何瑾 許國(guó)榮 林涵 王檸 陳萬(wàn)金

·神經(jīng)系統(tǒng)遺傳性疾病·

目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序檢測(cè)常染色體隱性遺傳性腓骨肌萎縮癥GDAP1基因突變

何瑾 許國(guó)榮 林涵 王檸 陳萬(wàn)金

研究背景腓骨肌萎縮癥存在高度臨床和遺傳異質(zhì)性，傳統(tǒng)基因檢測(cè)需對(duì)眾多候選基因逐一篩查，存在效率低、耗時(shí)、費(fèi)力等局限性。本文旨在探討目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序技術(shù)診斷常染色體隱性遺傳性腓骨肌萎縮癥的可行性。方法采集5例臨床擬診常染色體隱性遺傳性腓骨肌萎縮癥患者的臨床資料和外周血樣本，采用目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序技術(shù)篩查腓骨肌萎縮癥相關(guān)基因突變，Sanger測(cè)序?qū)蜻x變異位點(diǎn)在患者及其父母外周血樣本中進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序顯示，2例檢出GDAP1基因復(fù)合雜合突變，余3例未檢出致病性突變。經(jīng)Sanger測(cè)序證實(shí)2例患兒存在GDAP1基因突變，例1為GDAP1基因復(fù)合雜合突變c.767A＞G（p.His256Arg）和c.866T＞A（p.Phe289Tyr），其父攜帶c.866T＞A（p.Phe289Tyr）突變，其母攜帶c.767A＞G（p.His256Arg）突變；例2為GDAP1基因復(fù)合雜合突變c.571C＞T（p.Arg191X）和c.589delC（p.Asp198IlefsX8），其父攜帶c.589delC（p.Asp198IlefsX8）突變，其母攜帶c.571C ＞T（p.Arg191X）突變，最終明確診斷為常染色體隱性遺傳性腓骨肌萎縮癥。結(jié)論目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序技術(shù)是一項(xiàng)高效基因檢測(cè)方法，適用于常染色體隱性遺傳性腓骨肌萎縮癥的基因診斷。

夏科?馬里?圖斯??； 基因，隱性； 突變； 系譜

腓骨肌萎縮癥（CMT）是臨床常見(jiàn)的遺傳性運(yùn)動(dòng)感覺(jué)周?chē)窠?jīng)病，發(fā)病率約為1/2500［1］。主要臨床特點(diǎn)是青少年期隱匿起病，對(duì)稱(chēng)性遠(yuǎn)端肌無(wú)力、肌萎縮，伴感覺(jué)缺失，多為下肢遠(yuǎn)端先于上肢受累，大腿下部肌肉1/3萎縮明顯，呈“鶴腿”樣改變，可以累及上肢和手部肌肉，多有家族史；部分有弓形足、錘狀趾、爪形手和脊柱側(cè)彎等表現(xiàn)，臨床異質(zhì)性較強(qiáng)。遺傳模式多樣，包括常染色體顯性遺傳性腓骨肌萎縮癥、常染色體隱性遺傳性腓骨肌萎縮癥、X連鎖遺傳性腓骨肌萎縮癥和新發(fā)突變的散發(fā)病例，其中尤以常染色體顯性遺傳性腓骨肌萎縮癥常見(jiàn)，約占50%［2］。常染色體隱性遺傳性腓骨肌萎縮癥臨床表現(xiàn)與常染色體顯性遺傳相似，但前者癥狀較重，發(fā)病年齡較?。??4］。由于家系中同一種致病性突變引起的臨床表型不一，進(jìn)行家系調(diào)查時(shí)有些家屬不配合致家系資料不完整，導(dǎo)致遺傳方式難以確定，同時(shí)，臨床同質(zhì)性與異質(zhì)性并存，肌電圖和組織病理學(xué)缺乏特異性，難以明確診斷。尤其是常染色體隱性遺傳性腓骨肌萎縮癥，只能依靠基因診斷。腓骨肌萎縮癥的致病基因眾多，自1992年P(guān)MP22基因克隆以來(lái)，已有70余種致病基因被克隆［5］。由于腓骨肌萎縮癥遺傳異質(zhì)性較強(qiáng)、致病基因較多，傳統(tǒng)基因檢測(cè)確定致病基因存在效率低、耗時(shí)長(zhǎng)等缺點(diǎn)。近年來(lái)，高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展克服傳統(tǒng)基因檢測(cè)的不足，其中，目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序技術(shù)在單基因遺傳病致病性突變的檢測(cè)中獲得廣泛應(yīng)用［6?10］。在本研究中，我們采用目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序技術(shù)對(duì)臨床疑診常染色體隱性遺傳性腓骨肌萎縮癥家系進(jìn)行相關(guān)基因快速高通量測(cè)序，并采用Sanger測(cè)序技術(shù)對(duì)基因突變的2例患兒及其家系成員進(jìn)行驗(yàn)證，最終獲得明確診斷。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象

