管 瑩，李雪梅，米其利，熊國行，夭建華

(云南中煙工業(yè)有限責任公司，云南 昆明 650231)

Ames試驗重要影響因素研究

管 瑩，李雪梅，米其利，熊國行，夭建華*

(云南中煙工業(yè)有限責任公司，云南 昆明 650231)

為了提高Ames試驗的可靠性和可重復性，對檢測體系中組氨酸濃度、菌液濃度和S9濃度對細菌回變菌落數(shù)的影響進行了研究。先以組氨酸濃度、菌液濃度和S9濃度分別為單一變量考察其對Ames試驗結(jié)果的影響；再以正交試驗綜合考察組氨酸濃度、菌液濃度、S9濃度3個因素的交互作用。結(jié)果表明，組氨酸濃度、菌液濃度、S9濃度均對Ames試驗的結(jié)果產(chǎn)生影響，且3個影響因素之間可能存在交互關(guān)系。因此，應(yīng)對組氨酸濃度、菌液濃度、S9濃度予以控制。

Ames試驗；劑量效應(yīng)關(guān)系；假陰性；假陽性

現(xiàn)今，化學物質(zhì)及其污染物對人體的潛在危害越來越受到社會的普遍關(guān)注與重視。Ames等于1975年建立并不斷發(fā)展完善的沙門氏菌回復突變試驗(Ames試驗)被世界各國及組織廣為采用，是目前國際公認的檢測新藥、食品添加劑、食品包裝材料及化妝品等的致突變性、致癌性的首選試驗[1-5]。Ames試驗是利用鼠傷寒沙門氏菌Salmonellatyphimurium的組氨酸 (histidine)營養(yǎng)缺陷型突變株 (His-) 發(fā)生回復突變的性質(zhì),對化學物質(zhì)致突變性進行初步篩選的短期體外試驗方法[6]。

自Ames檢測體系建立以來，不斷有研究者對其進行各方面的改進，Ames試驗的準確性、有效性也得以不斷提高。但至今該試驗仍存在一些不確定性因素，例如被檢測體系中的組氨酸及其前體物(如多肽、蛋白質(zhì)等)的量對Ames試驗結(jié)果存在重要影響[7-10]，因為它們可以支持His-缺陷型細胞生長和分裂,增加最終回復子菌落數(shù)，從而造成假陽性；Ames試驗所用的沙門氏菌屬于原核生物，缺少代謝活化系統(tǒng)，故Ames試驗中需加入S9混合液作為代謝活化系統(tǒng)，該活化體系活性的強弱可能會對試驗結(jié)果產(chǎn)生影響；此外，由于Ames試驗是對產(chǎn)生回復突變的菌落數(shù)進行計數(shù)，檢測使用菌的量過低可能會導致受試物誘變能力表現(xiàn)不完全。

因此，為了提高Ames試驗結(jié)果的穩(wěn)定性與準確性，作者對影響Ames試驗結(jié)果的關(guān)鍵因素如組氨酸濃度、菌液濃度、S9濃度等進行了研究，以期為Ames試驗結(jié)果的穩(wěn)定性及可比性提供參考。

1 實驗

1.1 主要試劑與儀器

牛肉膏、瓊脂粉、氯化鈉、磷酸氫二鉀、葡萄糖、L-組氨酸、D-生物素、氯化鉀、氯化鎂、葡萄糖-6-氯酸鈉、S9混合液、2-氨基芴。

超凈工作臺、CERULEAN SM 450型低溫高速離心機、OLS 200型恒溫搖床、GSP-9270型恒溫培養(yǎng)箱、高速勻漿器、渦輪混合器、數(shù)迅V2型菌落計數(shù)儀、CERULEAN SM450型自動吸煙機。

