利用rBE3和rBE4系統(tǒng)進(jìn)行水稻基因單堿基編輯的特異性和遺傳穩(wěn)定性分析

任斌，嚴(yán)芳，曠永潔，李娜，張大偉，林宏輝，周煥斌

?

利用rBE3和rBE4系統(tǒng)進(jìn)行水稻基因單堿基編輯的特異性和遺傳穩(wěn)定性分析

任斌1,2*，嚴(yán)芳1*，曠永潔1，李娜1，張大偉2，林宏輝2，周煥斌1

1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物病蟲害生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193 2四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 610065

任斌, 嚴(yán)芳, 曠永潔, 等. 利用rBE3和rBE4系統(tǒng)進(jìn)行水稻基因單堿基編輯的特異性和遺傳穩(wěn)定性分析. 生物工程學(xué)報, 2017, 33(10): 1776–1785.Ren B, Yan F, Kuang YJ, et al. Specificity and inheritance of rBE3 and rBE4 endonuclease-induced gene modifications in rice. Chin J Biotech, 2017, 33(10): 1776–1785.

對基于rBE3 (Rice base editor) 和rBE4堿基編輯系統(tǒng)創(chuàng)制獲得和等基因的單堿基編輯突變體材料進(jìn)行編輯特異性和遺傳穩(wěn)定性分析，旨在全面了解和更好地利用該堿基編輯系統(tǒng)。首先對和sgRNA的潛在脫靶位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測，并對T0代材料中的各脫靶位點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增和Sanger測序檢測；同時對該兩個基因的突變體材料自交獲得的T1代植株的靶位點(diǎn)序列和外源T-DNA分離進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示各T0代材料均未檢測到潛在脫靶位點(diǎn)發(fā)生單堿基編輯；此外，和含有相同的sgRNA位點(diǎn)，且兩個位點(diǎn)均能發(fā)生單堿基編輯；rBE3或rBE4系統(tǒng)介導(dǎo)產(chǎn)生的堿基編輯可穩(wěn)定遺傳至T1代，并在T1代可獲得無外源T-DNA的純合突變體。上述結(jié)果表明由rBE3或rBE4介導(dǎo)的堿基編輯具有較高的特異性，可進(jìn)行多位點(diǎn)編輯，引入的堿基替換可穩(wěn)定遺傳至后代。

