 310058, Zhejiang, China

The development of genome editing techniques based on CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas9 system has revolutionized biomedical researches. It can be utilized to edit genome sequence in almost any organisms including, one of the most convenient and classic genetic model animals. The application of CRISPR-Cas9 mediated genome editing inpromotes the functional analysis of gene and proteins under many physiological conditions. In this mini-review, we summarized the development of CRISPR-Cas9-based genome editing in.

genome editing, CRISPR-Cas9, NHEJ, homology recombination, genetic screening, tissue specific

May 2, 2017;

July 31, 2017

Suhong Xu. Tel: +86-571-88981770; E-mail: shxu@zju.edu.cn

Supported by:National Key R & D Projects of China (No. 2016YFC1100204), the Junior Thousand Talents Program of China.

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(No. 2016YFC1100204)，青年千人計(jì)劃資助。

徐素宏 博士，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院研究員，博士生導(dǎo)師。2009年博士畢業(yè)于中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所。隨后赴美國(guó)加州大學(xué)圣地亞哥分校開展博士后工作。2015年入選國(guó)家青年“千人計(jì)劃”并于同年12月加入浙江大學(xué)。主要研究機(jī)體的創(chuàng)傷修復(fù)和再生。實(shí)驗(yàn)室以秀麗線蟲為模型，通過遺傳學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)手段以及活體影像、光遺傳學(xué)、CRISPR-Cas9基因組編輯等技術(shù)，研究皮膚損傷修復(fù)和的細(xì)胞分子生物學(xué)機(jī)理。研究成果發(fā)表在一些著名國(guó)際期刊，包括、、等。目前兼任中國(guó)細(xì)胞學(xué)會(huì)發(fā)育生物學(xué)專業(yè)委員會(huì)委員、青年委員會(huì)委員和中國(guó)動(dòng)物學(xué)會(huì)發(fā)育生物學(xué)分會(huì)委員。