王春，王克劍

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CRISPR-Cas系統(tǒng)在植物基因組編輯中的研究進(jìn)展

王春，王克劍

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院中國水稻研究所水稻生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州 310006

王春, 王克劍. CRISPR-Cas系統(tǒng)在植物基因組編輯中的研究進(jìn)展. 生物工程學(xué)報(bào), 2017, 33(10): 1712–1722.Wang C, Wang KJ. Advances in CRISPR-Cas-mediated genome editing system in plants. Chin J Biotech, 2017, 33(10): 1712–1722.

基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)是研究基因功能和生物體改造的重要工具。CRISPR-Cas (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats and CRISPR-associated proteins) 系統(tǒng)是近年來發(fā)展的一種新型基因組編輯技術(shù)，該技術(shù)通過一段向?qū)NA和配套的核酸酶就可對(duì)特定的基因組序列進(jìn)行定點(diǎn)編輯，具有簡單高效、應(yīng)用廣泛的特點(diǎn)，受到了生物學(xué)家的廣泛關(guān)注。本文著重介紹CRISPR-Cas系統(tǒng)在植物中的研究進(jìn)展，包括CRISPR-Cas9系統(tǒng)在植物中的應(yīng)用與完善、擴(kuò)大基因組編輯范圍的研究、Cas9切口酶和失活酶的拓展、特異性單堿基突變編輯系統(tǒng)的研究、無外源DNA污染的植物基因編輯技術(shù)的發(fā)展以及基因組編輯技術(shù)在作物育種上的應(yīng)用等方面。同時(shí)也提出了還需解決的問題，并展望了基因組編輯系統(tǒng)在作物育種中的應(yīng)用前景，為開展這一領(lǐng)域的研究工作提供參考。

CRISPR-Cas系統(tǒng)，基因組編輯，植物基因組，作物遺傳育種

隨著測序技術(shù)的進(jìn)步和測序成本的降低，越來越多物種的全基因組已經(jīng)被測序，如何解析基因功能并利用這些研究結(jié)果改造生物體已成為下一步的研究目標(biāo)?；蚪M編輯技術(shù)是實(shí)現(xiàn)以上目標(biāo)的重要研究手段，它突破了之前特定突變體生物材料獲得困難的限制，并盡可能小地降低了對(duì)受體基因組背景的影響，對(duì)生物領(lǐng)域的發(fā)展與應(yīng)用有著重要意義。

鋅指核酸酶 (Zinc-finger nucleases，ZFNs)和類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶 (Transcription activator-like effector nucleases，TALENs) 最先被應(yīng)用于基因組定點(diǎn)編輯[1-3]。這兩個(gè)核酸酶由識(shí)別特異DNA序列的蛋白與非特異性的核酸內(nèi)切酶融合組成，可以發(fā)揮基因組定點(diǎn)切割的功能。但由于這兩項(xiàng)技術(shù)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的改造組裝復(fù)雜且成本高，不利于廣泛推廣應(yīng)用。最近，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)了一種新的CRISPR-Cas (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats and CRISPR-associated proteins) 基因組編輯技術(shù)，該技術(shù)通過一段向?qū)NA和配套的核酸酶對(duì)特定的基因組序列進(jìn)行定點(diǎn)編輯，具有簡單高效的優(yōu)點(diǎn)，在短短幾年時(shí)間內(nèi)，已被廣泛地用于基礎(chǔ)科學(xué)研究、人類基因治療與作物遺傳育種等領(lǐng)域。

本文結(jié)合部分在動(dòng)物及人類中的研究結(jié)果，主要介紹在植物中最常用的CRISPR-Cas9系統(tǒng)的研究和應(yīng)用，CRISPR-Cas各種改造和升級(jí)版本在植物基因功能研究上的拓展應(yīng)用，以及基因組編輯技術(shù)在作物育種上的應(yīng)用成果，為開展這一領(lǐng)域的研究工作提供參考。

1 CRISPR-Cas9系統(tǒng)的研究歷史及在植物中的應(yīng)用

日本科學(xué)家最早在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)一段由長度為29 bp的重復(fù)片段(Repeats) 和32–33 bp (Spacers)的非重復(fù)片段間隔相連的重復(fù)序列[4]。后來，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)這種重復(fù)序列廣泛存在于細(xì)菌和古細(xì)菌基因組中，并將其命名為規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)。之后的研究表明，CRISPR位點(diǎn)表達(dá)與入侵病毒基因組序列相匹配的小分子RNA，通過互補(bǔ)序列結(jié)合病毒基因組，引導(dǎo)相關(guān)核酸酶復(fù)合體切割病毒DNA，阻止病毒入侵，為原核生物提供了對(duì)抗噬菌體等外源基因的獲得性免疫能力[5-6]。

