林穎 邢泉 高現(xiàn)靈 徐萌 林正梅

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

Sema3A/Nrp1信號軸在慢性牙周炎牙周組織中的表達及在牙周骨質(zhì)破壞中的作用

林穎 邢泉 高現(xiàn)靈 徐萌 林正梅

目的研究軸突導(dǎo)向蛋白3A(semaphorins3A, Sema3A)及其受體神經(jīng)纖毛蛋白-1(neuropilin-1, Nrp1)在慢性牙周炎發(fā)生發(fā)展中的作用。方法20 只SD大鼠隨機分為2 組(n=10)，實驗組建立慢性牙周炎模型，對照組常規(guī)飼養(yǎng)，8 周后處死。micro-CT測量大鼠釉牙骨質(zhì)界到牙槽嵴頂距離(CEJ-ABC)，免疫組化染色計算Sema3A/Nrp1陽性染色積分光密度，并進行相關(guān)性分析。門診收集慢性牙周炎樣本及正常樣本各10 例，進行免疫熒光和qRT-PCR檢測。結(jié)果實驗組釉CEJ-ABC明顯高于對照組(Plt;0.05)，Sema3A/Nrp表達強度明顯低于對照組(Plt;0.05)，CEJ-ABC與Sema3A/NrP呈負相關(guān)(Plt;0.05)。人牙周炎樣本Sema3A/Nrp1熒光強度及mRNA相對表達量均低于對照組(Plt;0.05)。結(jié)論Sema3A/Nrp1表達量的減少參與了慢性牙周炎骨破壞進程。

】 慢性牙周炎(CP)； 骨質(zhì)破壞； Sema3A/Nrp1信號軸

慢性牙周炎(chronic periodontitis, CP)是頜骨最常見的炎癥性骨吸收疾病之一，也是造成失牙的主要病因之一。臨床上多采用牙周潔治及刮治去除牙周袋內(nèi)的感染物質(zhì)，以促進牙周組織的恢復(fù),但大量研究表明，經(jīng)過徹底的牙周治療后仍有部分患者的牙槽骨水平難以達到令人滿意的愈合效果，面臨牙拔除的可能。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，軸突導(dǎo)向蛋白3A(semaphorins3A, Sema3A)/受體神經(jīng)纖毛蛋白-1(neuropilin-1, Nrp1)信號軸是一對不僅能抑制破骨細胞分化，而且能促進成骨細胞分化成熟的雙重調(diào)節(jié)因子，有可能成為一種新的治療靶標(biāo)[1]。越來越多的研究結(jié)果表明，Sema3A/Nrp1信號軸在促進骨形成中具有重要作用[2-3]。

然而，Sema3A/Nrp1在炎性骨吸收條件下的表達規(guī)律及作用目前尚未深入探究，因此本研究擬探索Sema3A/Nrp1信號軸在慢性牙周炎發(fā)生發(fā)展中的作用，為防治慢性牙周炎骨吸收提供新的治療靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

從中山大學(xué)(大學(xué)城)實驗動物中心[SCXK(粵)2011-0029]購買7～8 周齡的雄性SD大鼠20 只，并在中山大學(xué)(北校區(qū))實驗動物中心[SYXK(粵)2012-0081]進行實驗。本實驗已獲中山大學(xué)光華口腔醫(yī)學(xué)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 臨床樣本

1.3 主要試劑和儀器

Micro-CT掃描儀(Scanco,瑞士)；兔抗大鼠/人Sema3A多克隆抗體、兔抗大鼠/人Nrp1單克隆抗體(Abcam,英國)；TRAP染色試劑盒(Sigma,美國)；組織mRNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara，日本)；SYBR Green I，全自動反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)儀(Roche,美國)；DAPI(Thermo fisher,美國)；全自動倒置熒光顯微鏡(Zeiss,德國)。