研究對(duì)象均來(lái)自2013年1月-2016年12月福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床擬診的腓骨肌萎縮癥患者，共5例，男性4例，女性1例；年齡5～31歲，平均15歲；均符合2009年美國(guó)神經(jīng)病學(xué)學(xué)會(huì)（AAN）、美國(guó)神經(jīng)肌肉病和電生理診斷醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)（AANEM）及美國(guó)物理醫(yī)學(xué)與康復(fù)學(xué)會(huì)（AAPM&R）聯(lián)合公布的遠(yuǎn)端對(duì)稱(chēng)性周?chē)窠?jīng)病診斷指南。5例患者父母（10例）均無(wú)肌無(wú)力和肌萎縮病史，否認(rèn)近親婚配。選擇同期在我院行體格檢查的健康志愿者作為對(duì)照，共計(jì)100例，男性50例，女性50例；年齡為51～80歲，平均60歲。本研究經(jīng)福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院道德倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，所有受試者及其家屬均知情同意并簽署知情同意書(shū)。

二、研究方法

1.一般資料收集 采集5例患者的家系資料、臨床病史，以及神經(jīng)系統(tǒng)檢查、實(shí)驗(yàn)室檢查和神經(jīng)電生理學(xué)檢查結(jié)果。

2.標(biāo)本收集與基因組DNA提取 采集5例患者及其父母外周靜脈血各2 ml，予乙二胺四乙酸（EDTA，美國(guó)BD公司）抗凝。采用QIAamp?DNA提取試劑盒（德國(guó)Qiagen公司）提取患者及其父母外周靜脈血基因組DNA，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。采用NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）分別于260和280 nm波長(zhǎng)處定量測(cè)定基因組DNA。

3.目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序與數(shù)據(jù)分析 采用目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序技術(shù)對(duì)5例患者進(jìn)行基因檢測(cè)。具體步驟如下：采用NimbleGen SeqCap EZ Choice試劑盒（瑞士Roche公司）建立含目標(biāo)基因的全基因組文庫(kù)，包括已知的79種遺傳性運(yùn)動(dòng)感覺(jué)周?chē)窠?jīng)病相關(guān)基因，如 PMP22、MPZ、GJB1等；采用 Illumina HiSeq 2500測(cè)序儀（美國(guó)Illumina公司）在晶能生物技術(shù)（上海）有限公司完成高通量測(cè)序。所獲得的原始數(shù)據(jù)采用BWA軟件（http://bio?bwa.sourceforge.net）與h19人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http://hgdownload.cse.ucsc.edu/）進(jìn)行比對(duì)，變異位點(diǎn)經(jīng)ANNOVAR軟件進(jìn)行注釋。采用PolyPhen?2、SIFT和 Mutation Taster軟件對(duì)變異位點(diǎn)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

4.Sanger測(cè)序 經(jīng)目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序篩選的候選變異位點(diǎn)采用Sanger測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證，同時(shí)在家系中進(jìn)一步驗(yàn)證，以及對(duì)正常對(duì)照者進(jìn)行Sanger測(cè)序。具體操作步驟如下：（1）聚合酶鏈反應(yīng)（PCR），PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性3 min；94℃ 30 s、56℃ 45 s、72℃ 60 s，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸5 min。（2）蝦堿酶（SAP）純化，于EP管中逐一加入ddH2O 1 μl、10 × ExonⅠ緩沖液 0.70 μl、ExonⅠ0.25 μl、蝦堿酶 0.05 μl、PCR 產(chǎn)物 5 μl，37 ℃溫浴 60 min，80 ℃水浴15 min。（3）測(cè)序，于EP管中加入經(jīng)蝦堿酶純化的 PCR 產(chǎn)物 3 μl、Big Dye 1 μl、3.20 × 106pmol/L 單向引物1 μl，進(jìn)行測(cè)序，反應(yīng)條件為96℃ 1 min，96℃ 10 s、50℃ 5 s、60℃ 4 min，共25個(gè)循環(huán)。測(cè)序產(chǎn)物經(jīng)乙醇純化后采用ABI 3730基因型分析儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）進(jìn)行分離，采用Sequencing Analysis Software v6.0（美 國(guó) Thermo Fisher Scientific公司）進(jìn)行分析。