2012年，Jinek等[7]發(fā)現(xiàn)Ⅱ型CRISPR系統(tǒng)組成較為簡單，只需依賴1個(gè)Cas9核酸酶及2個(gè)RNA (crRNA，tracrRNA) 就可以切割目的雙鏈DNA，并發(fā)現(xiàn)把tracrRNA和crRNA人工改造整合為一個(gè)RNA轉(zhuǎn)錄本時(shí)，也能引導(dǎo)Cas9蛋白識(shí)別靶序列并引起DNA序列雙鏈斷裂 (Double-strand breaks，DSBs)，為此后RNA介導(dǎo)的基因編輯奠定了基礎(chǔ)。隨后，基于Ⅱ型CRISPR-Cas9系統(tǒng)，Church實(shí)驗(yàn)室在多種人類細(xì)胞系中[8]，張峰實(shí)驗(yàn)室在人類及小鼠細(xì)胞中[9]，成功獲得了預(yù)期的非同源末端連接 (Non-homologousend joining，NHEJ) 或同源重組介導(dǎo)的修復(fù)(Homology-directed repair，HDR) 方式產(chǎn)生的基因定點(diǎn)突變。CRISPR-Cas9基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)的開發(fā)，使得多個(gè)基因的敲除及敲入變得更為簡單高效，很快就形成了研究熱潮。

經(jīng)過改造的CRISPR-Cas9系統(tǒng)也迅速地被應(yīng)用到植物基因組編輯研究中。2013年8月8日，同時(shí)報(bào)道了3個(gè)不同實(shí)驗(yàn)室在重要農(nóng)作物及模式植物中的研究進(jìn)展：Shan等[10]通過基因槍的方式傳遞CRISPR-Cas9系統(tǒng)，在水稻和小麥中進(jìn)行了定點(diǎn)修飾；Li等[11]報(bào)道了在擬南芥、煙草等物種中成功應(yīng)用CRISPR-Cas9進(jìn)行基因修飾；Nekrasov等[12]利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)在模式植物本生煙中實(shí)現(xiàn)了基因組的定點(diǎn)突變。此外，F(xiàn)eng等[13]報(bào)道在模式植物擬南芥和水稻中利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了定點(diǎn)突變；Miao等[14]通過密碼子優(yōu)化Cas9蛋白在水稻中高效獲得了葉綠素合成基因和分蘗夾角控制基因突變的植株。

隨后，多個(gè)實(shí)驗(yàn)室對(duì)CRISPR-Cas9系統(tǒng)在植物中的應(yīng)用進(jìn)行了進(jìn)一步完善。Ma等[15]采用Gibson或Golden Gate Cloning方法將多個(gè)gRNA及Cas9序列組裝至一個(gè)雙元載體，構(gòu)建了適用于單子葉和雙子葉植物的多重基因組編輯CRISPR-Cas9載體系統(tǒng)。Xie等[16]將tRNA和gRNA嵌合在一起，利用tRNA的切割在植物體內(nèi)游離出多個(gè)gRNA，開發(fā)了一套從一個(gè)多順反子基因生成大量gRNA的通用策略，在水稻中完成了多基因的同時(shí)編輯。本課題組[17]基于同尾酶的特性，設(shè)計(jì)了一套只包含兩個(gè)質(zhì)粒的gRNA拼接系統(tǒng)，通過傳統(tǒng)的酶切連接方式，實(shí)現(xiàn)多個(gè)gRNA元件的快速組裝，該系統(tǒng)理論上可以實(shí)現(xiàn)無限個(gè)gRNA的組裝，具有簡單、穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)；在此基礎(chǔ)上，我們構(gòu)建了一個(gè)雙元載體，對(duì)8個(gè)水稻農(nóng)藝性狀相關(guān)基因同時(shí)進(jìn)行了編輯，T0代就獲得了8個(gè)基因同時(shí)敲除的突變體[18]。

