沈 益，胡 南

(南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 211800)

多種修復(fù)技術(shù)對(duì)城市內(nèi)河水質(zhì)及微生物群落的影響

沈 益，胡 南

(南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 211800)

河流治理；微生物群落；高通量測序；水質(zhì)修復(fù)；城市內(nèi)河

城市發(fā)展過程中，工業(yè)廢水、生活污水、農(nóng)業(yè)用水的直接排放，使得城市河流水體N、P等水質(zhì)因子嚴(yán)重超標(biāo)，水體富營養(yǎng)化嚴(yán)重。城市河流水體污染的加劇、生態(tài)環(huán)境的退化以及水體自凈能力的減弱[1]，嚴(yán)重影響了城市河流的各項(xiàng)生態(tài)功能。

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，河流水體微生物群落結(jié)構(gòu)的變化越來越受到關(guān)注[9]。普遍認(rèn)為，河流生態(tài)系統(tǒng)中，微生物的吸收、代謝對(duì)水體本身的自凈和修復(fù)發(fā)揮著極其重要的作用。若河流本身的微生物群落結(jié)構(gòu)遭到破壞，即使短時(shí)間治污成效明顯，也極易再次污染，因此水體微生物群落結(jié)構(gòu)的多樣性與豐度逐漸被當(dāng)作鑒定河流水質(zhì)的一項(xiàng)重要指標(biāo)[10-11]。劉正輝[12]通過高通量測序、熒光定量PCR等技術(shù)測定了東江水體的微生物群落結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)東江上下游的微生物群落主要為變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)和擬桿菌門(Bacteridetes)，且受水體氮質(zhì)量濃度的梯度變化影響，這些微生物群落具有顯著的季節(jié)和空間變化特性。譚旭[13]通過高通量測序技術(shù)分析了赤水河水體的微生物多樣性，發(fā)現(xiàn)赤水河中優(yōu)勢菌群為變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteridetes)和放線菌門(Actinobacteria)，且赤水河夏季的微生物豐度及多樣性均高于冬季。

雖然關(guān)于水體修復(fù)的研究報(bào)道有很多，但多數(shù)集中于江河、湖泊的水體修復(fù)，而關(guān)于城市內(nèi)流河的水體修復(fù)研究較少，缺少對(duì)比和優(yōu)化，鑒定指標(biāo)也以水質(zhì)參數(shù)為主，需要豐富和完善。筆者采用不同的修復(fù)技術(shù)對(duì)同一河流水域的水樣進(jìn)行修復(fù)，以水質(zhì)參數(shù)、微生物多樣性、菌群豐度為鑒定指標(biāo)，全面分析不同的修復(fù)技術(shù)對(duì)城市河流的修復(fù)效果，旨在為城市河流的水體修復(fù)提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集與處理

圖1 有機(jī)玻璃儲(chǔ)水器示意圖

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與準(zhǔn)備

實(shí)驗(yàn)所用的菌劑為光合細(xì)菌和反硝化芽孢桿菌。光合細(xì)菌在市場購得，反硝化芽孢桿菌為實(shí)驗(yàn)室從環(huán)境中篩選出的除氮、脫COD較強(qiáng)的兩株芽孢桿菌GY-45和GY-46。實(shí)驗(yàn)所用碳源為乙酸(分析純AR)，每次的投加量為3 g，COD理論增加值為12.12 mg/L。所用增氧設(shè)備為ACO-001電磁式空氣泵(浙江森森實(shí)業(yè)有限公司)，用玻璃轉(zhuǎn)子流量計(jì)(LZB-3WB)控制增氧流量為0.63 dm3/min。實(shí)驗(yàn)周期為8 d，增氧方式采用連續(xù)增氧，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。菌劑和碳源的投加時(shí)間為實(shí)驗(yàn)前4 d，每天上午9點(diǎn)。其中，光合菌劑(YSB)每天的投加量為5 mL，反硝化芽孢桿菌(GY-45,GY-46)每天的投加量為1.5 mg。實(shí)驗(yàn)中，菌劑、碳源以及投加量等，均為目前城市內(nèi)河治理中常用的菌劑、碳源種類和劑量。

表1 不同儲(chǔ)水器的處理方案

注：1～6 表示儲(chǔ)水器的編號(hào)；A、B、C、M分別表示增氧(aeration)、空白(blank)、碳源(carbon)、菌劑(microbe)。

1.3 水質(zhì)分析方法

1.4 水樣總DNA的提取

每個(gè)儲(chǔ)水器取250 mL水樣，用0.22 μm微孔濾膜過濾后，在超凈工作臺(tái)將濾膜剪碎，放入50 mL離心管中。用水樣DNA提取試劑盒(OMEGA)提取樣品總DNA。

