右美托咪定對神經(jīng)病理性痛大鼠脊髓背角COX-2和c-fos表達的影響*

秦夢婷，邱忠鵬，王業(yè)忠

（石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院 1.重癥醫(yī)學(xué)一科，2.骨二科，新疆 石河子 832008）

右美托咪定對神經(jīng)病理性痛大鼠脊髓背角COX-2和c-fos表達的影響*

秦夢婷1，邱忠鵬2，王業(yè)忠1

（石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院 1.重癥醫(yī)學(xué)一科，2.骨二科，新疆 石河子 832008）

目的探討右美托咪定對神經(jīng)病理性痛大鼠脊髓背角COX-2和c-fos表達的影響。方法90只健康成年雄性Wistar大鼠隨機分為假手術(shù)組（n=30）、神經(jīng)病理性痛組（n=30）和右美托咪定組（n=30），利用坐骨神經(jīng)結(jié)扎的方法復(fù)制神經(jīng)病理性痛模型，右美托咪定組大鼠于術(shù)后即刻開始至處死前1天，每天腹腔注射50 μg/kg右美托咪定，1次/d，其他兩組大鼠給予等容量生理鹽水腹腔注射。分別于術(shù)前1 d（T0）、術(shù)后3 d（T1）、術(shù)后 7 d（T2）和術(shù)后 14 d（T3）對造模大鼠熱痛閾（TWL）和機械痛閾（MWT）進行測定，分別于 T1、T2和 T3時測定完TWL和MWT后，處死并取脊髓組織，利用實時熒光定量PCR檢測大鼠脊髓背角中COX-2 mRNA和c-fos mRNA表達。結(jié)果與假手術(shù)組比較，神經(jīng)病理性痛組和右美托咪定組大鼠T1～T3時TWL均縮短，MWT均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），與神經(jīng)病理性痛組比較，右美托咪定組大鼠T1～T3時TWL均延長，而MWT均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與假手術(shù)組比較，神經(jīng)病理性痛組和右美托咪定組大鼠T1～T3時COX-2 mRNA相對表達量和c-fos mRNA相對表達量均升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），與神經(jīng)病理性痛組相比，右美托咪定組大鼠T1～T3時COX-2 mRNA相對表達量和c-fos mRNA相對表達量均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論右美托咪定可有效抑制神經(jīng)病理性痛大鼠中樞痛覺敏化，其機制可能與下調(diào)脊髓背角COX-2和c-fos表達有關(guān)。

右美托咪定；神經(jīng)病理性痛；大鼠；環(huán)氧化酶-2；c-fos

右美托咪定是一種美托咪定的右旋異構(gòu)體，可高選擇性激動α2腎上腺素能受體，在鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜及抗交感神經(jīng)活性等方面發(fā)揮重要作用[1]，有研究指出[2]，右美托咪定可有效緩解神經(jīng)病理性疼痛。但具體作用機制尚未完全研究清楚。有研究指出[3]，外周神經(jīng)發(fā)生損傷后，環(huán)氧化酶2（cyclooxygenase 2，COX-2）在脊髓背角中的表達上調(diào)，通過一系列細(xì)胞級聯(lián)反應(yīng)而使脊髓神經(jīng)元敏化，引發(fā)并維持神經(jīng)病理性疼痛。c-fos基因在細(xì)胞分化、繁殖、生長及信息傳遞等過程中發(fā)揮重要作用[4]，其在正常生理狀態(tài)下在神經(jīng)元細(xì)胞中呈極低表達水平，但當(dāng)外界出現(xiàn)機械或物理性刺激時，會導(dǎo)致脊髓中c-fos大量表達，從而導(dǎo)致脊髓神經(jīng)元可塑性變化，可能是引起中樞敏化的原因之一[5]。本研究擬探討右美托咪定對神經(jīng)病理性痛大鼠脊髓背角COX-2和c-fos表達的影響，分析其鎮(zhèn)痛的可能機制，以期為臨床實踐提供理論基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

90只健康成年雄性Wistar大鼠，由河南省實驗動物中心提供，體重185～220 g，7周齡，飼養(yǎng)于24℃室溫條件下，相對濕度50%～60%，自由攝食和飲水。利用隨機數(shù)字表隨機分為假手術(shù)組（n=30）、神經(jīng)病理性痛組（n=30）和右美托咪定組（n=30）。