CRISPR/Cas9n，大鼠胞苷脫氨酶，脫靶效率，T-DNA分離，水稻

近年來，基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)作為一種重要技術(shù)手段在植物學(xué)研究和作物品種改良中得到了廣泛應(yīng)用。目前，植物基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)主要是利用CRISPR/Cas9等系統(tǒng)在目標(biāo)基因組靶位點(diǎn)處引入DNA雙鏈斷裂，再經(jīng)非同源末端連接 (Non-homologous end Joining，NHEJ) 機(jī)制修復(fù)后在切割位點(diǎn)產(chǎn)生數(shù)個核苷酸的缺失或插入，進(jìn)而導(dǎo)致所在靶位點(diǎn)基因的閱讀框移碼使得靶基因功能喪失[1-2]。除了常見的在特定基因組靶位點(diǎn)處引入核苷酸缺失或插入，對基因組靶位點(diǎn)特定堿基進(jìn)行定向編輯也已成為基因編輯領(lǐng)域的難點(diǎn)和熱點(diǎn)。對基因組靶位點(diǎn)特定堿基進(jìn)行定向編輯，可實(shí)現(xiàn)靶基因定向功能激活或者喪失，這對于研究基因功能研究和作物品種改良具有重要作用。利用植物細(xì)胞內(nèi)基因組DNA修復(fù)途徑的同源重組 (Homologous recombination，HR) 或非同源末端連接機(jī)制，研究人員已經(jīng)成功地在水稻中實(shí)現(xiàn)了靶基因的定點(diǎn)插入和基因矯正[3-4]。然而，較低的基因編輯效率限制了其廣泛的使用。因此，對植物基因組特定堿基進(jìn)行定向改造以得到基因功能獲得性突變體仍然具有一定的挑戰(zhàn)性。2016年，在哺乳動物細(xì)胞中，基于由Cas9n切口酶、大鼠胞苷脫氨酶APOBEC1和尿嘧啶DNA糖基化酶抑制劑UGI組成的融合蛋白 (即堿基編輯器，Base editor 3，BE3) 和sgRNA的引導(dǎo)成功對靶標(biāo)基因?qū)崿F(xiàn)了單堿基編輯[5]，這為單堿基編輯技術(shù)的發(fā)展提供了全新的思路。其原理為sgRNA引導(dǎo)堿基編輯器結(jié)合到基因組靶位點(diǎn)，胞嘧啶脫氨酶將活性窗口內(nèi)的胞嘧啶堿基(C) 向胸腺嘧啶堿基(T) 或鳥嘌呤堿基(G)、腺嘌呤堿基(A) 轉(zhuǎn)換，尤其是當(dāng)UGI存在時，胞嘧啶堿基對向胸腺嘧啶轉(zhuǎn)換具有一定的偏好性。此后，科研人員很快將此技術(shù)應(yīng)用到植物中，利用APOBEC1-Cas9n-UGI組成的編輯編輯器BE3相繼在水稻、小麥、玉米、擬南芥和番茄中實(shí)現(xiàn)了單堿基編輯，獲得了相應(yīng)突變體材料[6-11]。然而，對BE3介導(dǎo)的植物單堿基編輯的脫靶效應(yīng)、遺傳穩(wěn)定性等尚未見報道。因此，本課題組對前期基于rBE3 (APOBEC1-Cas9n-UGI，PAM序列為NGG) 和rBE4 (APOBEC1-Cas9n (VQR)-UGI，PAM序列為NGA[12-13]等) 而創(chuàng)制的水稻單堿基編輯突變體進(jìn)行了脫靶效應(yīng)和遺傳穩(wěn)定性等的檢測，旨在全面地了解并更好地應(yīng)用該技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

和等基因的單堿基編輯T0代和T1代突變體材料，均由本實(shí)驗(yàn)室以水稻品種Kitaake為背景材料分別利用rBE3或rBE4堿基編輯系統(tǒng)創(chuàng)制獲得[8]，均種植在玻璃溫室中。CTAB購自北京睿恒均安科技有限公司，無水乙醇、氯仿和異丙醇等常規(guī)化學(xué)試劑 (分析純) 均購自國藥集團(tuán)，I-5TM2× High-Fidelity Master Mix購自克勞寧 (北京) 生物科技有限公司，2× Tsingke Master Mix購自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司。試驗(yàn)所用引物由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 潛在脫靶位點(diǎn)的預(yù)測分析

將各基因的靶位點(diǎn)sgRNA序列在http://rice. plantbiology.msu.edu/standalone_blast.shtml網(wǎng)站上進(jìn)行Blastn比對 (Expect Threshold設(shè)為1 000，其余參數(shù)為默認(rèn)設(shè)置)，在比對獲得相似序列中，選擇其3′端含有PAM序列 (NGG或NGA) 且PAM序列前20個左右的堿基與靶位點(diǎn)sgRNA序列相似性較高的位點(diǎn)作為潛在的脫靶位點(diǎn)。

