蘇柯 邱榆程 王春梅 袁志

人參皂苷 Rb2 在體外調(diào)控破骨細(xì)胞的作用

蘇柯 邱榆程 王春梅 袁志

目的 探究人參皂苷 Rb2 在體外對(duì)破骨細(xì)胞的作用及機(jī)制。方法 通過培養(yǎng) RAW264.7 破骨前體細(xì)胞，加入不同濃度 Rb2 溶液 ( 0.1 μM，1 μM，10 μM )，采用 CCK-8 檢測 Rb2 藥物毒性，利用 TRAP 染色觀察破骨細(xì)胞形態(tài)并計(jì)數(shù)，使用 RT-PCR 方法檢測 TRAP、NFATc1 破骨活動(dòng)特異性基因 mRNA 的表達(dá)，通過 Western blot 技術(shù)檢測破骨細(xì)胞中 LC3 I、LC3 II、mTOR 的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 TRAP 陽性計(jì)數(shù)，與空白對(duì)照組相比 ( 168.2±22.6 )，0.1 μM 組 ( 131.0±16.3 )，P＝0.018；1 μM 組 ( 98.8±17.9 )，P＜0.01； 10 μM 組( 85.8±17.3 )，P＜0.01，破骨細(xì)胞數(shù)量明顯減少。對(duì)照組 TRAP、NFATc1 破骨分化特異性基因 mRNA 表達(dá)明顯下降，與對(duì)照組相比各組 P＜0.01。LC3 II / LC3 I 的比值顯著增高，mTOR 量下降，與對(duì)照組相比各組 P＜0.01。結(jié)論 Rb2 可能通過自噬途徑影響破骨基因的表達(dá)，從而減少破骨細(xì)胞的形成，mTOR 通路在此過程中起重要作用。

人參皂甙類；破骨細(xì)胞；自噬；骨質(zhì)疏松

骨質(zhì)疏松癥是常見的老年病之一，同時(shí)也是一個(gè)世界性的、主要的、不斷增長的骨骼健康問題。它主要表現(xiàn)為骨量減少、骨微結(jié)構(gòu)損害，導(dǎo)致骨脆性增加、易發(fā)骨折[1]。

目前許多治療骨質(zhì)疏松的西藥，如雙磷酸鹽類藥物，有很多副作用，包括骨壞死、股骨非典型性骨質(zhì)和腎功能障礙等[2-3]。與之相比，有些天然的中藥單體副作用少、生物活性高，并且能夠長期服用，也許會(huì)是一個(gè)更好地預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥的選擇。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷 Rb2 呈劑量依賴性地抑制高劑量地塞米松誘導(dǎo)的小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞凋亡[4]。還發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松小鼠模型中，Rb2 能明顯改善骨質(zhì)疏松骨的骨微結(jié)構(gòu)，提高了骨礦物質(zhì)密度并且促進(jìn)了 MC3T3-E1 成骨前體細(xì)胞的細(xì)胞增殖[5]。

本實(shí)驗(yàn)通過以 RAW264.7 破骨前體細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察 Rb2 在體外對(duì)破骨細(xì)胞的作用，及其對(duì)相關(guān)破骨基因表達(dá)的影響，探討 Rb2 對(duì)破骨細(xì)胞形成的作用及其作用機(jī)制，完善 Rb2 防治骨質(zhì)疏松的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

資料與方法

一、細(xì)胞

小鼠 RAW264.7 破骨前體細(xì)胞系來源于中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

二、藥物與試劑

人參皂苷 Rb2 購買自上海同田生物技術(shù)股份有限公司；α-MEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素 ( 美國 Gibco 公司 )；細(xì)胞因子 RANKL ( 美國 Peprotech 公司 )；抗酒石酸酸性磷酸酶 ( TRAP ) 染色試劑盒 ( 美國 Sigma 公司 )；CCK-8 試劑盒 ( 日本同仁 Dojindo 公司 )；RNA 提取試劑盒 ( 美國 Omega 公司 )；RNA 逆轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增試劑盒 ( 日本 Takara 公司 )；基因引物( 日本 Takara 公司 )；LC3、mTOR 抗體 ( 英國 Abcam公司 )。

