菜心生物技術(shù)研究進(jìn)展

黃秀++黃新敏++宋世威++蘇蔚++陳日遠(yuǎn)

摘 要 菜心是一種菜薹類蔬菜，也是華南地區(qū)的特色和重要蔬菜。近年來，菜心的生物技術(shù)研究越來越受到重視，且取得較多的研究成果，但還未見系統(tǒng)的綜述報道。綜述了近年來菜心生物技術(shù)的研究進(jìn)展，包括菜心離體再生培養(yǎng)體系，基因工程和分子標(biāo)記等方面，并探討了菜心生物技術(shù)研究中存在的問題和未來的研究動向。

關(guān)鍵詞 菜心 ；離體培養(yǎng) ；基因工程 ；分子標(biāo)記

中圖分類號 S634.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2017.10.013

Advances on Biotechnique for Flowering Chinese Cabbage

HUANG Xiu HUANG Xinmin SONG Shiwei SU Wei CHEN Riyuan

（College of horticulture， South China Agricultural University， Guangzhou， Guangdong 510642）

Abstract Flowering Chinese cabbage （Choi Sum） is an important stalk vegetable in South China. In recent years， more priorities have been given to the biotech research of Choi Sum， which has come up with many achievements， but no review was reported about the achievements. The biotech research progress in Choi Sum in recent years was reviewed， including in vitro culture， genetic engineering， molecular markers， etc. The problems arising from biotechnology and the future research interests of Choi Sum were discussed to provide reference for promotion of the biotech research of Choi Sum.

Keywords flowering Chinese cabbage ； in vitro culture ； genetic engineering ； molecular marker

菜心（Brassica Campestris L. ssp. Chinesis var. utilis Tsenet Lee.）又名菜薹，是十字花科蕓薹屬蕓薹種中的一二年生草本植物，是不結(jié)球白菜的一個變種。菜心是華南地區(qū)的特產(chǎn)蔬菜，以花薹為食用器官，品質(zhì)脆嫩、風(fēng)味獨特。菜心生長期短、復(fù)種指數(shù)高，可周年生產(chǎn)，是該區(qū)栽培面積和市場供應(yīng)最大的蔬菜[1-2]。選育商品性好、高產(chǎn)多抗優(yōu)質(zhì)的菜心品種，對提高其產(chǎn)品品質(zhì)和市場競爭力具有重要意義。常規(guī)育種方法存在培育新品種的時間較長、過程復(fù)雜、易受到親本材料的限制等一系列問題[3]。植物組織培養(yǎng)、基因工程和分子標(biāo)記等技術(shù)在植物遺傳育種中的廣泛應(yīng)用，彌補(bǔ)了常規(guī)育種方法的不足[4]。菜心生物技術(shù)的研究起步較晚，雖然在離體再生培養(yǎng)、轉(zhuǎn)基因及分子標(biāo)記方面都取得較多成果，但仍存在較多問題。為此，本文對近年來菜心生物技術(shù)研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，全面探討菜心分子生物學(xué)研究動態(tài)及存在的問題，以期為進(jìn)一步推動菜心生物技術(shù)研究提供理論參考，也為菜心優(yōu)良品種選育提供新思路。

1 菜心離體再生培養(yǎng)體系研究進(jìn)展

離體再生培養(yǎng)的原理是植物體細(xì)胞全能性。高頻再生體系的建立與植物基因型、外植體類型、苗齡、激素、褐化等因素密切相關(guān)。近年菜心離體再生培養(yǎng)體系研究獲得了重要進(jìn)展。

1.1 基因型對菜心離體再生培養(yǎng)的影響

基因型對離體再生培養(yǎng)有重要影響[5]。已有研究表明，調(diào)控芽的基因可能位于C基因組上，菜心屬AA基因組，因缺少C基因組而難以再生[6]。因此，選擇合適的基因型能有效提高菜心再生效率。朱允華等[7]研究了4種基因型菜心花藥胚狀體再生效率，結(jié)果表明，不同基因型存在較大差異；孟成民等[8]選用5種不同基因型菜心品種為試材，以苗齡為4 d的帶葉柄子葉為外植體，結(jié)果同樣表明，不同基因型對菜心不定芽分化頻率存在較大影響（表1）。而較多研究表明，早熟品種‘四九菜心的離體再生效率較高，生長周期短，目前多作為菜心轉(zhuǎn)基因材料[9-10]。

