王鳳澤 薛洋 溫嬌 周峻 劉源 魏建華

P16蛋白在口咽癌和口腔癌中的表達(dá)及臨床意義

王鳳澤 薛洋 溫嬌 周峻 劉源 魏建華

目的分析口咽癌和口腔癌中P16蛋白表達(dá)情況及臨床意義。方法采用免疫組織化學(xué)染色法檢測70 例口咽癌和60 例口腔癌中P16蛋白的表達(dá)情況，分析其與患者臨床病理學(xué)指標(biāo)的相關(guān)性及臨床意義。結(jié)果口咽癌中P16蛋白的陽性率為22.9%(16/70)，與P16陰性組相比，患者的年齡、吸煙、病理分化、N分期和TNM臨床分期具有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05)；口腔癌中P16蛋白的陽性率為8.3%(5/60)，與P16陰性組相比，病理分化和TNM臨床分期有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05)。結(jié)論口咽癌中P16蛋白陽性率明顯高于口腔癌,HPV感染是口咽癌和口腔癌不可忽視的誘發(fā)因素。

口咽鱗癌(OPSCC)； 口腔鱗癌(OSCC)； HPV； P16

口咽癌是一類主要發(fā)生在舌根、咽側(cè)壁、軟腭、扁桃體等部位的鱗狀細(xì)胞癌。口腔癌主要發(fā)生在口腔黏膜如舌、頰粘膜、硬腭和牙齦等的鱗癌。其中口腔癌在口腔惡性腫瘤中最常見，嚴(yán)重影響患者的生命質(zhì)量[1]?？谘拾┖涂谇话┑陌l(fā)病是由多因素導(dǎo)致的，普遍認(rèn)為，吸煙和飲酒是其中的重要原因[2]。然而隨著患者吸煙量和飲酒量的減少，并沒有發(fā)現(xiàn)生存率有明顯的提高，有報道顯示15%～20%的口咽癌和口腔癌患者不吸煙不飲酒，表明存在影響腫瘤發(fā)病的其他致病危險因素[3]。近年來，越來越多的研究表明人類乳頭瘤病毒(human papillomavirus, HPV)在宮頸癌的致病中起到重要作用，超過90%的宮頸癌與HPV感染有關(guān)[4]。同樣，早在1983 年Syrjanen就指出HPV感染與頭頸部鱗癌相關(guān)，隨后的研究在口咽、下咽等部位的鱗癌中都發(fā)現(xiàn)了HPV感染,因此HPV的作用愈來愈受重視[5]。本研究通過對口腔癌和口咽癌患者標(biāo)本中HPV感染的標(biāo)志物P16蛋白進行檢測，與患者臨床病理學(xué)指標(biāo)進行統(tǒng)計學(xué)分析，探討其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 基本資料

70 例口咽癌標(biāo)本和60 例口腔癌標(biāo)本來自第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院。入組標(biāo)準(zhǔn)：①所有病理標(biāo)本均通過HE染色確診為鱗狀細(xì)胞癌；②詳細(xì)病案記錄分析的指標(biāo)完整；③具有完整的蠟塊進行切片檢測。

1.2 實驗試劑

I抗：鼠抗人P16單克隆抗體(產(chǎn)品編號：ab117443，Abcam，美國)，II抗：生物素-鏈霉卵白素免疫組化檢測試劑盒(產(chǎn)品編號：SP9002，北京中杉金橋生物技術(shù)公司)，DAB顯色試劑盒(產(chǎn)品編號：ZLI-9108，北京中杉金橋生物技術(shù)公司)。

1.3 免疫組化

所有鱗癌組織均通過4%甲醛液固定并進行石蠟包埋，每個標(biāo)本取4 μm厚連續(xù)切片5 張。所有石蠟切片常規(guī)免疫組織化學(xué)染色檢測P16蛋白表達(dá)，采用0.01 mol/L檸檬酸鈉緩沖液高壓鍋抗原修復(fù)，PBS代替I抗進行空白對照。

1.4 結(jié)果判斷

所有結(jié)果由2 名有經(jīng)驗的病理科醫(yī)師進行雙盲判斷。免疫組化陽性結(jié)果解讀：細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)紅棕或棕褐染色為陽性表達(dá)，按參考文獻(xiàn)[6]的標(biāo)準(zhǔn)評分。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料用χ2檢驗和Fisher確切概率法，Plt;0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 口咽癌中P16表達(dá)情況分析

70 例口咽癌中P16蛋白陽性16 例，陰性54 例，陽性率為22.9%(16/70)，P16陽性表達(dá)(圖 1)。

P16蛋白表達(dá)陽性和陰性口咽癌患者臨床參數(shù)比較：P16陽性組與陰性組相比，年齡、吸煙、病理分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM臨床分期有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05，表 1)，但P16陽性組中女性和T1+T2者的比例高，沒有統(tǒng)計學(xué)意義(Pgt;0.05，表 1)。