1.2 模型復(fù)制及處理

按照文獻[6]的步驟復(fù)制大鼠坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷模型：利用40 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠后，將右后肢股骨中段皮膚切開，對肌肉進行分離，使坐骨神經(jīng)暴露，利用4-0絲線在坐骨神經(jīng)干上松扎4道，每道間隔1 mm左右，保證神經(jīng)外膜稍微受壓但又不讓血管完全阻斷，結(jié)扎過程可見大鼠肢體輕微發(fā)生抽動。操作完畢，用2 mg青霉素對切口進行外敷以防感染。假手術(shù)組大鼠僅對坐骨神經(jīng)進行分離但不行結(jié)扎，右美托咪定組大鼠于術(shù)后即刻開始至處死前1天，每天腹腔注射50 μg/kg右美托咪定（批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H20090248，生產(chǎn)單位：江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司），1次/d，其他兩組大鼠給予等容量生理鹽水腹腔注射。

分別于術(shù)前 1 d（T0）、術(shù)后 3 d（T1）、術(shù)后 7 d（T2）和術(shù)后14 d（T3）對造模大鼠熱痛閾（thermal pain threshold，TWL） 和 機 械 痛 閾 （mechanicalpain threshold，MWT）進行測定。利用XR1102熱刺痛儀（購自上海欣軟信息科技有限公司）對熱痛閾進行測定，大鼠置于厚度為3 mm的玻璃板上，利用熱輻光源對右后肢足底部進行照射，對從開始照射至出現(xiàn)縮足反應(yīng)的時間進行記錄，單次照射時間在20 s以內(nèi)，連續(xù)進行3次，每次間隔5 min，求均值。利用von Frey纖維絲（購自美國Stoelting公司）對機械痛閾進行測定，將大鼠置于透明玻璃箱內(nèi)，分別選取壓力 為 （0.41、0.52、0.87、1.16、2.05、3.61、5.50、8.28、10.33和16.73 g）的von Frey纖維絲，利用初始刺激壓力為2.05 g的纖維絲垂直緩慢地對大鼠右后肢足底部進行刺激，每次間隔＞30 s，以大鼠出現(xiàn)躲避、抬足或舔足反應(yīng)為陽性，以纖維絲發(fā)生90°彎曲而無反應(yīng)為陰性，采取序貫法[7]對MWT進行計算，并分別在閾值上下刺激5次，求均值。

1.3 實時熒光定量PCR檢測

分別于T1、T2和T3時隨機從各組選取10只大鼠，測定完TWL和MWT后，腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉后，斷頭處死?？焖偃〕鯨4～L6節(jié)段脊髓組織，放入已冷凍的凍存管內(nèi)，再保存于液氮中以備檢。利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）方法對大鼠脊髓中COX-2 mRNA和c-fos mRNA表達水平進行檢測，COX-2、c-fos及內(nèi)參引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計及合成。COX-2引物：正向 5'-CTGTATCCCGCCCTGCTGGTG-3'，反向5'-ACTTGCGTTGATGGTGGCTGTCTT-3'；c-fos引物：正向5'-CGGGTTTCAACGCGGACTAC-3'，反向5'-G TTGGCACTAGAGACGGACAGA-3'。取脊髓背角組織放入研缽內(nèi)進行迅速研磨，利用Trizol總RNA提取試劑盒（購自美國C&M biolabs公司）對組織中總RNA進行提取，并測定RNA純度，取A260/A280在1.8～2.0的標(biāo)本作為合格標(biāo)本。分別取2 μl總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄cDNA。利用美國ABI 7500型qRT-PCR儀（購自美國ABI公司）進行PCR擴增，擴增條件：95℃預(yù)變性 30 s，94℃ 10 s，74℃ 15 s，60℃ 15 s，連續(xù)進行35個循環(huán)。利用2-△△Ct法對COX-2 mRNA和c-fos mRNA在脊髓背角組織中的表達水平進行分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間和組內(nèi)比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠建模后情況

3組大鼠建模后均未見切口感染。假手術(shù)組大鼠未見明顯異常，神經(jīng)病理性痛組和右美托咪定組大鼠右后肢足趾出現(xiàn)并攏，輕度外翻狀，常表現(xiàn)懸空、抬足等異常行為。右美托咪定組大鼠在給藥后有輕度嗜睡現(xiàn)象，但容易被喚醒，醒后仍然可站立。

2.2 3組大鼠TWL和MWT情況

T0時，3組大鼠TWL和MWT差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與假手術(shù)組比較，神經(jīng)病理性痛組和右美托咪定組大鼠T1～T3時TWL均縮短，MWT均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與神經(jīng)病理性痛組比較，右美托咪定組大鼠T1～T3時TWL均延長，而MWT均升高；與T0時比較，神經(jīng)病理性痛組和右美托咪定組T1～T3時TWL均縮短，MWT均降低，與T1時比較，神經(jīng)病理性痛組和右美托咪定組T2～T3時TWL均縮短，MWT均降低，與T2時比較，神經(jīng)病理性痛組和右美托咪定組T3時TWL均延長，MWT則升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