1.5 16S rDNA片段的 PCR擴(kuò)增

PCR采用TransStartFastPfu DNA PolyMerase，20 μL 反應(yīng)體系：4 μL 5×FastPfu Buffer；2 μL 1.5 mM dNTPs；0.8 μL Forward Primer(5 μmoL/L)；0.8 μL Reverse Primer(5 μmoL/L)；0.4 μL FastPfu Polymerase；10 ng Template DNA；補(bǔ)ddH2O至20 μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s；55℃退火30 s；72℃延伸45 s，共計(jì)27個(gè)循環(huán)。最后72℃退火5 min，10℃保存。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

1.6 數(shù)據(jù)處理

本文所用繪圖軟件為origin 8.0。采用CANNO軟件進(jìn)行PCA、RDA等相關(guān)性分析

2 結(jié)果分析

2.1 水質(zhì)凈化效果

表2是各儲(chǔ)水器凈化后的水質(zhì)參數(shù)。從表2可以看出，與對(duì)照水樣(1B)相比，2C水樣的DO值明顯降低，僅為0.1 mg/L；4M水樣DO值也略微下降，為4.9 mg/L；其余各水樣的DO值均顯著上升，在7.2～8.6 mg/L之間，達(dá)到并超過國家Ⅱ類水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)。這主要是由于在投加碳源之后，提高水體微生物反硝化能力的同時(shí)也為水體微生物的生長提供了更加有利的條件，但微生物的生長必然會(huì)消耗大量的DO[14]。

在脫氮方面，與對(duì)照水樣(1B)相比，2C、5CA和6CAM水樣的TN均明顯降低，脫氮率分別為57.94%、60.59%和59.71%，脫氮效果顯著[15]。而3A和4M水樣的TN沒有明顯變化，說明單獨(dú)添加菌劑或者增氧對(duì)水體脫氮均無明顯作用。其中，菌劑的脫氮效果與實(shí)驗(yàn)室對(duì)菌株脫氮效率的測定結(jié)果存在較大差距，這可能是因?yàn)榫昝摰实臏y定是在較高濃度的TN環(huán)境(35.14 mg/L)下進(jìn)行的，而實(shí)驗(yàn)水樣中的TN值(3.40 mg/L)遠(yuǎn)低于這個(gè)水平。

COD脫除方面，3A、4M的 COD質(zhì)量濃度分別為23.32 mg/L和12.93 mg/L，COD脫除率分別為32.87%和62.78%，而其他水樣COD的質(zhì)量濃度均有所增加，這可能是由于添加的碳源沒有被及時(shí)利用所致。

表2 各儲(chǔ)水器的水質(zhì)參數(shù)

與對(duì)照水樣(1B)相比，其余水樣的細(xì)菌總數(shù)(TB)均增加了2～72倍，2C水樣增加尤為顯著，這說明了實(shí)驗(yàn)所用的修復(fù)技術(shù)有利于水體微生物的生長。

2.2 菌落結(jié)構(gòu)多樣性分析

將擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行高通量測序，得到的16s rRNA基因序列數(shù)目和OTUs總數(shù)見表3。通過Shannon指數(shù)和PD whole tree指數(shù)評(píng)估各水樣微生物群落的多樣性。從表3可以看出，各水樣均有高于88%的OTUs被發(fā)現(xiàn)，測序結(jié)果可以真實(shí)地反映水樣的微生物群落結(jié)構(gòu)。2C水樣的Shannon多樣性指數(shù)和PD whole tree多樣性指數(shù)均明顯低于1B和其他水樣，說明2C水樣的微生物多樣性在投加碳源之后明顯降低，水體生態(tài)極其脆弱。3A和4M水樣分別應(yīng)用了曝氣和生物投菌技術(shù)，其PD whole tree指數(shù)分別為61.25和61.09，與原樣相比，水體的生物多樣性均有所增加，但是低于5CA和6CAM水樣，這兩個(gè)水樣綜合運(yùn)用了多種生物修復(fù)技術(shù)，PD whole tree多樣性指數(shù)分別為65.44和68.61。

表3 不同方法處理后水體微生物OTUs多樣性分析

高通量測序結(jié)果表明，1B、2C、3A、4M、5CA、6CAM中的微生物分別隸屬于31、18、33、34、32、36個(gè)門，其水樣的微生物群落門水平相對(duì)豐度見圖2。從圖2可知，2C水樣中的微生物種群多樣性明顯低于其他水樣，且以變形菌門(Proteobacteria93%)為主，其次為擬桿菌門(Bacteroidetes1%)和厚壁菌門(Firmicutes4%)，在其他細(xì)菌門中的分布均低于0.1%。其余各水樣中的微生物主要以變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)和疣微菌門(Verrucomicrobia)為主，其次為厚壁菌門(Firmicutes)、浮霉菌門(Planctomycetes)、綠菌門(Chlorobi)、酸桿菌門(Acidobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、芽單胞菌門(Gemmatimonadete)等。在其余水樣中，不同菌門的相對(duì)豐度也有差別。3A和4M水樣中優(yōu)勢菌門的豐度比較相似，而在5CA水樣中，變形菌門(Proteobacteria63%)的相對(duì)豐度與原樣相比提高了6%，放線菌門(Actinobacteria9%)的相對(duì)豐度則降低了11%。6CAM在變形菌門(Proteobacteria47%)的相對(duì)豐度則低于1B，而其在擬桿菌門(Bacteroidetes38%)的相對(duì)豐度則明顯高于1B、2C、3A、4M(16%、7%、9%、15%)。