1.4 動物分組及建模

將20 只SD大鼠隨機分為2 組，每組10 只。實驗組大鼠2%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射麻醉后，分別在雙側(cè)上頜第二磨牙齦溝處綁線結(jié)扎(5-0絲線)，并輔以高糖飲食[4]。對照組常規(guī)飼養(yǎng)。8 周后脫頸處死各組大鼠，分離上頜骨組織用于Micro-CT分析及病理學(xué)分析。

1.5 Micro-CT掃描

已分離的大鼠上頜骨樣本立即固定在4%多聚甲醛中，48 h后轉(zhuǎn)移樣本進行Micro-CT掃描。掃描參數(shù)如下：電壓70 kV，電流114 mA，精度20 μm，掃描時間3 000 ms。并進行3D重建，測量上頜第二磨牙頰側(cè)近中、近中、腭側(cè)近中及頰側(cè)遠中、遠中、腭側(cè)遠中6 個位點的釉牙骨質(zhì)界到牙槽嵴頂(cementoenamel junction to alveolar bone crest, CEJ-ABC)的距離，并取均值代表該樣本的骨吸收程度。

1.6 蘇木素-伊紅染色

4)注意作為修正標(biāo)記語的well，如果well處于話輪的中間，則為自己修正標(biāo)記語；而處于話輪開始時，則為他人修正標(biāo)記語。

Micro-CT掃描后，將大鼠上頜骨樣本放置在10% EDTA二鈉溶液中脫鈣至少2 個月。脫鈣結(jié)束后，樣本被制備成8 mm×6 mm×4 mm的方塊進行脫水及包埋。沿磨牙近遠中方向?qū)⑾瀴K切成4 mm厚度的連續(xù)切片并進行HE染色。由2 位獨立的病理醫(yī)師在25 倍及100 倍光鏡下對各組大鼠牙周情況進行評估。

1.7 免疫組化染色

每個樣本選取2 張連續(xù)切片按免疫組化步驟進行染色，其中Sema3A/Nrp1抗體的使用濃度均為1∶500。染色結(jié)束后由2 位獨立的病理醫(yī)師在400 倍光鏡下隨機選取5 個視野，Image Pro Plus軟件評估大鼠牙周區(qū)域Sema3A/Nrp1陽性染色的積分光密度(integrated optical density, IOD)。

1.8 免疫熒光染色

收集到的新鮮組織樣本立即固定在4%多聚甲醛中，48 h后進行脫水及包埋。包埋結(jié)束后將蠟塊切成4 mm厚度的連續(xù)切片，選取其中一張切片進行雙標(biāo)免疫熒光染色，其中Sema3A/Nrp1抗體的使用濃度均為1∶100，紅色熒光標(biāo)記的驢抗兔IgG作為Sema3A第二抗體，綠色熒光標(biāo)記的山羊抗兔IgG作為Nrp1第二抗體，藍色熒光標(biāo)記的DAPI作為染核試劑。染色后由2 位獨立的病理醫(yī)師在400 倍倒置熒光顯微鏡下對各組Sema3A/Nrp1的表達及定位情況進行評估。

1.9 實時熒光定量PCR

收集新鮮組織樣本在液氮中速凍，置于研缽中研磨。提取總RNA，測定RNA純度及濃度。取1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA模板，熒光定量檢測組織中相對mRNA含量。引物序列見表 1。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性10 s，65 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，反應(yīng)循環(huán)40 次，每個樣本設(shè)置3 個復(fù)孔，采用2-△△Ct法計算結(jié)果。

表 1 實時熒光定量PCR引物

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理方法

2 結(jié) 果

2.1 SD大鼠牙周炎模型建立

建模8 周后，實驗組大鼠上頜第二磨牙牙齦明顯紅腫、探診易出血，齦溝加深， 已出現(xiàn)顯著的牙周炎癥狀。實驗組較對照組溝內(nèi)上皮及結(jié)合上皮增生程度增加，膠原纖維破壞，漿細胞浸潤，牙槽骨輕度吸收；對照組臨床及病理檢查牙周組織無明顯異常(圖 1)。Micro-CT三維重建結(jié)果顯示實驗組釉牙骨質(zhì)界到牙槽嵴頂?shù)钠骄嚯x達0.87 mm，對照組為0.61 mm，二者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖 2,表 2)。