轉(zhuǎn)化擬南芥通常采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的沾花法，胚囊是轉(zhuǎn)基因插入的主要目標(biāo)，而普遍采用的CaMV 35S啟動(dòng)子在生殖細(xì)胞中活性極低，因此，由于轉(zhuǎn)化方式的不同，用CaMV 35S驅(qū)動(dòng)的Cas9在擬南芥基因組的編輯效率明顯低于水稻，并且絕大多數(shù)T1植株只是體細(xì)胞突變，并不能遺傳到T2代。Yan等[19]利用在胚、胚囊、胚乳以及花粉中有很高表達(dá)量的啟動(dòng)子，Wang等[20]利用卵細(xì)胞特異的啟動(dòng)子，Mao等[21]利用配子體時(shí)期表達(dá)的啟動(dòng)子來驅(qū)動(dòng)Cas9在胚時(shí)期特異表達(dá)，大大提高了擬南芥在T1代的基因突變頻率，有效解決了CRISPR/Cas9在擬南芥的轉(zhuǎn)基因T1代株系基因突變頻率低、誘導(dǎo)得到的主要是嵌合體的難題。

到目前為止，包括擬南芥、煙草、水稻、玉米、小麥等模式植物及一些作物在內(nèi)，均已報(bào)道成功獲得了較高的突變率及可穩(wěn)定遺傳的基因組編輯植株[22]。

2 改造開發(fā)CRISPR-Cas系統(tǒng)擴(kuò)大基因組編輯范圍的研究

2.1 Cas9變體

除了需要gRNA對(duì)目標(biāo)序列進(jìn)行20 bp左右的特異匹配，CRISPR-Cas9系統(tǒng)在基因組上的精準(zhǔn)切割還需要識(shí)別一段靶DNA附近、稱作前間區(qū)序列鄰近基序(Protospacer adjacent motif，PAM) 的特異核苷酸序列。最常用的Cas9來自于產(chǎn)膿鏈球菌，被稱為SpCas9。SpCas9能夠識(shí)別的PAM序列主要為NGG，這限制了CRISPR-Cas9系統(tǒng)在基因組上的可編輯范圍。為突破這個(gè)限制，Kleinstiver等[23]建立了一個(gè)工程系統(tǒng)，使得能夠快速地演化SpCas9識(shí)別不同PAM序列的能力。通過收集隨機(jī)突變的SpCas9變體，篩選到了使得SpCas9能夠識(shí)別新PAM序列的突變組合。

根據(jù)細(xì)菌中的研究結(jié)果，本課題組在水稻中，通過定點(diǎn)突變的方法對(duì)SpCas9蛋白進(jìn)行改造，獲得兩種SpCas9變體(VQR和VRER)[24]。通過一系列的轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)證明，VQR和VRER這兩種變體在水稻中分別可以識(shí)別NGA以及NGCG兩個(gè)PAM序列。生物信息學(xué)分析表明Cas9變體的創(chuàng)制將使得CRISPR-Cas9系統(tǒng)在水稻中可編輯范圍拓展到現(xiàn)有的2倍以上。此外，兩種變體也可以同時(shí)對(duì)多基因進(jìn)行有效的編輯，表明其與野生型Cas9一樣具備巨大的應(yīng)用潛力，為在水稻中進(jìn)行更廣泛的基因組編輯提供了新的可選工具。

2.2 CRISPR-Cpf1系統(tǒng)

Zetsche等[25]通過生物信息學(xué)手段發(fā)現(xiàn)了新的Ⅴ型CRISPR基因編輯系統(tǒng)CRISPR-Cpf1 (CRISPR fromand1)。與CRISPR-Cas9系統(tǒng)相比，CRISPR-Cpf1具有以下優(yōu)點(diǎn)：1) Cpf1是一個(gè)比Cas9更小、更簡單的核酸內(nèi)切酶，僅通過一段較短的crRNA識(shí)別目的DNA底物，更易于操作；2) CRISPR-Cpf1識(shí)別的PAM序列是連續(xù)的2個(gè)或3個(gè)胸腺嘧 啶 (T)，這將大大擴(kuò)展基因組編輯范圍；3) CRISPR-Cpf1剪切目的DNA造成的是粘性末端，預(yù)計(jì)有助于目標(biāo)序列的精確插入和同源重組替換，能夠更有效及精確地整合一段DNA；4) Cpf1不僅切割DNA，而且也切割RNA，表現(xiàn)出雙重切割活性，利于多基因敲除的載體 構(gòu)建[26-27]。