1.2 外植體對菜心離體再生培養(yǎng)的影響

菜心不同外植體的再生能力差異顯著。在菜心離體再生體系研究中，采用的外植體主要有葉片[11]、下胚軸[12]、花藥和子葉柄-子葉[13]等類型（表2），其中，子葉柄-子葉的不定芽再生效率最高，且能獲得再生植株，以葉片作為外植體也能獲得再生植株，但是出芽分化率低，而花藥作為外植體則不能獲得完整植株[11， 14]。這可能與子葉柄-子葉這一部分外植體包含分化能力較強(qiáng)的原分生細(xì)胞和子葉塊營養(yǎng)有關(guān)[14]。

1.3 苗齡對菜心離體再生培養(yǎng)的影響

苗齡也是影響植物離體再生的重要因素，幼嫩組織比老化組織具有更高的形態(tài)發(fā)生能力。不同苗齡的菜心外植體不定芽分化頻率差異較大（表3）。不論是以子葉、還是帶柄子葉為外植體，或?qū)τ诓煌牟诵钠贩N，均以苗齡為3～5 d時不定芽的分化率較高，但隨著苗齡增長，不定芽的分化呈下降趨勢[8，16]。雖然苗齡越小，細(xì)胞分生能力也越強(qiáng)，但若苗齡過短，如3d苗齡菜心的子葉尚未展開完全，子葉柄-子葉很小，較難產(chǎn)生不定芽，不宜選作外植體；而苗齡在4、5 d時，子葉已完全展開且不定芽的分化率較高[16]。因此，在菜心的離體再生培養(yǎng)中，宜選用4～5 d苗齡的外植體。endprint

1.4 激素對菜心離體再生培養(yǎng)體系的影響

培養(yǎng)基中激素種類和濃度對離體培養(yǎng)有重要作用，改變激素種類[如BA（芐基腺嘌呤）、NAA（萘乙酸）、KT（激動素）以及ZT（玉米素）等]和濃度可有效提高培養(yǎng)效率[17，19]。目前，在菜心再生體系中，以BA與NAA使用最多。一些研究得出（表4），培養(yǎng)基中適宜濃度的NAA和BA可提高外植體的出芽數(shù)和出芽率，且NAA和BA的結(jié)合使用效果優(yōu)于單獨使用，但ZT和KT的單一使用效果比混用好。

除了基因型、外植體類型、苗齡、激素等因素外，褐化也是影響菜心離體再生的重要因素[15]。造成外植體褐化的因素有很多，如再生過程中，乙烯的產(chǎn)生并大量積累、外植體大小和生理狀態(tài)、培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件等[21-23]。目前，關(guān)于菜心離體再生培養(yǎng)過程中的褐化問題研究較少，但在其他蕓薹屬作物上已有較多的研究，如在培養(yǎng)基中加入活性炭、調(diào)節(jié)pH可以降低白菜離體再生的褐化問題[24-25]，這些可為解決菜心離體再生培養(yǎng)過程中的褐化問題提供參考。

2 菜心基因工程研究進(jìn)展

2.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立

農(nóng)桿菌介導(dǎo)法操作簡單、成本低、轉(zhuǎn)化效率較高、導(dǎo)入的外源基因遺傳相對穩(wěn)定。自O(shè)oms[26]利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法首次獲得蕓薹屬轉(zhuǎn)基因植株以來，蕓薹屬植物的遺傳轉(zhuǎn)化受到廣泛關(guān)注。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法分為兩大類：一是不依賴植物組織培養(yǎng)的遺傳轉(zhuǎn)化體系；二是以植物組織培養(yǎng)為基礎(chǔ)的遺傳轉(zhuǎn)化。

2.1.1 不依賴植物組織培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化體系

不依賴組織培養(yǎng)的遺傳轉(zhuǎn)化方法包括真空滲入法、葉盤法、子房注射法、浸花法等。真空滲入法的原理是借助真空泵的吸力作用，使農(nóng)桿菌更有效的侵染受體植物，借著T-DNA向植物基因組的轉(zhuǎn)移、整合，實現(xiàn)外源基因向受體植物的轉(zhuǎn)化。該方法操作簡單、快速、實用性強(qiáng)，是目前基因工程中應(yīng)用較理想的遺傳轉(zhuǎn)化方法。Zhang等[27]采用真空滲透法將pinII基因?qū)搿?9菜心”，經(jīng)檢測pinII基因已整合到菜心基因組中，抗蟲性檢測得知轉(zhuǎn)基因植株對小菜蛾有較高的致死率。真空滲入法的轉(zhuǎn)化效率一般不高，不同研究的差異較大，如曹傳增等[28]研究得出植株的轉(zhuǎn)化率約為3%，而張軍杰等[29]試驗中菜心植株轉(zhuǎn)化率有接近30%，這可能與真空處理的強(qiáng)度、時間及轉(zhuǎn)化植株的生長狀況有關(guān)。