圖 1 蘇木素-伊紅染色結(jié)果

圖 2 Micro-CT三維重建顯示釉牙骨質(zhì)界到牙槽嵴頂距離

Fig 2 Micro-CT results showing the CEJ-ABC distance

2.2 Sema3A/Nrp1表達檢測

實驗組及對照組Sema3A/Nrp1陽性染色結(jié)果及IOD值見圖 3。與對照組相比，實驗組Sema3A/Nrp1 IOD值均顯著下降，且兩組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05)，提示在牙周炎發(fā)生發(fā)展過程中Sema3A/Nrp1的表達水平下調(diào)(圖 3)。

2.3 相關(guān)性分析

應(yīng)用統(tǒng)計方法對各組釉牙骨質(zhì)界到牙槽嵴頂距離與Sema3A/Nrp1的IOD值進行相關(guān)性分析，表 2顯示二者呈明顯的負相關(guān)關(guān)系，提示Sema3A/Nrp1信號軸的表達水平與骨吸收密切相關(guān)。同時，Sema3A與其受體Nrp1的表達水平間也具有明顯的正相關(guān)關(guān)系。

表 2 Sema3A/Nrp1染色IOD值與CEJ-ABC的關(guān)系

2.4 臨床樣本Sema3A/Nrp1定性、定位、定量表達情況

實驗組及對照組免疫熒光染色結(jié)果見圖 4。其中藍色熒光代表細胞核的表達情況，紅色熒光代表Sema3A+的表達情況，綠色熒光代表Nrp1+的表達情況。熒光染色合成圖顯示Sema3A蛋白主要在胞質(zhì)及胞膜表達，Nrp1蛋白主要在胞膜表達。與正常對照組相比，實驗組Sema3A/Nrp1信號軸的表達強度及密度顯著降低(Plt;0.05)。與對照組相比，實驗組Sema3A/Nrp1的mRNA相對表達量明顯降低(Plt;0.05)(圖 5)。

圖 3 免疫組化染色結(jié)果(×400)

Fig 3 IHC staining results(×400)

圖 4 免疫熒光染色結(jié)果(×400)

Fig 4 IF staining results(×400)

圖 5 Sema3A/Nrp1 mRNA相對表達量

3 討 論

慢性牙周炎是因牙周組織感染厭氧菌或兼性厭氧菌而導(dǎo)致牙骨質(zhì)、牙周膜、牙槽骨等結(jié)構(gòu)持續(xù)性破壞的一種炎性疾病。由于細菌致病因子的存在及成骨細胞、破骨細胞活性的失衡，單純采取抑制破骨細胞分化或促進成骨細胞分化的方法都難以使牙周骨質(zhì)達到最理想的愈合效果[5-7]。Sema3A/Nrp1作為一對骨雙重調(diào)節(jié)因子，在促進骨形成方面的作用越來越受重視[8]。國內(nèi)外研究結(jié)果表明，Sema3A的表達水平在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中下調(diào)，并與疾病的活躍度及病理表現(xiàn)相關(guān)[9]，同時Sema3A可以減緩實驗性自身免疫性關(guān)節(jié)炎的炎癥進展情況[10]。本研究率先探索了Sema3A/Nrp1信號軸在慢性牙周炎發(fā)生發(fā)展中的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與正常牙周組織相比，炎性牙周組織中Sema3A/Nrp1信號軸的表達顯著下調(diào)，進一步證實了炎癥環(huán)境下Sema3A的表達水平受到了抑制。同時本研究通過對Sema3A/Nrp1信號軸的表達水平與牙周骨質(zhì)破壞程度進行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)二者呈顯著的負相關(guān)關(guān)系。因此我們有理由相信，下調(diào)的Sema3A/Nrp1信號軸其抑制破骨前體細胞遷移、分化以及促進成骨細胞分化的能力也受到抑制，造成了牙槽骨的破壞性吸收。未來如果針對Sema3A/Nrp1信號軸進行靶向干預(yù)，有可能顯著促進牙周骨質(zhì)破壞的恢復(fù)。