圖2 不同水樣微生物群落門水平下相對(duì)豐度比較

變形菌門雖然是各水樣的主要優(yōu)勢菌群，但其在變形菌門內(nèi)的群落分布也有差別(圖3)。2C水淹的β-變形菌綱(Betaproteobacteria 63%)和γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria 22%)在變形菌門中占據(jù)著極大的優(yōu)勢。3A和4M水樣的β-變形菌綱(Betaproteobacteria 38% 37%)、γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria 13% 18%)和α-變形菌綱(Alphaproteobacteria11% 20%)在其水樣中的豐度則大致相同。5CAM水樣中也是以β-變形菌(Betaproteobacteria 32%)為主，α-變形菌綱(Alphaproteobacteria 16%)的豐度略高于γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria 11%)。6CAM水樣β-變形菌綱(Betaproteobacteria 32%)豐度與5CAM水樣相同，而α-變形菌綱(Alphaproteobacteria 15%)的豐度要明顯高于γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria 5%)。由此可見，投加了碳源的水樣(2C)，水體微生物多樣性急劇下降，優(yōu)勢菌群極少，水體生態(tài)很差。而經(jīng)過曝氣(3A)、生物投菌技術(shù)(4M)后的水樣，種群豐度和多樣性均比較相似，高于原樣，水體生態(tài)得到修復(fù)。綜合處理(5CA、6CAM)的水樣，種群豐度和多樣性有較大差別，高于原樣，水體生態(tài)修復(fù)效果高于其余水樣。

1B、2C、3A、4M、5CA、6CAM中的微生物分別隸屬于96、51、109、94、102、106個(gè)屬，豐度高于0.1%的優(yōu)勢菌屬分別有14個(gè)、6個(gè)、18個(gè)、17個(gè)、13個(gè)和16個(gè)(表4)。其中，各水樣中，芽孢桿菌屬(Bacillus)和紅細(xì)菌屬(Rhodobacter)的相對(duì)豐度分別為0.007%、0.001%、0.040%、0.100%、0.009%、0.100%和0.100%、0.020%、0.200%、0.700%、0.300%、0.700%。這表明，實(shí)驗(yàn)所用的光合細(xì)菌和反硝化芽孢桿菌在投加后均得到了較好的生長。

圖3 各水樣中微生物群落的綱水平豐度

門類種屬1Blank2C3D4B5CD6BCD變形菌門噬氫菌屬++++紅長命菌屬++++水小桿菌屬++多核桿菌屬+++++脫氯菌屬++++++動(dòng)膠菌屬++色素細(xì)菌+++++

續(xù)表4

注：“+”為相對(duì)豐度大于0.1%的屬。

2.3 相關(guān)性分析

通過不同樣本的主要微生物種屬對(duì)各樣本進(jìn)行主成分分析(PCA)，見圖4。PCA的前兩個(gè)變量共可解釋76.7%的數(shù)據(jù)，其中第一軸可以解釋55.8%的數(shù)據(jù)，第二軸可以解釋20.9%的數(shù)據(jù)。從圖4可以看出，1B、3A和4M樣品在PCA圖上的距離接近，表明這3個(gè)樣本的群落組成很相似，而5CA和6CAM的群落組成則較為相似。2C距離其他樣本較遠(yuǎn)，表明2C樣本的群落組成與其他樣本差異很大。這說明了在河流治理過程中，添加碳源容易改變水體本身的群落組成，少數(shù)菌群容易競爭形成優(yōu)勢菌群，并對(duì)微生物的生長產(chǎn)生抑制作用，而增氧和投菌技術(shù)在提高生物多樣性的同時(shí)，不會(huì)對(duì)水體微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生較為明顯的變化。

圖4 不同樣本的主成分分析

圖5 不同樣本的降趨勢對(duì)應(yīng)分析

3 討 論

4 結(jié) 論

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Effectsofvariousremediationtechnologiesonwaterqualityandmicrobialcommunityinurbaninlandrivers

SHENYi,HUNan

(SchoolofBiologicalandPharmaceuticalEngineering,NanjingTECHUniversity,Nanjing211800,China)

river improvement; microbial community; high-throughput sequencing; water quality restoration

10.3880/j.issn.1004-6933.2017.06.26

沈益(1991—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)榄h(huán)境微生物。E-mail:406205391@qq.com

X522

A

1004-6933(2017)06-0167-08

2016-11-28 編輯：彭桃英)