在植物中，科學(xué)家同樣檢測了CRISPR-Cpf1的基因編輯功能。本課題組[28]對(duì)兩種Cpf1，即來源于毛螺科菌ND2006ND2006的Cpf1 (LbCpf1) 和氨基酸球菌屬BV3L6sp. BV3L6的Cpf1 (AsCpf1)進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，同時(shí)配套以適于Cpf1作用的crRNA表達(dá)系統(tǒng)，構(gòu)建載體對(duì)水稻基因組中的多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行靶向切割。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示LbCpf1能夠完成對(duì)水稻基因組的有效編輯，但未檢測到AsCpf1的基因編輯能力。Xu等[29]和Tang等[30]同樣報(bào)道了LbCpf1在水稻中的基因編輯能力。Endo等[31]報(bào)道在水稻和煙草用弗朗西斯菌Cpf1 (FnCpf1) 進(jìn)行了基因敲除。Kim等[32]將LbCpf1或AsCpf1和crRNA在體外組裝完成后導(dǎo)入大豆和煙草的原生質(zhì)體中，成功對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行了編輯。最近，Wang等[33]發(fā)現(xiàn)FnCpf1和LbCpf1只需一條非常短的20–21 bp的直接重復(fù)序列 (Direct repeats，DR) 加上22–24 bp的靶位點(diǎn)識(shí)別序列 (Guide) 即可實(shí)現(xiàn)單基因敲除；把多個(gè)DR-guide單元直接串聯(lián)，只需要一個(gè)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)即可簡單高效地實(shí)現(xiàn)多基因敲除。該系統(tǒng)在載體構(gòu)建上比CRISPR-Cas9系統(tǒng)更加簡單易行。短期內(nèi)大量的研究結(jié)果表明，CRISPR-Cpf1在植物基因組編輯上具有廣闊的應(yīng)用前景。

2.3 其他CRISPR-Cas9系統(tǒng)

除了SpCas9，還有一些不同來源的CRISPR-Cas系統(tǒng)，也具有基因編輯能力。通過比較基因組，科學(xué)家們?cè)?00個(gè)Cas9同源序列中找到了一個(gè)較小的Cas9蛋白——一種來自金黃色葡萄球菌的Cas9核酸酶(SaCas9)，它比SpCas9小25%，且和SpCas9具有相當(dāng)?shù)腄NA靶向精確度[34]。SaCas9與其配套的gRNA識(shí)別的PAM序列為NNGRRT。此外，還有一個(gè)來自嗜熱乳鏈球菌的Cas9 (St1Cas9)，識(shí)別的PAM序列為NNAGAA[35-36]。這些SpCas9同源蛋白的發(fā)現(xiàn)，為基因編輯及調(diào)控提供了更多選擇，同時(shí)也擴(kuò)大了基因組編輯范圍。Steinert等[37]報(bào)道經(jīng)密碼子優(yōu)化的SaCas9和St1Cas9在擬南芥中具有較高的基因編輯效率。

3 Cas9切口酶和失活酶的拓展應(yīng)用

Cas9蛋白有RuvC和HNH兩個(gè)核酸切割結(jié)構(gòu)域，將這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域中的任一關(guān)鍵殘基轉(zhuǎn)換成丙氨酸 (D10A或H840A)，就獲得只對(duì)DNA單鏈進(jìn)行切割的切口酶nickase Cas9 (nCas9)；將這兩個(gè)催化活性位點(diǎn)都突變，就可得到仍能與sgRNA結(jié)合識(shí)別特異靶位點(diǎn)但不會(huì)對(duì)目標(biāo)序列進(jìn)行切割的失活Cas9蛋白dead Cas9 (dCas9)。

Ran等[38]在人類細(xì)胞中，運(yùn)用2條相近的gRNA引導(dǎo)一對(duì)nCas9分別在DNA兩條鏈上形成缺口，造成DNA雙鏈斷裂從而產(chǎn)生突變，大大降低了單個(gè)Cas9造成的脫靶率。Chen等[39]將綠色熒光蛋白 (GFP) 與dCas9融合，利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)的基因定位功能來研究基因組特定區(qū)段的染色體結(jié)構(gòu)。dCas9通過融合具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能的轉(zhuǎn)錄激活因子或轉(zhuǎn)錄抑制因子，可以作為調(diào)控基因表達(dá)水平的控制元件，形成研究基因表達(dá)調(diào)控的有效工具[40]，在植物中同樣有效[41]。此外，還可以融合諸如乙?；?、甲基化酶等功能元件，開發(fā)出許多基因調(diào)控及修飾的工具[42-44]。