表1 5例臨床擬診腓骨肌萎縮癥患者臨床特征Table 1. Clinical manifestations of 5 patients primarily diagnosed as CMT

結(jié) 果

一、臨床特征

5例臨床擬診腓骨肌萎縮癥患者，發(fā)病年齡1～23歲，平均4歲；病程1～27歲，平均7年；臨床主要表現(xiàn)為遠(yuǎn)端肌無(wú)力，腱反射減退或消失，4例表現(xiàn)為遠(yuǎn)端肌萎縮和針刺覺(jué)減退，2例手足畸形，1例失聰；神經(jīng)電生理學(xué)檢查均符合周?chē)窠?jīng)損害。5例患者臨床特征參見(jiàn)表1。

二、目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序

經(jīng)目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序，5例患者檢測(cè)出變異位點(diǎn)（包括錯(cuò)義突變、無(wú)義突變和同義突變）3123～4007個(gè)，平均（3328.20±380.98）個(gè)；插入/缺失變異180～265個(gè)，平均（219.20±40.18）個(gè)；測(cè)序深度92.11～231.02×，平均（154.88±68.19）×，其中2例檢測(cè)出GDAP1基因復(fù)合雜合突變，余3例未檢測(cè)出該致病性突變。數(shù)據(jù)分析顯示，例1為GDAP1基因復(fù)合雜合突變c.767A＞G（p.His256Arg）和c.866T＞A（p.Phe289Tyr），例2為GDAP1基因復(fù)合雜合突變c.571 C ＞ T（p.Arg191X） 和 c.589delC（p.Asp198IlefsX8），其中，c.767A ＞ G（p.His256Arg）和c.571C＞T（p.Arg191X）為已知變異位點(diǎn)，而c.866T＞A（p.Phe289Tyr）和 c.589delC（p.Asp198IlefsX8）尚未見(jiàn)諸報(bào)道。采用PolyPhen?2、SIFT和Mutation Taster軟件顯示，c.866T＞A（p.Phe289Tyr）為致病性突變；c.589delC（p.Asp198IlefsX8）為缺失突變，可以導(dǎo)致其編碼蛋白為截短蛋白，經(jīng)Mutation Taster預(yù)測(cè)軟件提示該變異位點(diǎn)亦為致病性突變。

三、Sanger測(cè)序

采用Sanger測(cè)序?qū)?例GDAP1基因復(fù)合雜合突變患兒及其父母進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示，例1為GDAP1基因復(fù)合雜合突變c.767A＞G（p.His256Arg）和c.866T＞ A（p.Phe289Tyr，圖 1），其父攜帶雜合突變c.866T ＞A（p.Phe289Tyr），其 母 攜 帶 雜 合 突 變c.767A＞G（p.His256Arg）；例2為GDAP1基因復(fù)合雜合 突 變 c.571C ＞ T（p.Arg191X）和 c.589delC（p.Asp198IlefsX8，圖2），其父攜帶雜合突變c.589delC（p.Asp198IlefsX8），其母攜帶雜合突變c.571C＞T（p.Arg191X）。而在100例正常對(duì)照者中未檢測(cè)出GDAP1基因 c.866T＞A（p.Phe289Tyr）和 c.589delC（p.Asp198IlefsX8）突變。

經(jīng)上述基因檢測(cè)證實(shí)例1和例2均存在GDAP1基因復(fù)合雜合突變，明確診斷為常染色體隱性遺傳性腓骨肌萎縮癥。

典型病例

圖1 例1 Sanger測(cè)序顯示，GDAP1基因存在復(fù)合雜合突變c.767A＞G（p.His256Arg，箭頭所示，上圖）和c.866T＞A（p.Phe289Tyr，箭頭所示，下圖）Figure 1 Sanger sequencing of Case 1 showed compound heterozygous mutation of GDAP1 gene c.767A＞G(p.His256Arg,arrow indicates,upper panel)and c.866T＞A(p.Phe289Tyr,arrow indicates,lower panel).