1.2.2 水稻基因組DNA的提取

參考Porebski等的方法[14]，采用CTAB法提取水稻葉片的基因組DNA。具體操作為：剪取的水稻幼苗葉片經(jīng)全自動樣品快速研磨儀研磨 (60 Hz，60 s) 后，加入600 μL 2× CTAB提取液 (含0.1% β-巰基乙醇) 后振蕩混勻，65 ℃水浴裂解45 min；加入500 μL氯仿抽提，14 000 r/min室溫離心10 min；離心后取上清液400 μL于離心管，加入400 μL異丙醇，顛倒混勻后置于–20 ℃中沉淀30 min；14 000 r/min離心10 min后棄上清液，白色DNA沉淀經(jīng)70%乙醇洗滌風(fēng)干后加入30 μL ddH2O溶解。DNA溶液置于–20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 堿基編輯位點(diǎn)及潛在脫靶位點(diǎn)的檢測

以水稻突變體DNA為模板，利用特異引物 (見表1) 對各編輯位點(diǎn)及潛在脫靶位點(diǎn)的兩側(cè)序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為：I-5TM2× High-Fidelity Master Mix 25 μL，引物F/R (10 μmol/L) 各2 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 20 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?8 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性10 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，循環(huán)34次；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后直接委托北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行Sanger測序，分析其堿基編輯類型。

表1 文中所用到的引物及其序列

1.2.4 無外源T-DNA元件突變體的鑒定

選擇發(fā)生堿基編輯事件的T0代植株單株自交結(jié)實(shí)獲得T1種子，并將其播種成苗后提取葉片基因組DNA。以T1代植株DNA為模板，分別利用T-DNA上的潮霉素特異引物-F1/R1和Cas9特異引物-F1/R1 (見表1) 對T-DNA的有無進(jìn)行兩輪PCR檢測。PCR擴(kuò)增體系為：2× Tsingke Master Mix 5 μL，引物F/R (10 μmol/L)各0.2 μL，模板DNA 0.5 μL，ddH2O補(bǔ)齊至10 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)25次；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物利用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 rBE3介導(dǎo)的多位點(diǎn)單堿基編輯

在創(chuàng)制突變體材料過程中，對其sgRNA (AAGATTATCCATCGTGA TGT，下劃線為PAM序列NGG) 的特異性進(jìn)行了評估，通過在水稻基因組數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blastn比對分析，檢索到基因中也含有該sgRNA序列，即通過該sgRNA可能同時對這兩個基因的靶位點(diǎn)堿基進(jìn)行編輯。因此，通過設(shè)計(jì)特異引物對突變體材料中基因的靶位點(diǎn)進(jìn)行了PCR擴(kuò)增和Sanger測序。結(jié)果顯示在12株T0代突變體材料中，檢測到了5株材料在基因的靶位點(diǎn)處發(fā)生了預(yù)期的堿基編輯事件。其中，突變體#419的和的靶位點(diǎn)堿基編輯方式均為G-16>A/WT (雜合突變，WT為野生型)；突變體#417的靶位點(diǎn)發(fā)生雜合突變 (G-16>A/WT)，而靶位點(diǎn)則為純合突變 (G-14TG-16>ATA) (見圖1和表2)。此外在靶位點(diǎn)處還檢測到2株材料發(fā)生Indel (插入或缺失) 現(xiàn)象 (見表2)。

2.2 rBE3介導(dǎo)的單堿基編輯脫靶分析

將的靶位點(diǎn)sgRNA序列 (AAGATTATCCATCG TGATGT，下劃線為PAM序列NGG) 對水稻全基因組序列進(jìn)行比對，獲得5個潛在脫靶位點(diǎn)，其中中的相似位點(diǎn)其5′端 (GCA) 不存在PAM序列NGG，故排除其為潛在脫靶位點(diǎn)的可能性；而其余4個位點(diǎn)均可能為脫靶位點(diǎn) (圖2)。因此分別對這4個潛在脫靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異引物，并以T0代突變體材料的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測序，在檢測的12株突變體材料中，均未檢測到潛在脫靶位點(diǎn)發(fā)生堿基編輯 (表2)。將的靶位點(diǎn)sgRNA序列 (CTTCTATGCATCTTCAACC，下劃線為PAM序列NGAC) 與水稻全基因組序列進(jìn)行比對分析，結(jié)果顯示未檢索出與其靶位點(diǎn)sgRNA相似的序列，即該sgRNA將特異地引導(dǎo)的靶位點(diǎn)堿基編輯，不存在潛在脫靶位點(diǎn)。