1.2 方法

1.2.1 卷煙煙氣樣品的制備

按GB/T 19609-2004[11]，利用自動吸煙機抽吸20支標準測試用卷煙3R4F，用直徑92 mm的劍橋濾片捕集燃吸后產(chǎn)生的煙氣總粒相物(TPM)，并稱重TPM量；劍橋濾片放入三角瓶中，加入適量二甲基亞砜(DMSO)，置于超聲儀上超聲20 min；用無菌濾紙過濾，收集TPM提取液，調(diào)整TPM在DMSO中的終濃度為10 mg·mL-1。將樣品分裝后儲存于-80 ℃，待用。

1.2.2 Ames試驗

取營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基于無菌小三角瓶中，將主平板或冷凍保存的TA98菌株接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩(100 r·min-1)培養(yǎng)10 h或靜置培養(yǎng)16 h。達到對數(shù)生長期時，活菌數(shù)濃度不少于1×109個·mL-1。試驗設(shè)置陽性對照、溶劑對照以及受試物TPM等3個試驗組，其中受試物TPM設(shè)4個劑量組(每皿25 μg、50 μg、100 μg、200 μg)。將測試菌株新鮮菌液0.1 mL、受試物TPM 0.1 mL、10% S9混合液0.5 mL加入約2.0 mL保溫的頂層培養(yǎng)基中，在渦輪混合器上混勻后迅速倒入底層培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)動平皿使頂層培養(yǎng)基均勻分布在底層上，平放固化，于37 ℃培養(yǎng)48 h，觀察結(jié)果。

1.2.3 Ames試驗影響因素正交設(shè)計

在確定Ames試驗平板摻入法的基礎(chǔ)上，采用L16(45)正交試驗考察組氨酸濃度、菌液濃度(OD600)、S9濃度對Ames試驗的影響。正交試驗的因素與水平見表1。

表1正交試驗的因素與水平

Tab.1Factors and levels of orthogonal experiment

2 結(jié)果與討論

由于受試樣品3R4F TPM在TA98(-S9)、TA100(+S9)、TA100(-S9)試驗體系中均不會產(chǎn)生劑量效應(yīng)關(guān)系，故以下試驗均在TA98(+S9)試驗體系中進行。

2.1 組氨酸濃度對Ames試驗的影響

固定TA98菌液的OD600為0.476，S9濃度為10%(體積分數(shù)，下同)，分別在組氨酸濃度(mmol·L-1)為1、0.5、0.25、0.125條件下檢測3R4F TPM誘發(fā)回變菌落數(shù)，結(jié)果如表2所示。

表2組氨酸濃度對Ames試驗的影響

Tab.2Effect of histidine concentration on Ames test

從表2可以看出，組氨酸濃度的改變并未對劑量效應(yīng)曲線的線性關(guān)系產(chǎn)生顯著影響，但隨著組氨酸濃度的降低，TPM誘發(fā)回變菌落數(shù)呈下降趨勢，可見組氨酸濃度會對Ames試驗結(jié)果產(chǎn)生重要影響。

2.2 菌液濃度對Ames試驗的影響

固定組氨酸濃度為0.5 mmol·L-1，S9濃度為10%，600 nm波長下檢測待用TA98菌液吸光值，用肉湯培養(yǎng)基將菌液按比例稀釋至所需濃度后，分別檢測3R4F TPM誘發(fā)回變菌落數(shù)，結(jié)果見表3。

由表3可以看出，菌液濃度較低時，同一受試物TPM誘發(fā)回變菌落數(shù)出現(xiàn)了明顯降低，且劑量效應(yīng)曲線不存在線性關(guān)系。由此證明菌液濃度會對Ames試驗結(jié)果產(chǎn)生直接影響。

表3菌液濃度對Ames試驗的影響

Tab.3EffectofbacterialsolutionconcentrationonAmestest

菌液OD600自發(fā)回變(+S9)菌落數(shù)個·μg-1TPM誘發(fā)回變菌落數(shù)個·μg-1劑量效應(yīng)曲線R2值0.70021.67±3.211.0630.9850.50220.33±1.531.1470.9420.29521.00±3.000.6850.2540.09214.00±2.650.4610.191