三、RAW264.7 細(xì)胞的破骨分化誘導(dǎo)

采用成分為 10% 胎牛血清、100 U / ml 青鏈霉素的 α-MEM 培養(yǎng)基，在 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育 RAW264.7 細(xì)胞。分散細(xì)胞，按照 2×104/ml 的濃度將細(xì)胞接種在 48 孔板及 6 孔板中，培養(yǎng)6 h 后，棄掉培養(yǎng)液，換成加入細(xì)胞因子 RANKL( 100 ng / ml ) 的培養(yǎng)基，同時(shí)實(shí)驗(yàn)組分別加入0.1 μM，1 μM，10 μM 濃度的 Rb2 溶液。3 天后換液，共培養(yǎng) 5～6 天。

四、CCK-8 法檢測 Rb2 對(duì) RAW264.7 細(xì)胞的毒性作用

將 RAW264.7 細(xì)胞分散后，按 5000 個(gè) / 孔接種于 96 孔板中，共分 4 組 ( 空白對(duì)照組，0.1 μM 組，1 μM 組，10 μM 組 )，每組 6 孔，分別培養(yǎng) 24、48及 72 h。換成含 10% CCK-8 溶液的 α-MEM 培養(yǎng)基，在 37 ℃ 下避光孵育 1 h，測定各孔 450 nm 波長的吸光度值。

五、TRAP 染色及定量檢測

破骨細(xì)胞誘導(dǎo)成功后，取出 48 孔板，倒掉培養(yǎng)基，用 PBS 輕輕沖洗 2 遍，加入 4% 多聚甲醛固定20 min，倒掉固定液，去離子水沖洗 2 遍，加入配制好的 TRAP 染色液，37 ℃ 避光孵育 30 min。倒出染色液，去離子水沖洗，自然風(fēng)干。顯微鏡下觀察，以 3 個(gè)及 3 個(gè)以上核的破骨細(xì)胞為準(zhǔn)，計(jì)數(shù) TRAP染色陽性的破骨細(xì)胞。

六、RT-PCR 法測定破骨分化特異性基因( TRAP、NFATc1 ) mRNA 的表達(dá)

按上述方法誘導(dǎo)細(xì)胞后，取出 6 孔板，棄掉培養(yǎng)基，PBS 沖洗 2 遍，用 Omega E.Z.N.A.Total RNA Kit I 試劑盒提取細(xì)胞內(nèi)的 RNA。按 Takara Prime ScriptTMRT Master Mix 及 SYBR?Premix Ex TaqTMII 試劑盒說明書，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄盒擴(kuò)增。

七、Western blot 法檢測 LC3 及 mTOR 蛋白表達(dá)

按上述方法誘導(dǎo)細(xì)胞后，取出 6 孔板，棄掉培養(yǎng)基，PBS 沖洗 2 遍，每孔加入 RIPA 裂解液80 μl，晃動(dòng)搖勻，冰上裂解 30 min，離心 ( 10000×g ) 2 min 后取上清液，測定蛋白濃度。采用 Western blot 法檢測 LC3 及 mTOR 蛋白表達(dá)。

八、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、Rb2 對(duì) RAW264.7 細(xì)胞的毒性作用檢測

與對(duì)照組相比，不同濃度 Rb2 單獨(dú)作用于 RAW 264.7 細(xì)胞，分別在 24 h、48 h 及 72 h 用 CCK-8 檢測細(xì)胞活性，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05 ( 圖 1 )。