圖1 OsSERK1(D428N) T0代突變體#419和#417的兩個靶位點(diǎn)的測序結(jié)果

表2 OsSERK1(D428N) T0代突變體多位點(diǎn)堿基編輯和脫靶檢測

圖2 預(yù)測的潛在脫靶位點(diǎn)序列和靶位點(diǎn)序列比對分析

2.3 單堿基編輯突變體的遺傳穩(wěn)定性分析

2.4 單堿基編輯突變體后代外源T-DNA元件分離

為進(jìn)一步獲得無外源T-DNA插入元件的單堿基編輯突變體，利用引物-F1/R1和-F1/R1對#805和#22的T1植株進(jìn)行兩輪PCR檢測。結(jié)果顯示在T1代植株中篩選獲得了無外源T-DNA的材料 (圖4)。在22株#805 T1代植株中檢測出9株不含外源T-DNA，其中包含3株純合突變體和4株雜合突變體。在36株#22 T1代植株中檢測出9株不含外源T-DNA，其中僅包含2株雜合突變體。這表明在通過農(nóng)桿菌導(dǎo)入的外源T-DNA元件可以從突變體T1代中分離出去并可獲得無外源DNA片段的單堿基編輯突變體材料。

圖3 OsSERK1(D428N) #805 (左) 和pi-ta(S918F) #22 (右)突變體的T1代植株的靶位點(diǎn)測序結(jié)果

圖4 OsSERK1(D428N) #805 (A)和pi-ta(S918F) #22 (B) 突變體的T1代植株中潮霉素HptII和Cas9基因檢測

3 討論

CRISPR/Cas9技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種簡單、快速、高效的對基因定點(diǎn)編輯技術(shù)，廣泛應(yīng)用于微生物和動植物中[15-20]，其常見編輯類型有基因定點(diǎn)插入[21]、DNA片段缺失[22-23]、多位點(diǎn)突變[23-24]等，但對于實(shí)現(xiàn)單堿基編輯仍是難點(diǎn)且對其編輯的特異性和穩(wěn)定性缺乏了解。本課題組前期研究中將水稻密碼子優(yōu)化的APOBEC1和UGI與Cas9n、Cas9n (VQR) 融合構(gòu)建了一套新的rBE3、rBE4系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了在水稻基因組DNA中的單堿基編輯[8]，本研究對該系統(tǒng)單堿基編輯的脫靶現(xiàn)象和穩(wěn)定遺傳性進(jìn)行了研究。