圖2 例2 Sanger測(cè)序顯示，GDAP1基因存在復(fù)合雜合突變c.571C＞T（p.Arg191X，箭頭所示，上圖）和c.589delC（p.Asp198IlefsX8，箭頭所示，下圖）Figure 2 Sanger sequencing of Case 2 showed compound heterozygous mutation of GDAP1 gene c.571C＞T(p.Arg191X,arrow indicates,upper panel)and c.589delC(p.Asp198IlefsX8,arrow indicates,lower panel).

例1 男性，5歲，主因雙下肢無(wú)力1年余，于2016年2月26日至我院神經(jīng)內(nèi)科門(mén)診就診。患兒于1年前無(wú)明顯誘因出現(xiàn)雙下肢無(wú)力，主要表現(xiàn)為漸進(jìn)性雙足下垂、行走不穩(wěn)、下樓梯困難，就診時(shí)佩戴踝部矯形器輔助行走，未見(jiàn)明顯四肢肌萎縮，無(wú)感覺(jué)異常。患兒足月順產(chǎn)，單胎，生長(zhǎng)發(fā)育和智力發(fā)育正常，15個(gè)月時(shí)可獨(dú)立行走。父母身體健康，無(wú)相似臨床癥狀，否認(rèn)近親婚配。門(mén)診神經(jīng)系統(tǒng)檢查：神志清楚，語(yǔ)言流利，腦神經(jīng)檢查未見(jiàn)明顯異常；頸屈肌肌力正常，雙上肢肌力5級(jí)，雙側(cè)股四頭肌肌力5級(jí)，足背伸肌力左側(cè)1級(jí)、右側(cè)2級(jí)，雙側(cè)跖屈肌肌力4級(jí)，四肢肌張力均正常；雙側(cè)弓形足，跨閾步態(tài)；針刺覺(jué)和深感覺(jué)正常，四肢腱反射減退，病理反射未引出。實(shí)驗(yàn)室檢查：血清肌酸激酶（CK）于正常值范圍。電生理學(xué)檢查：神經(jīng)傳導(dǎo)速度（NCV）顯示四肢運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度（MNCV）正常；腓腸神經(jīng)感覺(jué)神經(jīng)傳導(dǎo)速度（SNCV）降低（左側(cè)35 m/s、右側(cè)33 m/s），余正常。針極肌電圖顯示，四肢復(fù)合肌肉動(dòng)作電位（CMAP）波幅降低（正中神經(jīng)1.40 mV），部分復(fù)合肌肉動(dòng)作單位電位時(shí)相增寬、波幅升高、募集相減少?；驒z測(cè)顯示，GDAP1基因存在復(fù)合雜合突變c.767A ＞G（p.His256Arg）和c.866T＞A（p.Phe289Tyr），最終明確診斷為常染色體隱性遺傳性腓骨肌萎縮癥。未予藥物治療，囑患者至康復(fù)科進(jìn)行康復(fù)訓(xùn)練，未隨訪(fǎng)。

例2 男性，15歲，主因四肢無(wú)力15年、肌萎縮10余年，于2013年8月29日至我院神經(jīng)內(nèi)科門(mén)診就診。患兒自出生后不久即出現(xiàn)四肢活動(dòng)較正常同齡兒童差，3歲時(shí)方可獨(dú)立行走，5歲時(shí)出現(xiàn)四肢遠(yuǎn)端肌萎縮，表現(xiàn)為足下垂、爪形手?；純鹤阍马槷a(chǎn)，單胎，生長(zhǎng)發(fā)育和智力發(fā)育正常。父母身體健康，無(wú)相似臨床癥狀，否認(rèn)近親婚配。門(mén)診體格檢查：四肢近端和遠(yuǎn)端明顯肌萎縮，不能行走，需坐輪椅。神經(jīng)系統(tǒng)檢查：神志清楚，語(yǔ)言流利，腦神經(jīng)檢查未見(jiàn)異常；頸屈肌肌力4級(jí)，雙側(cè)三角肌、肱二頭肌肌力4級(jí)，雙手骨間肌肌力1級(jí)，雙側(cè)股四頭肌肌力2+級(jí)，雙側(cè)足背伸、跖屈肌肌力1級(jí)，四肢肌張力均降低；雙側(cè)馬蹄內(nèi)翻足；針刺覺(jué)和深感覺(jué)正常，四肢腱反射消失，病理反射未引出。實(shí)驗(yàn)室檢查血清肌酸激酶于正常值范圍。電生理學(xué)檢查：左側(cè)尺神經(jīng)、雙側(cè)正中神經(jīng)、腓總神經(jīng)和脛神經(jīng)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)未引出波形，右側(cè)尺神經(jīng)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度減慢（肘上28.80 m/s、肘下30.60 m/s），復(fù)合肌肉動(dòng)作電位波幅下降（肘上和肘下均0.50 mV）；雙側(cè)正中神經(jīng)、腓淺神經(jīng)和腓腸神經(jīng)感覺(jué)神經(jīng)傳導(dǎo)未引出波形，雙側(cè)正中神經(jīng)感覺(jué)神經(jīng)傳導(dǎo)速度減慢（左側(cè)25.00 m/s、右側(cè)30.90 m/s），復(fù)合肌肉動(dòng)作電位波幅下降（左側(cè)1.90 μV、右側(cè)1.50 μV）。針極肌電圖顯示，右側(cè)脛前肌、股四頭肌、肱二頭肌、小指展肌纖顫、正銳電位；輕收縮時(shí)右側(cè)肱二頭肌動(dòng)作單位電位時(shí)相增寬，呈多相波，余肌肉未引出動(dòng)作單位電位?；驒z測(cè)顯示，GDAP1基因存在復(fù)合雜合突變c.571C ＞ T（p.Arg191X） 和 c.589delC （p.Asp198IlefsX8）。最終明確診斷為常染色體隱性遺傳性腓骨肌萎縮癥。未予藥物治療，囑患者至康復(fù)科進(jìn)行康復(fù)訓(xùn)練，未隨訪(fǎng)。