2.1.2 以植物組織培養(yǎng)為基礎(chǔ)的遺傳轉(zhuǎn)化

依賴于組織培養(yǎng)的遺傳轉(zhuǎn)化是由植物細(xì)胞和農(nóng)桿菌共培養(yǎng)一段時間，使外源基因整合到植物基因組中。在菜心遺傳轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化研究的基礎(chǔ)上，已開展了較多的菜心轉(zhuǎn)基因研究，如育性基因[9]、抗蟲基因[30]等。

2.2 基因工程的遺傳改良

基因工程是利用基因重組技術(shù)，在體外構(gòu)建重組基因并將其整合到受體植物中，從而使受體植物獲得新性狀的一項生物技術(shù)。目前，利用基因工程進(jìn)行菜心性狀的改良主要應(yīng)用在抗蟲[16，29-30]、抗病[31]及雄性不育[9]等方面。

2.2.1 抗蟲基因

菜心的蟲害主要包括蚜蟲、菜青蟲和小菜蛾等，嚴(yán)重影響產(chǎn)量、品質(zhì)和商品性。常規(guī)育種較難育成好的抗蟲品種，而轉(zhuǎn)基因技術(shù)為抗蟲育種提供了很大空間。目前，利用基因工程技術(shù)已成功獲得許多抗蟲的菜心轉(zhuǎn)基因植株，這些抗蟲基因主要有：Bt（Bacillus Thuringiensis，蘇云金芽孢桿菌）[32]基因、Pin（Proteinase inhibitor，蛋白酶抑制劑基因）[33]、Lee（Leetin，外源凝集素基因）[34]、EβF（（E）-β-farnesene，蚜蟲警報信息素）基因[35]，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，這些轉(zhuǎn)基因植株具有較強(qiáng)的抗蟲性[16，29-30，36-37]。

2.2.2 抗病基因

除受蟲害影響外，菜心生產(chǎn)中還會遭受病害的侵襲。病毒病是菜心最主要的病害之一，常給菜心生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失。而受傳統(tǒng)育種方法中抗性資源缺乏的限制，很難從根本上解決這一問題。在植物抗病毒基因工程中，通過將CP（病毒外殼蛋白編碼基因）轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞，使其在植物細(xì)胞中表達(dá)、積累，從而抑制浸染病毒的復(fù)制，為病毒病的防治提供一條有效途徑。目前已通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得含CP基因的菜心轉(zhuǎn)化株，經(jīng)病毒接種檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化株具有TuMV（蕪菁花葉病毒）抗性[38]。

2.2.3 育性基因

菜心的花器官較小，人工授粉費工費力，并容易傷到雌蕊，這在很大程度上限制了菜心雜交品種的選育。利用基因工程培育出雄性不育株可解決上述難題。目前研究最多的雄性不育基因是由Barnase基因與TA29（絨氈層特異表達(dá)基因）基因啟動子構(gòu)建的嵌合基因TA29-barnase[39]。Barnase是一種編碼RNA酶的基因，通過阻遏花藥形成絨氈層使孢子或花粉敗育[40]。曹必好等[9]成功將不育基因TA29-Barnase轉(zhuǎn)入菜心獲得轉(zhuǎn)化株，并且轉(zhuǎn)基因植株均表現(xiàn)花粉敗育。

3 菜心分子標(biāo)記技術(shù)研究進(jìn)展

分子標(biāo)記是在分子水平上直接以DNA形式對植物遺傳進(jìn)行的研究，具有操作簡便、檢測快速、對生物傷害程度低等優(yōu)點，且不易受植株生長時期、環(huán)境、基因表達(dá)與否等因素影響，具有遺傳穩(wěn)定性。近年來，分子標(biāo)記在菜心上的研究較為廣泛，主要應(yīng)用在菜心遺傳多樣性、種質(zhì)資源以及輔助育種等方面。目前，在菜心上應(yīng)用較多的有以PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）為基礎(chǔ)的SSR（簡單重復(fù)序列）、ISSR（簡單序列重復(fù)區(qū)間）標(biāo)記[41-42]和RAPD（隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA）標(biāo)記[43-45]，結(jié)合PCR技術(shù)和限制性酶切的AFLP（擴(kuò)增片段長度多態(tài)性）標(biāo)記[46]、SRAP（相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性）標(biāo)記[47]和MFLP（微衛(wèi)星錨定片段長度多態(tài)性）標(biāo)記[48]等。