本研究選擇了(rBE3) 和(rBE4) 兩個突變體材料進(jìn)行脫靶分析，通過在水稻基因組數(shù)據(jù)庫中將sgRNA進(jìn)行Blastn比對分析發(fā)現(xiàn)的sgRNA具有較好的特異性，并沒有發(fā)現(xiàn)潛在的脫靶位點(diǎn)；而的sgRNA序列不僅與一致，而且還具有其他的潛在脫靶位點(diǎn)，我們通過Sanger測序發(fā)現(xiàn)，在的12株T0代突變體植株中，有41.67%的植株實(shí)現(xiàn)了雙位點(diǎn)的單堿基編輯，但并沒有檢測到脫靶現(xiàn)象的發(fā)生。由于堿基編輯系統(tǒng)主要用來編輯一些具有重要功能的關(guān)鍵堿基，在設(shè)計(jì)sgRNA引物時的可選區(qū)域很受限制，因此可能會導(dǎo)致所用sgRNA的特異性差和編輯效率低的問題。同時rBE系統(tǒng)引入的堿基編輯多為雜合突變，即基因組仍會存在野生型序列。因此對于本研究中突變體在非目的區(qū)域處同時發(fā)生的堿基編輯的情況，經(jīng)T0代突變體自交分離后，在其后代中已成功篩選獲得僅含有突變的植株 (數(shù)據(jù)未顯示)。本研究中通過將sgRNA序列在水稻基因組數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blastn檢索潛在脫靶位點(diǎn)、PCR擴(kuò)增和Sanger測序?qū)0代突變體材料的潛在脫靶位點(diǎn)進(jìn)行分析，結(jié)果雖未檢測出脫靶現(xiàn)象的發(fā)生，但由于僅進(jìn)行Blastn檢索可能會遺漏其他可能相似的潛在脫靶位點(diǎn)和PCR擴(kuò)增會使以低頻率嵌合體存在的脫靶突變進(jìn)一步稀釋導(dǎo)致檢測不到脫靶發(fā)生，因此后期如果該材料進(jìn)一步用于遺傳育種時將會在全基因組層面進(jìn)行脫靶檢測。Kim等[25]利用Digenome-Seq技術(shù)對單堿基編輯系統(tǒng) (BE3) 在人HEK293T細(xì)胞系中的脫靶效應(yīng)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)BE3系統(tǒng)的脫靶位點(diǎn)遠(yuǎn)少于CRISPR/Cas9系統(tǒng)，具有很高的特異性。此外，對于相同sgRNA和脫靶導(dǎo)致的非目的位點(diǎn)突變還可通過與親本多次回交的方法進(jìn)行去除。這些結(jié)果表明rBE系統(tǒng)可以利用特異性的sgRNA產(chǎn)生特定堿基編輯的突變體材料。有趣的是，僅有2株T0代突變體材料在基因中檢測到了Indel事件的發(fā)生，這與Yuan等[9]研究類似，同時Lu等[6]研究表明BE3在植物出現(xiàn)Indel事件的幾率 (10%) 高于動物細(xì)胞。Indel事件可能是由于細(xì)胞內(nèi)基因組DNA修復(fù)途徑造成。Cas9n可以切割基因組DNA使其出現(xiàn)nicks，而sgRNA通常編輯DNA的一條鏈，而另一條鏈并沒有參與到基因編輯，但是在后續(xù)的DNA修復(fù)機(jī)制會同時對兩條DNA鏈進(jìn)行修復(fù)，這個修復(fù)過程可能會造成Indel事件的發(fā)生。這一事件的發(fā)生機(jī)制是否與靶位點(diǎn)區(qū)域內(nèi)外的序列有關(guān)暫時還不清楚。

相對于目前廣泛的基因功能缺失突變體材料的定制應(yīng)用，基因功能獲得性突變體材料的創(chuàng)制也具有重要意義。rBE系統(tǒng)所利用的單堿基編輯為植物基因功能獲得性突變體材料的定制提供了新的方向。因此，rBE系統(tǒng)的編輯事件是否能夠穩(wěn)定遺傳尤其重要。研究發(fā)現(xiàn)，和T0代植株自交后可以在T1代中分離出無T-DNA的純合突變體植株，這也表明利用rBE單堿基編輯系統(tǒng)產(chǎn)生的突變性狀可以穩(wěn)定遺傳給后代。

本研究結(jié)果顯示rBE系統(tǒng)可以利用特異性的sgRNA產(chǎn)生特定堿基突變的突變體材料，同時還可實(shí)現(xiàn)多位點(diǎn)突變，產(chǎn)生的堿基突變也能穩(wěn)定地遺傳給后代，表明rBE系統(tǒng)可以被用于定制基因功能獲得型水稻材料，對水稻基因的功能學(xué)研究具有巨大推動作用。

[1] Xiao A, Zhang B. Progress of new-generation genome editing mediated by engineered endonucleases. Chin J Biotech, 2015, 31(6): 917–928 (in Chinese). 肖安, 張博. 人工核酸內(nèi)切酶介導(dǎo)的新一代基因組編輯技術(shù)進(jìn)展. 生物工程學(xué)報, 2015, 31(6): 917–928.