討 論

腓骨肌萎縮癥具有高度臨床異質(zhì)性和遺傳異質(zhì)性，其診斷主要依靠臨床表現(xiàn)、神經(jīng)電生理學(xué)檢查和基因診斷。臨床表現(xiàn)主要為青少年期發(fā)病，四肢遠(yuǎn)端無(wú)力和肌萎縮，腱反射減退或消失；神經(jīng)電生理學(xué)表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)和感覺(jué)神經(jīng)均受累，應(yīng)注意與慢性炎性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)根神經(jīng)病（CIDP）、遺傳性壓力敏感性周?chē)窠?jīng)病（HNPP）等相鑒別，特別是缺乏家族史的常染色體隱性遺傳性腓骨肌萎縮癥和新發(fā)突變患者。臨床診斷腓骨肌萎縮癥僅依靠臨床表現(xiàn)和神經(jīng)電生理學(xué)檢查結(jié)果可能造成漏診或誤診，基因檢測(cè)是其診斷關(guān)鍵。

腓骨肌萎縮癥致病基因多達(dá)70余種，約80%常染色體顯性遺傳性腓骨肌萎縮癥系PMP22、MPZ、GJB1、MFN2基因突變所致，根據(jù)臨床表現(xiàn)和神經(jīng)電生理學(xué)檢查，采用傳統(tǒng)基因檢測(cè)方法即可篩查出上述常見(jiàn)致病基因［2，11］；常染色體隱性遺傳性腓骨肌萎縮癥由于致病基因較多且每種基因發(fā)生率較低，故傳統(tǒng)基因檢測(cè)具有一定局限性［3］。近年迅速發(fā)展的目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序技術(shù)可以將腓骨肌萎縮癥相關(guān)致病基因富集于一個(gè)檢測(cè)芯片中，實(shí)現(xiàn)對(duì)所有腓骨肌萎縮癥相關(guān)致病基因的快速高通量測(cè)序［6?11］。本研究采用目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序技術(shù)對(duì)5例臨床擬診腓骨肌萎縮癥患者及其家系進(jìn)行篩查，明確2例患兒致病基因?yàn)镚DAP1基因。