4 特異性單堿基突變編輯系統(tǒng)的研究

核苷酸點(diǎn)突變是作物許多重要農(nóng)藝性狀發(fā)生變異的遺傳基礎(chǔ)。大多數(shù)時(shí)候科學(xué)家希望通過引入單堿基突變?cè)斐砂被岬淖兓_(dá)到基因功能的增強(qiáng)或減弱，而不是單純地敲除基因功能。由于目前定向同源修復(fù) (HDR) 的編輯效率低，特異性單堿基突變編輯系統(tǒng)的研究就十分必要。

Komor等[45]報(bào)道，將nCas9 (nCas9-D10A)融合大鼠胞嘧啶脫氨酶 (rAPOBEC1) 和尿嘧啶糖基化酶抑制劑 (UGI)，構(gòu)成了高效的單堿基編輯系統(tǒng)BE3 (APOBEC-XTEN-nCas9 (D10A)-UGI)。在人細(xì)胞系和小鼠細(xì)胞系中，利用該系統(tǒng)將堿基胞嘧啶 (C) 轉(zhuǎn)化為堿基尿嘧啶 (U)，隨后在一輪DNA復(fù)制中，這種尿嘧啶 (U)被轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶 (T)，最終實(shí)現(xiàn)PAM窗口前–11 bp至–17 bp靶序列內(nèi)C至T的替換(圖1)。此外，Nishida等[46]報(bào)道，通過將nCas9-D10A與七鰓鰻 (Sea lamprey) 的胞苷脫氨酶 (Activation- induced cytidine deaminase，AID) 融合表達(dá)，也同樣實(shí)現(xiàn)PAM窗口前–19 bp至–16 bp靶序列內(nèi)C至T的替換。Kim等[47]通過融合Cas9變體或SaCas9，增加了CRISPR基因靶向的范圍，而且將編輯框從5個(gè)核苷酸縮小到1–2個(gè)核苷酸，增加了堿基編輯的精確度。

圖1 特異性單堿基突變編輯示意圖

借鑒哺乳動(dòng)物單堿基編輯方法，Li[48]和Lu[49]率先報(bào)道在水稻中利用BE3系統(tǒng)成功實(shí)現(xiàn)了單堿基編輯。同樣利用該系統(tǒng)，Ren等[50]在水稻中，Chen等[51]在擬南芥中，Zong等[52]在三大重要農(nóng)作物 (小麥、水稻和玉米) 基因組中都實(shí)現(xiàn)了高效、精確的單堿基定點(diǎn)突變。Shimatani等[53]則利用AID系統(tǒng)在番茄和水稻中實(shí)現(xiàn)了單堿基編輯。單堿基編輯系統(tǒng)的成功建立和應(yīng)用，為高效和大規(guī)模創(chuàng)制單堿基突變體提供了一個(gè)可靠方案，為作物遺傳改良和新品種培育提供了重要技術(shù)支撐。但是該編輯系統(tǒng)不僅受到PAM和編輯窗口的限制，還受到只能由C替換為A的限制，目前還不能做到基因組上任意位點(diǎn)的單堿基精準(zhǔn)編輯。

5 無外源DNA污染的植物基因編輯技術(shù)應(yīng)用

常規(guī)植物基因組編輯手段多通過農(nóng)桿菌或基因槍的方法將CRISPR-Cas9 DNA表達(dá)框轉(zhuǎn)入并整合到植物基因組中，進(jìn)而發(fā)揮功能對(duì)目的基因進(jìn)行編輯。盡管通過后代分離方可獲得無CRISPR-Cas9 DNA的植物突變體，但依然存在外源DNA污染的風(fēng)險(xiǎn)。Woo等[54]嘗試將Cas9蛋白和gRNA在體外組裝成核糖核蛋白復(fù)合體 (RNP)，再通過PEG轉(zhuǎn)化法將RNP轉(zhuǎn)入水稻、生菜、煙草等植物原生質(zhì)體，成功對(duì)目的基因進(jìn)行了編輯，并且通過原生質(zhì)體再生，T0代就獲得了無任何外源DNA殘留的定點(diǎn)編輯成功的生菜植株，為如何避免轉(zhuǎn)基因成分殘留提供了新思路。