2.3 S9 濃度對Ames試驗的影響

固定TA98菌液的OD600為0.476，頂層組氨酸濃度為0.5 mmol·L-1，分別用新制備的S9混合液和凍存于液氮中1.5年的S9混合液進行Ames試驗，檢測3R4F TPM誘發(fā)回變菌落數(shù)，結(jié)果見表4。

從表4可以看出，隨著S9濃度的降低，同一受試物TPM誘發(fā)回變菌落數(shù)出現(xiàn)了明顯降低，而自發(fā)回變菌落數(shù)并未有顯著變化。

表4S9濃度對Ames試驗的影響

Tab.4Effect of S9 concentration on Ames test

根據(jù)Ames試驗判定標準，當受試物組回變菌落數(shù)大于自發(fā)回變組回變菌落數(shù)2倍以上，即可認為該受試物誘變實驗結(jié)果呈陽性。從以上結(jié)果可知，由于S9濃度的降低導致受試物誘發(fā)回變菌落數(shù)的減少，而與之作為參照的自發(fā)回變菌落數(shù)并未受S9濃度降低的影響，由此可見S9濃度過低會影響Ames試驗對需要代謝活化才能表現(xiàn)致突變效應(yīng)的物質(zhì)毒性的檢出，產(chǎn)生假陰性。

2.4 正交試驗的結(jié)果與分析

正交試驗不同試驗組劑量效應(yīng)曲線結(jié)果見圖1。

圖1 正交試驗劑量效應(yīng)關(guān)系曲線Fig.1 Dose-effect relationship curves of orthogonal experiment

Ames試驗結(jié)果可信應(yīng)滿足以下2個重要指標：首先，在檢測劑量范圍內(nèi)劑量效應(yīng)曲線應(yīng)呈線性關(guān)系，對相應(yīng)試驗條件下劑量效應(yīng)曲線求其R2值，R2值越接近1則表示線性關(guān)系越好；其次，陽性對照組回變菌落數(shù)應(yīng)gt;1 000。根據(jù)以上原則，對16個試驗組關(guān)鍵試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，結(jié)果如表5所示。

由表5可以看出，以R2值gt;0.6為界，滿足以上條件的有試驗組1、2、6、12，對以上4個試驗組進行Duncan多重比對，結(jié)果無顯著差異(Pgt;0.05)。但這是對各個檢測劑量整體趨勢差異與否的檢測，產(chǎn)生陽性結(jié)果最低劑量(μg·皿-1)除試驗組1為50 μg·皿-1，其它可檢測到陽性結(jié)果的試驗組均為25 μg·皿-1，除此之外對平均回變菌落數(shù)進行統(tǒng)計分析，試驗組12僅為0.607個·μg-1，與其它3組存在顯著差異(Plt;0.05)。由以上結(jié)果還可看出，3個影響因素之間存在交互關(guān)系，并不是在某個限量范圍內(nèi)任意組合就能得出較好結(jié)果，因此不能單一的就每個影響因素給出一個限量范圍。

以劑量效應(yīng)曲線R2值為衡量標準，R2值越大試驗劑量效應(yīng)關(guān)系越好，以此為依據(jù)作正交試驗的因子趨勢圖，如圖2所示。

圖2 Ames影響因素正交試驗的因子趨勢圖Fig.2 Impact factor trend graphs of Ames testby orthogonal experiment