二、Rb2 對(duì)破骨細(xì)胞分化的影響

與空白對(duì)照組相比，通過 TRAP 陽性計(jì)數(shù)，( 168.2±22.6 )，0.1 μM 組 ( 131.0±16.3 )、1 μM 組( 98.8±17.9 )、10 μM 組 ( 85.8±17.3 )，Rb2 可以明顯地減少破骨細(xì)胞的數(shù)量并抑制破骨分化，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05 ( 圖 2 )。

三、Rb2 對(duì)破骨分化基因表達(dá)的影響

通過 RT-PCR 檢測 Rb2 對(duì)破骨基因 mRNA 表達(dá)的影響 ( TRAP 和 NFATc1 )，與對(duì)照組相比，Rb2 干預(yù)組破骨分化特異性基因的表達(dá)量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05 ( 圖 3 )。

表 1 RT-PCR 引物的堿基序列表Tab.1 List of base sequences of RT-PCR primers

圖 1 Rb2 對(duì)于 RAW264.7 細(xì)胞的毒性作用觀測Fig.1 Toxic effects of Rb2 on RAW264.7 cells

圖 2 TRAP 染色陽性計(jì)數(shù)，a 為空白對(duì)照組，b 為 0.1 μM Rb2組，c 為 1 μM Rb2 組，d 為 10 μM Rb2 組 ( 圖片放大倍數(shù) 50 倍 )Fig.2 TRAP positive staining count, a: blank control group. b:0.1 μM Rb2. c: 1 μM Rb2. d: 10 μM Rb2. ( × 50 )

圖 3 破骨基因 TRAP 和 NFATc1 的表達(dá)情況Fig.3 Expressions of osteoclast genes TRAP and NFATc1

四、自噬相關(guān)蛋白 LC3 及信號(hào)通路 mTOR 蛋白表達(dá)情況

與對(duì)照組相比，隨著 Rb2 濃度增加，LC3 II /LC3 I 比值明顯增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 ( P＜0.05 )。如圖 6，以 β-actin 為實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化內(nèi)參，隨著 Rb2 濃度增加，信號(hào)通路 mTOR 蛋白逐漸減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05 ( 圖 4、5 )。

圖 4 不同濃度 Rb2 組 LC3 的 Western-blot 結(jié)果Fig.4 LC3 western-blot results of different concentrations of Rb2 groups

圖 5 不同濃度 Rb2 組 LC3 II / LC3 I 比值Fig.5 LC3 II / LC3 I ratio in different concentrations of Rb2 groups

圖 6 不同濃度 Rb2 組 mTOR 的 Western-blot 結(jié)果Fig.6 mTOR western-blot results of different concentrations of Rb2 groups

討 論

正常人體骨質(zhì)中，成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞活動(dòng)處于一種動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，而幾乎在所有情況下，骨質(zhì)疏松患者存在著骨吸收和骨形成的失衡，通常表現(xiàn)為骨形成減弱或者正常，而破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收明顯增強(qiáng)[6]。因此破骨細(xì)胞的功能活動(dòng)在骨轉(zhuǎn)化的過程中起著至關(guān)重要的作用，抑制破骨細(xì)胞的活動(dòng)成為預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松的一個(gè)重點(diǎn)[7-8]。