本研究通過對Sema3A/Nrp1信號軸在大鼠及人牙周組織樣本中的表達進行檢測，進一步明確了它的時空表達規(guī)律。Sema3A作為Semaphorins家族中的分泌性蛋白，主要在胞質(zhì)及胞膜表達，但其必須與Plexin-A1及Nrp1復(fù)合受體結(jié)合后才能協(xié)同向胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)信號，從而發(fā)揮作用。然而正是由于其受體Plexin-A1及Nrp1既在破骨細胞前體細胞和破骨細胞胞膜表面表達，又在成骨細胞胞膜表面表達，因此決定了Sema3A作為骨雙重調(diào)節(jié)因子的分子基礎(chǔ)[11]。通過對Sema3A及其受體Nrp1表達水平的相關(guān)性分析，我們發(fā)現(xiàn)二者具有明顯的正相關(guān)性(rS-N=0.977，Plt;0.05)，進一步證實了二者作為一對骨調(diào)節(jié)信號軸蛋白的協(xié)同關(guān)系。

慢性牙周炎導(dǎo)致的骨質(zhì)吸收，是由于病原微生物刺激而導(dǎo)致牙周組織抗感染免疫反應(yīng)的結(jié)果。在牙周炎的病理變化過程中，其致病菌牙齦卟啉單胞菌的內(nèi)毒素脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)發(fā)揮了重要的致病作用[12-13]。LPS可以促進炎性因子如TNF-α、IL-1等的表達，從而促進破骨前體細胞的成熟[14-15]。因此我們推測LPS可能是影響Sema3A/Nrp1信號軸表達下調(diào)的重要因素，該部分內(nèi)容還需要進一步深入研究。

總之，通過建立大鼠根尖周炎模型及對人臨床樣本的檢測，證實Sema3A/Nrp1在慢性牙周炎中表達下降，并與牙槽骨的骨質(zhì)缺損密切相關(guān)，為慢性牙周炎等炎癥性骨吸收的病理研究和治療提供新的思路和依據(jù)。

[1] Hayashi M, Nakashima T, Taniguchi M, et al. Osteoprotection by semaphorin 3A[J]. Nature, 2012,485(7396): 69-74.

[2] Shen WW, Chen WG, Liu FZ, et al. Breast cancer cells promote osteoblastic differentiation via Sema 3A signaling pathwayinvitro[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2015, 8(2): 1584-1593.

[3] Li Y, Yang L, He S, et al. The effect of semaphorin 3A on fracture healing in osteoporotic rats[J]. J Orthop Sci, 2015,20(6): 1114-1121.

[4] 王月昊, 王小琴, 苗偉，等. 間歇性低氧對牙周炎大鼠牙周組織中NF-κB、IL-6及PGE2含量的影響[J]. 實用口腔醫(yī)學(xué)雜志,2016,32(1):28-31.

[5] Lewiecki EM. New targets for intervention in the treatment of postmenopausal osteoporosis[J]. Nat Rev Rheumatol, 2011,7(11): 631-638.

[6] Rachner TD, Khosla S, Hofbauer LC. Osteoporosis: now and the future[J]. Lancet, 2011,377(9773): 1276-1287.

[7] Reid IR, Miller PD, Brown JP, et al. Effects of denosumab on bone histomorphometry: The FREEDOM and STAND studies[J]. J Bone Miner Res, 2010,25(10): 2256-2265.

[8] Kang S, Kumanogoh A. Semaphorins in bone development, homeostasis, and disease[J]. Semin Cell Dev Biol, 2013,24(3): 163-171.