表5Ames試驗影響因素的正交試驗結(jié)果

Tab.5The orthogonal experiment results of Ames test influencing factors

由圖2可以看出，所考察的3個因素對Ames試驗的影響主次順序為C(S9濃度)gt;A(組氨酸濃度)gt;B(菌液濃度)。

2.5 討論

以組氨酸濃度、菌液濃度和S9濃度分別為單一變量考察其對Ames試驗結(jié)果的影響。首先，組氨酸濃度試驗結(jié)果顯示，組氨酸濃度的改變并未對劑量效應(yīng)曲線的線性關(guān)系產(chǎn)生顯著影響，但隨著組氨酸濃度的降低，TPM誘發(fā)回變菌落數(shù)呈下降趨勢。而TPM誘發(fā)回變菌落數(shù)越多并不代表試驗結(jié)果越可靠，這是由于組氨酸在試驗體系中扮演著一個特殊的角色，一方面Ames試驗中所用的培養(yǎng)基并非完全缺乏組氨酸,而是加入了微量的組氨酸,使營養(yǎng)缺陷型細菌能繁殖數(shù)代成為菌苔,同時使誘變物所產(chǎn)生的DNA損傷在復制過程中得到固定,從而又表現(xiàn)為功能基因細菌，只有這樣的回變細菌才能進一步生長為菌落；另一方面，檢測體系中的組氨酸及其前體物(如多肽、蛋白質(zhì)等)達到一定量時可以支持His-缺陷型細胞生長和分裂,增加最終回復子菌落數(shù)，從而造成假陽性。因此，作為影響Ames試驗結(jié)果的重要因素之一，組氨酸較為適宜的濃度還需進一步研究。

其次，菌液濃度試驗結(jié)果表明，菌液濃度較低時，TPM誘發(fā)回變菌落數(shù)出現(xiàn)了明顯降低，且劑量效應(yīng)曲線不存在線性關(guān)系。從所選定的4個菌液濃度檢測結(jié)果來看，菌液濃度OD600值應(yīng)不低于0.5。

再者，S9濃度試驗結(jié)果表明，隨著S9濃度的降低,TPM誘發(fā)回變菌落數(shù)出現(xiàn)了明顯降低，而自發(fā)回變菌落數(shù)并未有顯著變化。根據(jù)Ames試驗判定標準，當受試物組回變菌落數(shù)大于自發(fā)回變組回變菌落數(shù)2倍以上，即可認為該受試物誘變實驗結(jié)果呈陽性。從以上結(jié)果可知，由于S9濃度的降低導致TPM誘發(fā)回變菌落數(shù)減少，而與之作為參照的自發(fā)回變菌落數(shù)并未受S9濃度降低的影響，由此可見S9濃度過低會影響Ames試驗對需要代謝活化才能表現(xiàn)致突變效應(yīng)的物質(zhì)毒性的檢出產(chǎn)生假陰性。目前Ames試驗標準僅對所制備S9混合液蛋白量上限做出規(guī)定，而未對S9的實際使用量做出明確規(guī)定，由于S9混合液的制備過程涉及生物活體，存在個體誘導差異及環(huán)境等復雜因素，因此，不同人員不同批次制備的S9混合液必然存在一定差異。故對S9的實際使用量進行確定是十分必要的。