同樣，Liang等[55]利用基因槍法將CRISPR-Cas9 RNP轉(zhuǎn)入小麥細(xì)胞中，在兩個(gè)六倍體小麥品種中分別對(duì)兩個(gè)不同基因和進(jìn)行了定點(diǎn)編輯，成功地在小麥中建立了全程無外源DNA的基因組編輯體系。與此同時(shí)，CRISPR-Cas9的RNP可以明顯降低脫靶效應(yīng)。這種DNA-free的基因組編輯方法具有精準(zhǔn)、特異、簡單易行、成本低廉的優(yōu)勢，并且成功避免了外源DNA片段整合到基因組中的潛在風(fēng)險(xiǎn)。這一利用CRISPR-Cas9 RNP實(shí)現(xiàn)小麥基因組編輯的方法有助于最大程度地減少監(jiān)管，建立起精準(zhǔn)、生物安全的新一代育種技術(shù)體系，加快作物基因組編輯育種產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。

6 基因組編輯技術(shù)在作物育種上的應(yīng)用

植物基因組編輯技術(shù)已經(jīng)為我們創(chuàng)造了一些之前很難獲得的新品種。例如，在異源六倍體小麥中，存在3個(gè)白粉病感病基因拷貝，通過傳統(tǒng)的育種手段，幾乎拿不到這3個(gè)拷貝同時(shí)突變的抗病材料。Wang等[56]利用基因組編輯技術(shù)，首次在六倍體小麥中對(duì)基因的3個(gè)拷貝同時(shí)進(jìn)行了突變，獲得了對(duì)白粉病具有廣譜抗性的小麥材料，在小麥農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有重大意義。Zhou等[57]在水稻中通過CRISPR-Cas9系統(tǒng)敲除溫敏型雄性不育 () 基因，開發(fā)了11個(gè)新的雄性不育品系，僅在一年內(nèi)就可以應(yīng)用于兩個(gè)水稻亞種的雜交育種，不僅顯著加快了不育系的培育過程，而且也有利于雜種優(yōu)勢的利用。Shi等[58]在玉米中利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)改造乙烯反應(yīng)的負(fù)調(diào)控因子基因的啟動(dòng)子區(qū)域，獲得了新的抗旱玉米品種。

賓夕法尼亞大學(xué)的楊亦農(nóng)實(shí)驗(yàn)室利用CRISPR-Cas9技術(shù)，在白蘑菇中將容易引起褐變的多酚氧化酶 (PPO) 的編碼基因敲除了1個(gè)，將該酶活性降低了30%，從而獲得了不易褐變的白蘑菇。美國杜邦先鋒公司通過CRISPR-Cas9技術(shù)敲除控制直鏈淀粉合成的基因獲得了糯玉米新品種。美國農(nóng)業(yè)部于2016年4月批文，表示無需對(duì)基因編輯技術(shù)改造的這兩例農(nóng)作物進(jìn)行監(jiān)管，意味著得到美國政府上市許可的基因組編輯生物可以直接用于種植和銷售，無需額外的監(jiān)管程序，為基因編輯技術(shù)用于農(nóng)產(chǎn)品的商業(yè)生產(chǎn)帶來了光明前景[59]。

與此同時(shí)，在作物育種上應(yīng)用基因編輯技術(shù)也需要嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)。本課題組對(duì)水稻產(chǎn)量數(shù)量性狀基因(Quantitative trait locus，QTL) 進(jìn)行定點(diǎn)編輯研究時(shí)，發(fā)現(xiàn)在不同遺傳背景的水稻中進(jìn)行QTL編輯會(huì)產(chǎn)生不同的產(chǎn)量變化[60]。該研究結(jié)果顯示，對(duì)特定性狀進(jìn)行編輯時(shí)，在不同的遺傳背景下可能會(huì)得到不一樣的結(jié)果。

7 結(jié)語與展望

基因組編輯技術(shù)是繼轉(zhuǎn)基因技術(shù)之后在生物遺傳操作領(lǐng)域的又一革命性技術(shù)。短短幾年時(shí)間的發(fā)展，基于CRISPR-Cas9系統(tǒng)的基因編輯技術(shù)已經(jīng)在植物基礎(chǔ)生物學(xué)研究及作物育種上顯現(xiàn)出了巨大的應(yīng)用潛力，解決了許多之前由于無法獲得定點(diǎn)突變材料造成的難題，也已經(jīng)創(chuàng)造了一些優(yōu)良品種。與轉(zhuǎn)基因品種不同，通過基因組編輯技術(shù)得到的品種不引入外源基因，具有與常規(guī)誘變品種無異的優(yōu)點(diǎn)，因此在作物改良的生產(chǎn)應(yīng)用上更為安全?？梢灶A(yù)見，基因組編輯技術(shù)在作物育種上具有十分廣闊的應(yīng)用前景。