[2] Yan F, Zhou HB. Overviews and applications of the CRISPR/Cas9 system in plant functional genomics and creation of new plant germplasm. Sci Sin Vitae, 2016, 46(5): 498–513 (in Chinese). 嚴(yán)芳, 周煥斌. CRISPR/Cas9技術(shù)在植物基因功能研究和新種質(zhì)創(chuàng)制中的應(yīng)用與展望. 中國科學(xué): 生命科學(xué), 2016, 46(5): 498–513.

[3] Sun YW, Zhang X, Wu CY, et al. Engineering herbicide-resistant rice plants through CRISPR/Cas9-mediated homologous recombination of acetolactate synthase. Mol Plant, 2016, 9(4): 628–631.

[4] Li J, Meng XB, Zong Y, et al. Gene replacements and insertions in rice by intron targeting using CRISPR-Cas9. Nat Plants, 2016, 2(10): 16139.

[5] Komor AC, Kim YB, Packer MS, et al. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature, 2016, 533(7603): 420–424.

[6] Lu YM, Zhu JK. Precise editing of a target base in the rice genome using a modified CRISPR/Cas9 system. Mol Plant, 2017, 10(3): 523–525.

[7] Li JY, Sun YW, Du JL, et al. Generation of targeted point mutations in rice by a modified CRISPR/Cas9 system. Mol Plant, 2017, 10(3): 526–529.

[8] Ren B, Yan F, Kuang YJ, et al. A CRISPR/Cas9 toolkit for efficient targeted base editing to induce genetic variations in rice. Sci China Life Sci, 2017, 60(5): 516–519.

[9] Zong Y, Wang YP, Li C, et al. Precise base editing in rice, wheat and maize with a Cas9-cytidine deaminase fusion. Nat Biotechnol, 2017, 35(5): 438–440, doi: 10.1038/nbt.3811.

[10] Chen YY, Wang ZP, Ni HW, et al. CRISPR/Cas9-mediated base-editing system efficiently generates gain-of-function mutations in. Sci China Life Sci, 2017, 60(5): 520–523, doi: 10.1007/s11427-017-9021-5.

[11] Shimatani Z, Kashojiya S, Takayama M, et al. Targeted base editing in rice and tomato using a CRISPR-Cas9 cytidine deaminase fusion. Nat Biotechnol, 2017, 35(5): 441–443, doi: 10.1038/nbt.3833.

[12] Kleinstiver BP, Prew M, Tsai SQ, et al. Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities. Nature, 2015, 523(7561): 481–485.

[13] Hu XX, Wang C, Fu YP, et al. Expanding the range of CRISPR/Cas9 genome editing in rice. Mol plant, 2016, 9(6): 943–945.

[14] Porebski S, Bailey LG, Baum BR. Modification of a CTAB DNA extraction protocol for plants containing high polysaccharide and polyphenol components. Plant Mol Biol Rep, 1997, 15(1): 8–15.

[15] Jiang WY, Bikard D, Cox D, et al. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nat Biotechnol, 2013, 31(3): 233–239.

[16] Fang YF, Tyler BM. Efficient disruption and replacement of an effector gene in the oomyceteusing CRISPR/Cas9. Mol Plant Pathol, 2016, 17(1): 127–139.

[17] Arazoe T, Miyoshi K, Yamato T, et al. Tailor-made CRISPR/Cas system for highly efficient targeted gene replacement in the rice blast fungus. Biotechnol Bioeng, 2015, 112(12): 2543–2549.

[18] Chang NN, Sun CH, Gao L, et al. Genome editing with RNA-guided Cas9 nuclease in zebrafish embryos. Cell Res, 2013, 23(4): 465–472.