劉曉青等[9]學(xué)者曾發(fā)現(xiàn)人參水煎劑有增加骨量的趨勢，增加骨形成，并對(duì)子宮無刺激作用，有預(yù)防去卵巢大鼠骨量丟失的作用。呂祥等[10]人研究表明，人參皂苷可以改善骨代謝生化指標(biāo)及骨生物力學(xué)性能，拮抗糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松大鼠的骨丟失。但無論人參水煎劑還是人參皂苷，均是混合物，具體何種單體發(fā)揮作用及其機(jī)制并不明了。我們課題組通過使用人參中最大量的有效成分人參皂苷 Rb2，通過體外和小鼠體內(nèi)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn) Rb2 能改善骨質(zhì)疏松骨的骨微結(jié)構(gòu)，提高骨礦物質(zhì)密度，增強(qiáng)了礦化和成骨特異性基因的表達(dá)。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷 Rb2，可以減少破骨細(xì)胞形成并抑制破骨細(xì)胞的分化。同時(shí)，自噬相關(guān)蛋白 LC3 II /LC3 I 比值隨著 Rb2 濃度增加而增高。當(dāng)自噬激活時(shí)，LC3 I 被激活轉(zhuǎn)化為 LC3 II，它正是自噬泡膜的重要組成部分，LC3 II / LC3 I 比值在很大程度上反映了自噬的活化程度。很多研究表明，自噬能調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞核骨細(xì)胞的功能，這表明自噬對(duì)于骨量的平衡至關(guān)重要[11-12]。因此 Rb2 很可能是通過自噬途徑調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的功能。有研究表明自噬的激活是 mTOR 信號(hào)通路依賴的[13]。自噬在破骨細(xì)胞的增殖與分化過程中本身起著重要的作用，破骨細(xì)胞表達(dá) S1PR ( 1-磷酸鞘氨醇受體 )，S1P 通過調(diào)節(jié) mTOR 的活力，與自噬過程相互作用，促進(jìn)了破骨細(xì)胞凋亡，通過凋亡作用，可以調(diào)控破骨細(xì)胞的分化[14]。筆者試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)信號(hào)通路 mTOR 蛋白隨著Rb2 濃度增加逐漸減少，表明 Rb2 可以抑制 mTOR通路蛋白活性，從而激活自噬。

綜上所述，人參皂苷 Rb2 可能通過激活自噬途徑抑制破骨細(xì)胞生成，調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞功能，而mTOR 通路在此過程中起到重要作用。但 mTOR 通路是否為其主要的有效途徑，仍需后續(xù)試驗(yàn)驗(yàn)證，并且其它信號(hào)通路在此過程中有何影響也有待進(jìn)一步研究。

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Effects of ginsenoside Rb2 on osteoclast regulation in vitro

SU Ke, QIU Yu-cheng, WANG Chun-mei, YUAN Zhi.Department of Orthopedics, Xijing Hospital, the fourth Military Medical University, Xi’an, Shaanxi, 710032, China

YUAN Zhi, Email: 605991889@qq.com

Objective To investigate effects and mechanism of ginsenoside Rb2 on osteoclasts in vitro.Methods The mouse osteoclast precursor cells RAW 264.7 were cultivated to induce osteoclasts. Rb2 ( 0.1 μM,1 μM, 10 μM ) was respectively added in the culture solution. CCK-8 was used for the detection of drug toxicity.The morphology and count of osteoclasts were observed by TRAP staining. The expression of osteoclast specific gene mRNA, such as TRAP and NFATc1, was detected by RT-PCR. Western blot technique was used to detect the expression levels of LC3 I, LC3 II and mTOR proteins. Results Compared with the control group ( 168.2 ± 22.6 ), the number of osteoclasts decreased significantly: group 0.1 μM ( 131.0 ± 16.3 ), P = 0.018; group 1 μM ( 98.8 ± 17.9 ),P ＜ 0.01; group 10 μM ( 85.8 ± 17.3 ), P ＜ 0.01. The expression of TRAP and NFATc1 osteoclast specific gene mRNA decreased significantly, the ratio of LC3, II / LC3 and I increased significantly, and the amount of mTOR decreased,P ＜ 0.01. Conclusions Rb2 may affects the expression of osteoclast genes by autophagy pathway to reduce the osteoclast formation. mTOR pathway plays an important role in this process.

Ginsenosides; Osteoclasts; Autophagy; Osteoporosis

10.3969/j.issn.2095-252X.2017.11.016

R915

國家自然科學(xué)基金 ( 81570801 )

710032 西安，第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院骨科

袁志，Email: 605991889@qq.com

2017-06-20 )

( 本文編輯：裴艷宏 )