與此同時(shí)，還存在多個(gè)急需克服的難題。目前基因組編輯技術(shù)主要是產(chǎn)生內(nèi)源基因功能缺失的突變體，對(duì)植物內(nèi)源基因進(jìn)行更為精確的修飾，如基因定點(diǎn)替換以及基因的定點(diǎn)插入等，仍然具有極大的挑戰(zhàn)性。對(duì)基因定點(diǎn)替換及基因的定點(diǎn)插入在植物中也有研究報(bào)道：Li等[61]在水稻中利用非同源末端連接修復(fù)方式在水稻中建立了基于CRISPR-Cas9技術(shù)的基因替換以及基因定點(diǎn)插入體系，對(duì)5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶基因() 進(jìn)行了定點(diǎn)替換，獲得了抗草甘膦除草劑的水稻；Sun等[62]通過提供外源DNA供體利用同源重組修復(fù)對(duì)乙酰乳酸合酶基因() 進(jìn)行了定點(diǎn)替換，獲得了抗嘧啶羧酸類除草劑的水稻；Wang等[63]利用雙生病毒在植物體內(nèi)的復(fù)制擴(kuò)增DNA的能力，結(jié)合CRISPR-Cas9系統(tǒng)，在水稻中將帶有潮霉素抗性的一段序列插入了特定的位置。然而，在植物中進(jìn)行插入或替換的工作仍然受限于獲得抗除草劑或其他抗性性狀，目前尚無法做到在基因組內(nèi)任一位點(diǎn)上高效地替換或插入任意序列，這限制了基因組編輯技術(shù)在植物基因組學(xué)研究和農(nóng)作物分子設(shè)計(jì)育種中的應(yīng)用。我們相信在不久的將來，隨著基因組編輯技術(shù)的不斷發(fā)展，這些問題會(huì)逐步被解決，將有助于人們更好地了解植物基因的功能并創(chuàng)造新的優(yōu)良品種。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Advances in CRISPR-Cas-mediated genome editing system in plants

Chun Wang, and Kejian Wang

State Key Laboratory of Rice Biology, China National Rice Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310006, Zhejiang, China

Targeted genome editing technology is an important tool to study the function of genes and to modify organisms at the genetic level. Recently, CRISPR-Cas (clustered regularly interspaced short palindromic repeats and CRISPR-associated proteins) system has emerged as an efficient tool for specific genome editing in animals and plants. CRISPR-Cas system uses CRISPR-associated endonuclease and a guide RNA to generate double-strand breaks at the target DNA site, subsequently leading to genetic modifications. CRISPR-Cas system has received widespread attention for manipulating the genomes with simple, easy and high specificity. This review summarizes recent advances of diverse applications of the CRISPR-Cas toolkit in plant research and crop breeding, including expanding the range of genome editing, precise editing of a target base, and efficient DNA-free genome editing technology. This review also discusses the potential challenges and application prospect in the future, and provides a useful reference for researchers who are interested in this field.

CRISPR-Cas system, genome editing, plant genomes, crop genetics and breeding

April 24, 2017;

June 27, 2017

Kejian Wang. Tel/Fax: +86-571-63370202; E-mail:wangkejian@caas.cn

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 3140101312), Agricultural Science and Technology Innovation Program of Chinese Academy of Agricultural Sciences.

國家自然科學(xué)基金 (No. 3140101312)，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程資助。

2017-09-06

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20170906.1052.001.html

王克劍 研究員，博士生導(dǎo)師?，F(xiàn)任中國水稻研究所基因資源挖掘與利用研究室課題組長、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程“水稻染色體工程及基因組編輯”首席科學(xué)家。2004年本科畢業(yè)于揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)學(xué)系；2009年于中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所遺傳學(xué)專業(yè)獲得博士學(xué)位；2009–2013年在中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所先后任助理研究員、副研究員。目前主要從事基因組編輯以及遺傳重組的研究。已發(fā)表SCI論文28篇，其中第一作者論文5篇，通訊作者論文8篇。2014年獲得中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院首批“青年英才計(jì)劃”擇優(yōu)支持。