2.3 3組大鼠不同時點脊髓背角組織中COX-2 mRNA和c-fos mRNA相對表達量

與假手術(shù)組比較，神經(jīng)病理性痛組和右美托咪定組大鼠T1～T3時COX-2 mRNA相對表達量和c-fos mRNA相對表達量均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與神經(jīng)病理性痛組比較，右美托咪定組大鼠T1～T3時COX-2 mRNA相對表達量和c-fos mRNA相對表達量均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與T1時比較，神經(jīng)病理性痛組和右美托咪定組大鼠T2～T3時COX-2 mRNA相對表達量和c-fos mRNA相對表達量均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與T2時比較，神經(jīng)病理性痛組和右美托咪定組大鼠T3時COX-2 mRNA相對表達和c-fos mRNA相對表達量均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表1 3組大鼠不同時間TWL和MWT比較 （±s）

表1 3組大鼠不同時間TWL和MWT比較 （±s）

注：1）與假手術(shù)組比較，P ＜0.05；2）與神經(jīng)病理性痛組比較，P ＜0.05；3）與同組內(nèi) T0時比較，P ＜0.05；4）與同組內(nèi) T1時比較，P ＜0.05；5）與同組內(nèi)T2時比較，P＜0.05

指標(biāo)組別T0（n=30）T1（n=30）T2（n=20）T3（n=10）TWL/s 假手術(shù)組（n=10） 16.7±1.1 15.7±1.0 15.3±0.9 16.2±1.2神經(jīng)病理性痛組（n=10） 16.5±0.9 11.2±0.61）3） 9.1±0.51）3）4） 9.6±0.61）3）4）5）右美托咪定組（n=10） 16.0±1.1 12.3±0.51）2）3） 9.9±0.71）2）3）4） 11.2±0.41）2）3）4）5）F值 1.140 386.187 786.553 243.898 P值 0.324 0.000 0.000 0.000 MWT/g 假手術(shù)組（n=10） 19.5±1.2 20.3±1.5 19.9±1.3 21.1±1.7神經(jīng)病理性痛組（n=10） 20.2±1.3 9.4±0.61）3） 7.2±0.41）3）4） 8.6±0.31）3）4）5）右美托咪定組（n=10） 19.9±1.4 12.6±0.81）2）3） 8.9±0.61）2）3）4） 10.1±0.51）2）3）4）5）F值 0.979 1 063.892 1 752.670 453.681 P值 0.380 0.000 0.000 0.000

表2 3組大鼠不同時間脊髓背角組織中COX-2 mRNA和c-fos mRNA相對表達量 （±s）

表2 3組大鼠不同時間脊髓背角組織中COX-2 mRNA和c-fos mRNA相對表達量 （±s）

指標(biāo) 組別 T1 T2 T3 COX-2 mRNA 假手術(shù)組（n=10） 1.05±0.04 1.09±0.06 1.07±0.10神經(jīng)病理性痛組（n=10） 3.61±0.141） 7.43±0.251）4） 5.38±0.201）4）右美托咪定組（n=10） 2.08±0.071）2） 5.52±0.131）2）4） 2.94±0.161）2）4）F值 2033.126 5256.238 1857.225 P值 0.000 0.000 0.000

續(xù)表2

3 討論

神經(jīng)病理性痛作為常見的慢性疼痛，患者常出現(xiàn)異常疼痛、痛覺過敏或感覺異常等癥狀，給患者生存質(zhì)量帶來嚴(yán)重影響[8]，本研究復(fù)制神經(jīng)病理性痛大鼠模型，結(jié)果顯示，神經(jīng)病理性痛組和右美托咪定組大鼠右后肢足趾出現(xiàn)并攏，輕度外翻狀，常表現(xiàn)懸空、抬足等異常行為，且與假手術(shù)組比較，神經(jīng)病理性痛組和右美托咪定組大鼠T1～T3時TWL均縮短，MWT均降低，說明制備的神經(jīng)病理性痛大鼠模型復(fù)制成功。