[9] Takagawa S, Nakamura F, Kumagai K, et al. Decreased semaphorin3A expression correlates with disease activity and histological features of rheumatoid arthritis[J]. BMC Musculoskelet Disord, 2013,14:40.

[10]Catalano A. The neuroimmune semaphoring-3A reduces inflammation and progression of experimental autoimmune arthritis[J]. J Immunol， 2010, 185(10):6373-6383.

[11]Suzuki K, Kumanogoh A, Kikutani H. Semaphorins and their receptors in immune cell interactions[J]. Nat Immunol, 2008,9(1): 17-23.

[12]Kikuchi T, Matsuguchi T, Tsuboi N， et al. Gene expression of osteoclast differentiation factor is induced by lipopolysaccharide in mouse osteoblasts via Toll-like receptors[J]. J Immunol,2001, 166(5):3574-3579.

[13]Gao Y, Grassi F, Ryan MR， et al. IFN-gamma stimulates osteoclast formation and bone lossinvivovia antigen-driven T cell activation[J]. J Clin Invest,2007, 117(1):122-132.

[14]Xing Q, de Vos P, Faas MM， et al. LPS promotes pre-osteoclast activity by up-regulating CXCR4 via TLR-4[J]. J Dent Res,2011, 90(2): 157-162.

[15]Kikuchi T, Matsuguchi T, Tsuboi N， et al. Gene expression of osteoclast differentiation factor is induced by lipopolysaccharide in mouse osteoblasts via Toll-like receptors[J]. J Immunol,2001, 166(5):3574-3579.

(收稿： 2016-12-27 修回： 2017-02-15)

TheexpressionofSema3a/Nrp1signalaxisintheperiodontaltissuewithchronicperiodontitisandit'sroleinbonedestruction

LINYing,XINGQuan,GAOXianling,XUMeng,LINZhengmei.

510055Guangzhou,GuanghuaSchoolofStomatology,HospitalofStomatology,SunYat-senUniversity,GuangdongProvincialKeyLaboratoryofStomatology,China

Objective: To explore the role of Semaphorins 3A(Sema 3A) and its receptor Neuropilin-1(Nrp1) in the development of chronic periodontitis of rats and clinical samples.Methods20 SD rats were divided into 2 groups. Rats in the experimental group were induced into chronic periodontitis models. Rats in control group were not treated. After 8 weeks, maxilla of all the rats were collected for micro-CT scanning and IHC staining. The distance from cementoenamel junction to alveolar bone crest(CEJ-ABC) and the IOD of Sema3A/Nrp1 positive staining in rats were analyzed. 20 clinical samples of chronic periodontitis(n=10) and normal periodontal tissues(n=10) were collected for immunofluorescence and qRT-PCR analysis.ResultsThe CEJ-ABC distance of chronic periodontitis group was higher than that of the control group(Plt;0.05). The IOD of Sema3A/Nrp1 in experimental group was lower than that of the control group(Plt;0.05) and with a negative correlation with bone loss(Plt;0.05). Immunofluorescence and qRT-PCR analysis showed that the expression level of Sema3a/Nrp1 in clinical samples with chronic periodontitis was also lower than that of the healthy subjects(Plt;0.05).ConclusionThe reduced Sema3A/Nrp1 plays an important role in the development of bone destruction in chronic periodontitis.

Chronicperiodontitis(CP)；Bonedestruction；Sema3a/Nrp1signalaxis

國家自然科學(xué)基金(編號： 81300874)； 廣東省科技計劃項目(編號： 2016B050502008)； 廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究基金(編號： A2016195)

510050 廣州， 中山大學(xué)光華口腔醫(yī)學(xué)院·附屬口腔醫(yī)院，廣東省口腔醫(yī)學(xué)重點實驗室

林正梅 E-mail: linzhm@mail.sysu.edu.cn

R781.4

A

10.3969/j.issn.1001-3733.2017.02.001