3.1 分子標(biāo)記在菜心遺傳多樣性及種質(zhì)資源中的應(yīng)用

遺傳多樣性能反映物種的遺傳背景，根據(jù)遺傳差異將親本材料分成不同類群是獲得雜種優(yōu)勢的前提，也可為后代性狀的預(yù)測提供依據(jù)。因此，遺傳多樣性在育種上具有很高的潛力和利用價值。從形態(tài)表型和農(nóng)藝性狀對菜心遺傳多樣性及種質(zhì)資源進(jìn)行分析，存在時間長、性狀之間差異小、誤差大、受環(huán)境因素影響嚴(yán)重等問題，因此難以得到可靠的結(jié)果[49]。而運用分子標(biāo)記技術(shù)能夠很好的解決上述問題。endprint

近幾年，利用SSR、RAPD和ISSR標(biāo)記對菜心種質(zhì)遺傳多樣性的研究報道較多。利用SSR標(biāo)記在相近屬、種間的通用性，得到一些適用于菜心的SSR標(biāo)記[50-51]。SSR標(biāo)記也應(yīng)用在相關(guān)性狀基因的篩選以及品種特性分析等方面[52]。孫雪梅等[53]運用ISSR標(biāo)記分析了菜心品種的遺傳多樣性，結(jié)果表明，菜心的遺傳多樣性較低，經(jīng)聚類分析將27個菜心品種分為六大類。徐重益等[54]利用RAPD標(biāo)記對不同株數(shù)組成的菜心群體進(jìn)行多態(tài)性分析，得出群體數(shù)不小于60株為一個地方菜心種質(zhì)更新較適宜的群體。對經(jīng)航天誘變處理后的菜心變異株系進(jìn)行RAPD多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)變異株在分子水平上均發(fā)生了不同程度的遺傳變異[55]。而SRAP、AFLP和MFLP在菜心的多態(tài)性檢測以及基因篩選等方面亦是比較有效和理想的分子標(biāo)記技術(shù)[48，56-58]。

3.2 分子標(biāo)記在菜心輔助育種中的作用

從群體中選出符合需求的基因型是育種工作的關(guān)鍵。常規(guī)育種基于表型選擇的方法效率低、缺點較多，分子標(biāo)記利用目的基因與某個分子標(biāo)記的連鎖能實現(xiàn)對基因型的直接選擇。

前人研究獲得4個與菜心抽薹基因連鎖的SRAP和ISSR分子標(biāo)記，并初步建立了用于菜心親本及其雜交后代鑒定的指紋圖譜，開拓了菜心種子純度鑒定的新途徑[59]。冒維維等[60]同樣利用ISSR標(biāo)記對菜心雄性不育基因進(jìn)行鑒定和定位。利用SSR標(biāo)記對菜心小菜蛾抗性基因進(jìn)行遺傳分析，為菜心抗蟲育種提供了理論依據(jù)[61]。

4 菜心生物技術(shù)研究存在的問題與展望

隨著菜心種植面積及消費量的不斷增大，其生物技術(shù)研究十分迫切。由于人們對菜心生物技術(shù)研究的重視程度不夠，加之研究的起步較晚，雖然近年取得了很多研究成果，但仍存在較多問題。（1） 菜心的遺傳轉(zhuǎn)化體系仍不健全，轉(zhuǎn)化效率低仍是限制菜心遺傳轉(zhuǎn)化的最大問題。因此仍需在菜心基因型、外植體選擇等問題上開展深入研究，以建立起一套穩(wěn)定高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系。（2） 加強(qiáng)菜心雄性不育機(jī)理的研究和雄性不育材料的創(chuàng)制。由于在該方面研究的不足，目前仍缺乏高效的菜心雄性不育材料，限制了菜心雜交優(yōu)勢的利用和雜交制種的商業(yè)化生產(chǎn)。（3） 對于菜心重要農(nóng)藝性狀調(diào)控機(jī)理不明晰，如菜心的春化途徑及開花調(diào)控、菜薹形成機(jī)理等。這在一定程度上限制了生物技術(shù)在菜心優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)中的應(yīng)用。在參考白菜基因組數(shù)據(jù)庫的基礎(chǔ)上，結(jié)合高通量測序等新技術(shù)加快對菜心農(nóng)藝性狀調(diào)控機(jī)理的研究，同時借助轉(zhuǎn)錄組豐富的數(shù)據(jù)庫資源開發(fā)高效的分子標(biāo)記，提高種質(zhì)資源的篩選效率。（4） 需要加強(qiáng)新的生物技術(shù)在菜心中的應(yīng)用，如最新的基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9等，推動菜心生物技術(shù)研究的發(fā)展。

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