[19] Mali P, Yang LH, Esvelt KM, et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science, 2013, 339(6121): 823–826.

[20] Shan QW, Wang YP, Li J, et al. Targeted genome modification of crop plants using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol, 2013, 31(8): 686–688.

[21] Auer TO, del Bene F. CRISPR/Cas9 and TALEN-mediated knock-in approaches in zebrafish. Methods, 2014, 69(2): 142–150.

[22] Essletzbichler P, Konopka T, Santoro F, et al. Megabase-scale deletion using CRISPR/Cas9 to generate a fully haploid human cell line. Genome Res, 2014, 24(12): 2059–2065.

[23] Xie KB, Minkenberg B, Yang YN. Boosting CRISPR/Cas9 multiplex editing capability with the endogenous tRNA-processing system. Proc Natl Acad Sci USA, 2015, 112(11): 3570–3575.

[24] Shen L, Hua YF, Fu YP, et al. Rapid generation of genetic diversity by multiplex CRISPR/Cas9 genome editing in rice. Sci China Life Sci, 2017, 60(5): 506–515.

[25] Kim D, Lim K, Kim ST, et al. Genome-wide target specificities of CRISPR RNA-guided programmable deaminases. Nat Biotechnol, 2017, 35(5): 475–480.

(本文責(zé)編 郝麗芳)

Specificity and inheritance of rBE3 and rBE4 endonuclease-induced gene modifications in rice

Bin Ren1,2*, Fang Yan1*, Yongjie Kuang1, Na Li1, Dawei Zhang2, Honghui Lin2, and Huanbin Zhou1

1 State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China 2 Ministry of Education Key Laboratory of Bio-Resource and Eco-Environment, College of Life Sciences, Sichuan University, Chengdu 610065, Sichuan, China

To gain more insights into the rice base editor (rBE3 and rBE4), we evaluated the mutation efficiency, off-target and inheritance ofandgenes modified with rBE endonucleases. We predicted and analyzed the putative off-target sites of the sgRNA designed forandby PCR amplification and Sanger sequencing. Then we further characterized the inheritance and stability of targeted base mutations and T-DNA segregation in the progeny of the self-fertilized T0 plants. Analysis of the DNA sequencing data of T0 plantsof) revealed no nucleotide change at any of the four potential off-target sites. Forandcarry the same sgRNA targeting sites, base substitution at both two loci were detected at a frequency of 41.67%. The targeted base mutations could be transmitted readily to T1 progeny. Furthermore, genetic segregation caused the loss of T-DNA at a frequency between 25.0% and 40.9% in the T1 transgenic plants ofand. These results demonstrated that the rBE3 and rBE4 systems could mediate specifically targeted base editing in one- or multi-site, and the targeted base editing could be stably inherited to next generation.

CRISPR/Cas9n, rat APOBEC1, off-target, T-DNA segregation, rice

April 25, 2017;

August 28, 2017

Honghui Lin. Tel: +86-28-85411792; Fax: +86-28-85415300; E-mail: hhlin@scu.edu.cn Huanbin Zhou. Tel: +86-10-62815914; Fax: +86-10-62894642; E-mail: hbzhou@ippcaas.cn

Supported by:The Agricultural Science and Technology Innovation Program of The Chinese Academy of Agricultural Sciences and Open Project of State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection.

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程和植物病蟲害國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金資助。

2017-09-06

*These authors contributed equally to this work.

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20170906.1057.002.html

周煥斌 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所研究員，博士生導(dǎo)師。主要從事各種不同用途基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)在水稻等主要農(nóng)作物的研發(fā)與應(yīng)用，借助其深度探討水稻與病原菌互作的分子機(jī)制，發(fā)掘重要基因資源，并加以組合修飾，獲得無生物安全風(fēng)險的基因編輯材料，服務(wù)于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。已在、、、等SCI雜志上發(fā)表文章10篇，被引用達(dá)600多次。