本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，神經(jīng)病理性痛組和右美托咪定組大鼠T1～T3時COX-2 mRNA相對表達量和c-fos mRNA相對表達量均升高，說明神經(jīng)病理性痛發(fā)生與脊髓背角中COX-2和c-fos表達上調(diào)有關(guān)，且隨時間表達變化情況與痛閾變化相一致，提示COX-2和c-fos參與神經(jīng)病理性痛的發(fā)生及進展過程，分析原因，當(dāng)外周神經(jīng)發(fā)生損傷時，會特異性激活胞內(nèi)型磷脂酶A2活性，激發(fā)脊髓磷脂酶-環(huán)氧化酶-前列腺素級聯(lián)通路級聯(lián)放大反應(yīng)[9]，使COX-2表達升高、前列腺素物質(zhì)釋放增多，從而使谷氨酸等末梢神經(jīng)興奮物質(zhì)釋放增加[10]，進而激活脊髓背角神經(jīng)元NMDA受體，導(dǎo)致Ca2+內(nèi)流增加[11]，而神經(jīng)元內(nèi)增高的Ca2+又可促使cAMP生成，導(dǎo)致AMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白磷酸化而被激活，進一步與cAMP反應(yīng)元件結(jié)合而促使c-fos基因大量表達，產(chǎn)生的c-fos蛋白則可與c-jun蛋白結(jié)合形成復(fù)合物，通過激活目的基因而促使炎癥因子合成及釋放，從而引起痛覺過敏[12]。

本研究結(jié)果顯示，在給予大鼠腹腔注射右美托咪定后，模型大鼠痛閾增高，神經(jīng)病理性痛緩解，與神經(jīng)病理性痛組比較，右美托咪定組大鼠T1～T3時COX-2 mRNA相對表達量和c-fos mRNA相對表達量均降低，提示右美托咪定可通過抑制脊髓背角組織中COX-2和c-fos的表達，而達到抑制神經(jīng)病理性痛。分析原因，右美托咪定通過抑制COX-2表達及活性，減少前列腺素的產(chǎn)生，引起谷氨酸受體介導(dǎo)的興奮性突觸后電流減少，使突觸前膜自發(fā)性釋放谷氨酸降低[13]，同時，前列腺素水平的降低亦可使突觸前膜電壓依賴性Ca2+內(nèi)流減少，加之右美托咪定本身可通過特異性激活α2腎上腺素能受體，對脊髓背角神經(jīng)元Ca2+通道進行抑制[14]，從而降低胞內(nèi)Ca2+水平，從而使cAMP合成減少，c-fos基因表達被抑制，炎癥因子合成減少，從而抑制痛覺過敏的發(fā)生。

綜上所述，右美托咪定可有效抑制神經(jīng)病理性痛大鼠中樞痛覺敏化，其機制可能與下調(diào)COX-2和c-fos表達有關(guān)。

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（王榮兵 編輯）

Effect of Dexmedetomidine on spinal expression of COX-2 and c-fos in rat models of neuropathic pain*

Meng-ting Qin1,Zhong-peng Qiu2,Ye-zhong Wang1
(1.Department of Critical Medicine,2.Department of Orthopedics,First Affiliated Hospital of Shihezi University,Shihezi,Xingjiang 832008,China)

ObjectiveTo investigate the effects of Dexmedetomidine on spinal expressions of cyclooxygenase-2 (COX-2)and c-fos in spinal dorsal horns of rat models of neuropathic pain.MethodsA total of 90 healthy adult male Wistar rats were randomly divided into sham group (n=30),neuropathic pain group(n=30)and Dexmedetomidine group(n=30).Rat models of neuropathic pain were established by sciatic nerve ligation.Sham operated rats

all procedure except for sciatic nerve ligation.Dexmedetomidine was intraperitoneally injected(50 μg/kg)daily in the Dexmedetomidine group.Vehicle saline were administered into the remaining animals.Thermal pain threshold (TWL)and mechanical pain threshold (MWT)were measured 1 day before operation(T0),and the 3th d(T1),7th d(T2)and 14th d(T3)after surgery,then spine were harvested immediately.COX-2 and c-fos in spinal cord dorsal horns were determined by real-time quantitative PCR.ResultsCompared with the sham group,TWL and MWT in the neuropathic pain group and Dexmedetomidine group decreased significantly at T1～T3(P＜ 0.05);TWL and MWT in the Dexmedetomidine group increased.at T1～T3(P＜ 0.05)compared with the neuropathic pain group.Expression levels of COX-2 mRNA and c-fos mRNA in the neuropathic pain group and the Dexmedetomidine group were increased at T1～T3dramatically (P＜ 0.05),but was alleviated by treatment of Dexmedetomidine compared between the neuropathic pain group and Dexmedetomidine group (P＜0.05).Conclusion Dexmedetomidine inhibits central neuropathic hyperalgesia in rat models of neuropathic pain,which may be related to down-regulation of COX-2 and c-fos.

Dexmedetomidine;neuropathic pain;cyclooxygenase-2;c-fos

R791.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.27.003

1005-8982（2017）27-0012-05

2017-05-30

國家自然科學(xué)基金（No：81360185）