常染色體隱性遺傳性腓骨肌萎縮癥根據(jù)神經(jīng)傳導(dǎo)速度可分為脫髓鞘型（CMT1型）和軸索型（CMT2型），正中神經(jīng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度＞38 m/s為CMT1型，致病基因?yàn)镚DAP1、MTMR2、SBF1、SBF2、SH3TC2、NDRG1、EGR2、PRX、HK1、FGD4、FIG4、SURF1基因；正中神經(jīng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度＜38 m/s為CMT2 型 ，致 病 基 因 為 LMNA、MED25、NEFL、HSBP1、GDAP1、LRSAM1、MFN2、HINT1 基因［3，12］，其中，GDAP1基因?yàn)槌Ｈ旧w隱性遺傳性腓骨肌萎縮癥最常見(jiàn)致病基因。有文獻(xiàn)報(bào)道，西班牙腓骨肌萎縮癥患者GDAP1基因突變率約為11.5%［11］。GDAP1基因突變導(dǎo)致的周?chē)窠?jīng)損害較為復(fù)雜，兼有脫髓鞘型（CMT1A型）以及軸索型（CMT2H型和CMT2K 型）［3，12］，發(fā)病年齡較小，CMT1 型發(fā)病年齡 ＜2歲，CMT2型發(fā)病年齡＜10歲且周?chē)窠?jīng)損害癥狀更嚴(yán)重；部分伴其他系統(tǒng)損害，如CMT1A型伴聲帶和膈肌麻痹，CMT2H型伴錐體束征和聲帶異常，CMT2K型伴聲帶麻痹和骨骼畸形［3，12］。本研究經(jīng)基因檢測(cè)證實(shí)2例患兒為GDAP1基因突變致常染色體隱性遺傳性腓骨肌萎縮癥，根據(jù)神經(jīng)電生理學(xué)檢查結(jié)果，例1符合CMT2K型，例2符合CMT1A型，均為早發(fā)型腓骨肌萎縮癥，發(fā)病年齡與文獻(xiàn)報(bào)道相符［3］，但未伴除周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)外的其他系統(tǒng)損害。

目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序技術(shù)作為一種高通量測(cè)序方法，可以同時(shí)檢測(cè)數(shù)百至數(shù)千種基因突變情況，較傳統(tǒng)Sanger測(cè)序技術(shù)省時(shí)、省力，既提高基因檢測(cè)效率，且檢測(cè)費(fèi)用較全外顯子測(cè)序（WES）和全基因組測(cè)序（WGS）低。因此，目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序技術(shù)是一種簡(jiǎn)便、高效、可靠的基因檢測(cè)方法，適用于單基因遺傳病的臨床診斷，可以作為常染色體隱性遺傳性腓骨肌萎縮癥基因診斷的有力輔助工具，具有較高的臨床價(jià)值。

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Target region capture sequencing for detecting GDAP1 gene mutation of autosomal recessive Charcot?Marie?Tooth disease

HE Jin,XU Guo?rong,LIN Han,WANG Ning,CHEN Wan?jin
Department of Neurology,the First Affiliated Hospital of Fujian Medical University,Fuzhou 350005,Fujian,China
Corresponding author:CHEN Wan?jin(Email:wanjinchen75@fjmu.edu.cn)

BackgroundOwing to the clinical variability and molecular heterogeneity,the traditional Sanger sequencing takes time and effort and is inefficient.In this paper,target region capture sequencing in the diagnosing of autosomal recessive Charcot?Marie?Tooth disease(AR?CMT)is explored.MethodsClinical data and peripheral blood sample of 5 clinically suspected AR?CMT patients were collected.Charcot?Marie?Tooth disease(CMT)related gene mutation were detected by target region capture sequencing.The candidate variants were confirmed in the peripheral blood sample of the patients and their parents by Sanger sequencing.ResultsTarget region capture sequencing revealed that compound heterozygous mutations of GDAP1 gene was found in 2 patients,and was not seen in the other 3 patients.Sangersequencing revealed thatamongthe 2 patientswith mutation ofGDAP1 gene,compound heterozygous mutation c.767A＞G(p.His256Arg)and c.866T＞A(p.Phe289Tyr)were seen in Case 1,whose father carried c.866T＞A(p.Phe289Tyr)heterozygous mutation and mother carried c.767A＞G(p.His256Arg)heterozygous mutation,while compound heterozygous mutation c.571C＞T(p.Arg191X)and c.589delC(p.Asp198IlefsX8)were seen in Case 2,whose father carried c.589delC(p.Asp198IlefsX8)heterozygous mutation and mother carried c.571C＞T(p.Arg191X)heterozygous mutation.Therefore,Case 1 and Case 2 were all diagnosed as AR?CMT.ConclusionsTarget region capture sequencing is a rapid and reliable genetic testing method with high efficiency.It is applicable for the diagnosis of AR?CMT.

Charcot?Marie?Tooth disease; Genes,recessive; Mutation; Pedigree

10.3969/j.issn.1672?6731.2017.08.009

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金資助項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：81500980）；福建省衛(wèi)生廳青年科研課題（項(xiàng)目編號(hào)：2014-1-54）

350005福州，福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

陳萬(wàn)金（Email：wanjinchen75@fjmu.edu.cn）

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China for Young Scientists(No.81500980)and the Youth Scientific Research Subject supported by the Health Department of Fujian Province,China(No.2014-1-54).

2017?06?15）