于 輝,李金磊,狄元冉,王 丹,董 鵬,方忠意,高延玲,吳志明

(1.河南省動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所,河南 鄭州 450008;2.河南省獸藥飼料監(jiān)察所;3.焦作市畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測(cè)中心)

實(shí)驗(yàn)研究

河南省豬、雞源糞腸球菌的分離鑒定

于 輝1,李金磊2,狄元冉2,王 丹3,董 鵬2,方忠意2,高延玲2,吳志明2

(1.河南省動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所,河南 鄭州 450008;2.河南省獸藥飼料監(jiān)察所;3.焦作市畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測(cè)中心)

為了掌握河南省豬、雞源糞腸球菌的分布情況,從規(guī)?；i、雞場(chǎng)分別抽取樣品300批和180批,通過(guò)對(duì)細(xì)菌的分離培養(yǎng)、純化,采用PCR和BDPhoenix自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)對(duì)分離的糞腸球菌進(jìn)行鑒定.結(jié)果共分離菌株254,分離率為52.9%,其中豬源分離率為51.3%(154/300),雞源分離率為55.6%(100/180).試驗(yàn)結(jié)果表明,河南省規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)雞源糞腸球菌的分離率高于豬源,為今后的進(jìn)一步研究提供了數(shù)據(jù).

糞腸球菌;分離;鑒定

糞腸球菌是一種革蘭氏陽(yáng)性菌,是重要的條件致病菌[1],廣泛分布于自然界中,常棲居于人和動(dòng)物的腸道中.前期研究認(rèn)為糞腸球菌是人和動(dòng)物的共生菌,但近些年來(lái)糞腸球菌已逐漸成為人和動(dòng)物體革蘭氏陽(yáng)性菌感染中僅次于葡萄球菌的第二大病原菌[2].糞腸球菌可以導(dǎo)致動(dòng)物和人多個(gè)臟器的感染,包括皮膚軟組織感染、尿路感染、盆腔感染、傷口感染、腹腔感染、心內(nèi)膜炎、菌血癥和心內(nèi)膜炎腦膜炎[3].在獸醫(yī)臨床研究中,由腸球菌引起的動(dòng)物疾病日益增多[4],豬和雞感染糞腸球菌發(fā)病以及死亡的報(bào)道也越來(lái)越多[5].感染豬的腸球菌主要是屎腸球菌和糞腸球菌,它們也是醫(yī)院里感染的優(yōu)勢(shì)菌群,這給人畜臨床抗感染治療帶來(lái)極大的挑戰(zhàn).因此,對(duì)豬、雞源糞腸球菌的分離、鑒定,掌握其分布情況,對(duì)臨床防治由該菌引起的感染具有重要意義.該試驗(yàn)從河南省規(guī)模化豬、雞場(chǎng)抽取樣品進(jìn)行糞腸球菌分離、鑒定,以期掌握河南省豬、雞源糞腸球菌的分布情況,為糞腸球菌的控制預(yù)防提供數(shù)據(jù)支撐.

1 材料與方法

1.1 主要試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株

腸球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC29212,購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所.

1.1.2 樣品來(lái)源

2016年1月至2016年12月抽取河南省A、B、C、D4個(gè)地區(qū)規(guī)?；i場(chǎng)肛門拭子樣品300批,規(guī)模化雞場(chǎng)肛門拭子180批,具體抽樣數(shù)量見(jiàn)表1.

1.1.3 培養(yǎng)基與試劑

一次性無(wú)菌采樣棒(BHI)購(gòu)自鄭州君越科萊特健康科技有限公司,革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌鑒定板(購(gòu)自BD公司),K-F鏈球菌瓊脂、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、腦心浸液瓊脂(購(gòu)自北京路橋技術(shù)有限公司).

表1 2016年樣品抽樣數(shù)量統(tǒng)計(jì)

1.1.4 儀器設(shè)備

低溫可疊放搖床;細(xì)菌濁度儀自動(dòng)細(xì)菌鑒定/藥敏系統(tǒng);梯度PCR儀,凝膠成像系統(tǒng).

1.1.5 引物

糞腸球菌引物P1:5'-ACTTATGTGACTAAC TTAACC-3',P2:5'-TAATGGTGAATCTTGGTTTG G-3',擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為326bp.

1.2 方法

1.2.1 預(yù)增菌

將一次性無(wú)菌采樣棒采集的樣品盡快送到實(shí)驗(yàn)室,37℃培養(yǎng)16～20h,同時(shí)設(shè)陽(yáng)性和陰性對(duì)照.

1.2.2 樣品的分離、純化

取預(yù)增菌菌液1～2環(huán),劃線于K-F鏈球菌瓊脂上,37℃培養(yǎng)16～20h,選取單個(gè)典型菌落進(jìn)行純化,最后將純化好的菌落劃線接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基.

1.2.3 菌株的鑒定

1.2.3.1 PCR鑒定

用滅菌棉簽挑取純化好的菌落,加入裝有無(wú)菌生理鹽水的1.5ml離心管中,反復(fù)冷凍煮沸2～3次,12000rpm離心取上清作為PCR擴(kuò)增模板.同時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照.

50μl總反應(yīng)體系為:

預(yù)混酶ddH2O P1 P2模板25μl 18μl 1μl 1μl 5μl

反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性5min;95℃變性30s,60℃退火30s,72℃延伸30s,35個(gè)循環(huán);72℃后延伸5min;4℃保存.同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照.

PCR結(jié)束后,取8μlPCR產(chǎn)物,用1.5%瓊脂糖進(jìn)行電泳,15V/cm電泳20～30min,凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果.