單變量試驗結(jié)果表明組氨酸濃度、菌液濃度、S9濃度均會對Ames試驗產(chǎn)生直接影響，但以上試驗結(jié)果并不能給出一個確定的條件范圍以保證Ames試驗結(jié)果的穩(wěn)定性及可比性。于是為了能夠找到較佳的試驗條件，我們設(shè)計了正交試驗，對3種因素的4個水平進行了考察，由于TPM誘發(fā)回變菌落數(shù)越多并不代表試驗結(jié)果越可靠，因此以劑量效應(yīng)曲線的線性程度R2值為衡量標準，R2值越大試驗條件越佳。正交試驗結(jié)果表明，在所考察的3個因素對Ames試驗影響的主次順序依次為：S9濃度gt;組氨酸濃度gt;菌液濃度。由于Ames試驗結(jié)果的正確性還存在多個標準，因此不能簡單地像一般正交試驗通過計算得出最優(yōu)處理條件。因此，我們首先以劑量效應(yīng)曲線線性程度和陽性對照組誘發(fā)回變菌落數(shù)為條件初篩，在16個試驗組中同時滿足R2值gt;0.6和陽性對照組回變菌落數(shù)gt; 1 000的有試驗組1、2、6、12；在這4組中除試驗組1產(chǎn)生陽性結(jié)果最低劑量為50 μg·皿-1，其它可檢測到陽性結(jié)果的試驗組最低劑量均為25 μg·皿-1；除此之外對平均回變菌落數(shù)(個·μg-1)進行統(tǒng)計分析，試驗組12僅為0.607個·μg-1，與其它3組存在顯著差異(Plt;0.05)。由以上結(jié)果還可看出，3個影響因素之間可能存在交互關(guān)系，并不是在某個限量范圍內(nèi)任意組合就能得出較好結(jié)果，因此不能單一的就每個影響因素給出一個限量范圍。從現(xiàn)已驗證的試驗條件來看，在試驗條件為試驗組2和6的試驗條件組合時，Ames試驗在檢測劑量范圍內(nèi)結(jié)果劑量效應(yīng)關(guān)系線性程度較高。由于正交試驗試驗組數(shù)有限，因此可能存在更優(yōu)的試驗條件組合，但試驗組2(1 mmol·L-1組氨酸、菌液OD6000.5、S9濃度10%)和試驗組6(0.5 mmol·L-1組氨酸、菌液OD6000.5、S9濃度20%)的試驗條件已經(jīng)能夠滿足試驗的靈敏度和準確度。

3 結(jié)論

為了提高Ames試驗結(jié)果的穩(wěn)定性及可比性，單因素試驗結(jié)果表明組氨酸濃度、菌液濃度、S9濃度是需要控制的重要影響因素。正交試驗表明3個影響因素之間可能存在交互關(guān)系，并不是在某個限量范圍內(nèi)任意組合就能得出較好結(jié)果，因此不能單一的就每個影響因素給出一個限量范圍。以1 mmol·L-1組氨酸、菌液OD6000.5、S9濃度10%或0.5 mmol·L-1組氨酸、菌液OD6000.5、S9濃度20%為組合條件，既能保證Ames試驗的靈敏度，也能夠使劑量效應(yīng)關(guān)系在所檢測劑量范圍內(nèi)呈較好的線性關(guān)系，保證了Ames試驗結(jié)果的準確性。

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MajorFactorsInfluencingAmesTest

GUAN Ying，LI Xue-mei，MI Qi-li，XIONG Guo-hang，YAO Jian-hua*

(ChinaTobaccoYunnanIndustrialCo.,Ltd.,Kunming650231,China)

In order to improve the reliability and repeatability of Ames test,we studied the effects of concentrations of histidine,bacterial solution,and S9 on the number of bacterial reversion mutation.Firstly,using histidine concentration,bacterial solution concentration,and S9 concentration as a single variable，respectively,we investigated the effects of them on Ames test results.Then,we studied the interaction among histidine concentration，bacterial solution concentration,and S9 concentration by an orthogonal experiment.Results show that histidine concentration,bacterial solution concentration,and S9 concentration all affect Ames test results,and there might be an interaction among the three factors.Therefore，histidine concentration，bacterial solution concentration,and S9 concentration should be controlled.

Ames test；dose-effect relationship；false negative；false positive

中國煙草總公司科技項目(110201501002(XX-02))，云南中煙工業(yè)有限責任公司科技項目(2016JC01)

2017-06-06

管瑩(1984-)，女，云南曲靖人，博士，助理研究員，研究方向：毒理學，E-mail：guan_ying2011@126.com；通訊作者：夭建華，博士，研究員。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.11.009

管瑩，李雪梅，米其利，等.Ames試驗重要影響因素研究[J].化學與生物工程，2017，34(11)：35-39.

X503

A

1672-5425(2017)11-0035-05