1.2.3.2 鑒定系統(tǒng)鑒定

對(duì)PCR鑒定為糞腸球菌陽(yáng)性的樣品,取營(yíng)養(yǎng)瓊脂上純化好的菌落,用稀釋液調(diào)整到0.5MCF,加入到革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌鑒定板中,采用全自動(dòng)細(xì)菌鑒定/藥敏系統(tǒng)進(jìn)一步鑒定.

2 結(jié)果

2.1 菌株鑒定結(jié)果

經(jīng)預(yù)增菌培養(yǎng),K-F鏈球菌瓊脂分離純化,最后經(jīng)PCR及全自動(dòng)細(xì)菌鑒定/藥敏系統(tǒng)鑒定,糞腸球菌在K-F鏈球菌瓊脂上形成暗紅色至粉紅色菌落,邊緣整齊,瓊脂表面下菌落呈橢圓或晶體狀.

2.2 不同動(dòng)物來(lái)源分離情況

河南地區(qū)規(guī)?；i、雞場(chǎng)共分離糞腸球菌254株,分離率為52.9%(254/480),其中豬源、雞源分離率分別為51.3%(154/300)、55.6%(100/180).具體情況見(jiàn)表2.

2.3 不同地區(qū)分離情況

A、B、C、D四個(gè)地區(qū)糞腸球菌總體分離率分別為55.0%(66/120)、41.7%(75/180)、66.7%(60/90)、58.9%(53/90),其中A地區(qū)豬源、雞源分離率分別為50.0%(45/90)、70.0%(21/30),B地區(qū)豬源、雞源分離率分別為44.4%(40/90)、38.9%(35/90),C地區(qū)豬源、雞源分離率分別為55.0%(33/60)、90.0%(27/30),D地區(qū)豬源、雞源分離率分別為60.0%(36/60)、56.7%(17/30),具體結(jié)果見(jiàn)表2.

3 討論

該研究通過(guò)對(duì)河南省規(guī)?；i場(chǎng)、雞場(chǎng)的糞腸球菌進(jìn)行分離純化,鑒定,共分離糞腸球菌254株,分離率52.9%,與趙麗青[6]等研究的山東青島分離率82.1%和黃雁[7]等研究的福建某雞場(chǎng)的糞腸球菌分離率為77.8%相比,相對(duì)較低,比蘇崴藝[8]等從遼寧省雞場(chǎng)分離率為24.0%要高.這種差異可能是由樣品的來(lái)源不同所致,也可能是不同地區(qū)養(yǎng)殖環(huán)境的不同所致.

表2 2016年河南省各地區(qū)豬、雞源糞腸球菌分離情況

總體而言,豬源糞腸球菌的分離率51.5%(154/300)比雞源糞腸球菌的分離率55.6%(100/180)較低.4個(gè)地區(qū)豬源糞腸球菌分離率最高的是D地區(qū),分離率為60.0%(36/60),其次是C和A地區(qū),分離率分別為55.0%(3/60)和50.0%(45/90),最低的為B地區(qū),分離率為44.4%(40/90);雞源糞腸球菌分離率最高的是C地區(qū),分離率為90.0%(27/30),其次是A和D地區(qū),分離率分別為70.0%(21/30)和56.7%(17/30),最低的為B地區(qū),分離率為38.9%(35/90);就不同地區(qū)不同來(lái)源之間來(lái)說(shuō),A和C地區(qū)的雞源糞腸球菌分離率高于豬源,B和D地區(qū)雞源糞腸球菌的分離率低于豬源.該試驗(yàn)結(jié)果表明不同動(dòng)物來(lái)源的糞腸球菌分離率存在差異,不同地區(qū)之間糞腸球菌的分離率也存在差異,這種差異可能是由于菌株的偏好所致,也可能是不同地區(qū)養(yǎng)殖環(huán)境及用藥情況不同所致.

該試驗(yàn)通過(guò)對(duì)河南省豬源、雞源糞腸球菌的分離、鑒定,初步掌握了豬、雞源糞腸球菌的分布情況,為下一步制定防控措施提供了數(shù)據(jù).

[1]王亞賓,陳麗穎,胡慧,等.豬源糞腸球菌和屎腸球菌多重PCR快速鑒定方法的建立[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào),2011,31(8):1123-1127.

[2]幸文定.江西部分地區(qū)豬源糞腸球菌耐藥性及毒力基因檢測(cè)與分析[D].江西農(nóng)業(yè)大學(xué),2016.

[3]商軍,顧欣,張文剛,等.豬、雞源分離糞腸球菌的核糖體分型及耐藥性分析[J].中國(guó)抗生素雜志,2017,42(3):230-236.

[4]朱娜,方超,周成捷,等.湖南省豬源腸球菌的分離鑒定[J].湖南畜牧獸醫(yī),2016,(2):41-44.

[5]錢曉璐,商軍,田愷,等.豬、雞源分離糞腸球菌的核糖體分型及耐藥性分析[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī),2016,43(8):2176-2182.

[6]趙麗青,雷質(zhì)文,王樹(shù)峰,等.動(dòng)物源性腸球菌的分離鑒定及耐藥性分析[J].中國(guó)動(dòng)物檢疫,2008,25(1):31-32.

[7]黃雁,劉美容.福建某雞場(chǎng)糞腸球菌耐藥情況調(diào)查[J].國(guó)外畜牧獸醫(yī)學(xué)(豬與禽),2008,(4):91-93.

[8]蘇崴藝,李欣南,韓鐫竹.某養(yǎng)殖場(chǎng)雞源糞腸球菌分離鑒定及耐藥性研究[J].現(xiàn)代畜牧獸醫(yī),2014,(4):48-50.

S852.61+1

B

1004-5090(2017)09-0007-02

2017-07-20)