2.2 口腔癌中P16表達(dá)情況分析

60 例口腔癌中P16陽性者5 例，陰性55 例，陽性率為8.3%(5/60)。P16陽性表達(dá)(圖 1)。

P16陽性組與陰性組相比，病理學(xué)分化，TNM臨床分期有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05，表 1)；但P16陽性組中女性、年齡小于60 歲、吸煙指數(shù)小于20、T1+T2和N0者的比例相對較高，無統(tǒng)計學(xué)意義(Pgt;0.05，表 1)。

表 1 口咽癌和口腔癌中P16與臨床病理學(xué)指標(biāo)之間的關(guān)系[n(%)]

Tab 1 Relationship between clinicopathological parameters and P16 status for OPSCC and OSCC [n(%)]

注： ①：Plt;0.05

A： 陰性對照； B： 口咽癌組織中P16表達(dá)； C： 口腔癌中P16表達(dá)

圖 1 P16在口咽癌和口腔癌中的表達(dá)(IHC, ×200)

A： Control; B： P16 expression in OPSCC sample; C： P16 expression in OSCC sample

Fig 1 Expression of P16 in OPSCC and OSCC(IHC, ×200)

3 討 論

HPV是小型環(huán)狀雙鏈DNA病毒屬，分為高危型和低危型。高危型主要與頭頸部鱗癌、食管癌、宮頸癌及外陰癌相關(guān)，主要分型為HPV16、18、33；低危型主要與眼、呼吸道、生殖道乳頭狀瘤相關(guān)，主要分型為HPV6、11[7]。HPV具有嗜組織性，無法編碼DNA 聚合酶。主要借助宿主細(xì)胞周期蛋白增殖，其基因組以游離態(tài)為主，可以整合到人類基因組中，在整合的過程中，E6、E7 基因被整合到宿主DNA中[8]。HPV E6 蛋白可以與P53結(jié)合并使其降解，失去對細(xì)胞周期的正常調(diào)控導(dǎo)致細(xì)胞惡性增殖。HPV E7 蛋白結(jié)合Rb，引起E2F 的釋放和P16蛋白的過表達(dá)，致使細(xì)胞周期失控[9]。在HPV 感染的基礎(chǔ)上，經(jīng)過長期基因損傷的積累，會使正常細(xì)胞癌變，最終發(fā)展成為惡性腫瘤。

目前頭頸部腫瘤常分為HPV陽性和HPV陰性2 種類型，在致病原因、病理學(xué)特征等多方面有很大區(qū)別。HPV陽性的頭頸部腫瘤多與性伙伴多和口交等有關(guān)；HPV陰性的與吸煙和飲酒關(guān)系較大[10]。其中，在頭頸部腫瘤中，口咽癌HPV 感染率最高且呈現(xiàn)上升趨勢。

目前HPV檢測的方法包括核酸原位雜交法、基因芯片和P16免疫組化等，檢測陽性率有差別。其中，在宮頸癌中第一次應(yīng)用P16免疫組化來檢測HPV感染[11]，同樣已經(jīng)有研究用P16免疫組化來檢測頭頸部腫瘤中HPV感染[12]。本實驗P16免疫組化結(jié)果顯示口咽癌中陽性率遠(yuǎn)高于口腔癌(22.9%vs8.3%)，表明口咽癌與HPV更加密切，與現(xiàn)有研究結(jié)果一致[7]。

對口咽癌患者的基本信息(表 1)進行統(tǒng)計后發(fā)現(xiàn)：P16陽性組中吸煙指數(shù)小于20和小于60歲者多，具有統(tǒng)計學(xué)意義；女性患者多(18.8%vs14.8%)，但無統(tǒng)計學(xué)意義(Pgt;0.05)。上述結(jié)果與現(xiàn)有報道相一致[13]。

在發(fā)病部位上，陽性組與P16陰性組相比，沒有統(tǒng)計學(xué)意義(Pgt;0.05)，其中舌根部位最多，可能因為入選樣本量不夠和入選病例中舌根癌比例相對較高(52.9%)，高于現(xiàn)有報道[14-15]，存在入組偏倚。在T分期、N分期和TNM臨床分期方面，現(xiàn)有研究[14,16]表明P16陽性組T分期明顯早于陰性組，且多為低分化，容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，多為III～I(xiàn)V期患者。本研究顯示(表 1)：P16陽性組多為低中分化，N+和III-IV期，均具有統(tǒng)計學(xué)意義，與上述研究相符；在T分期上，P16陽性組與陰性組相比沒有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.527，Pgt;0.05)，但是具有以下趨勢：T1+T2患者比例要高于T3+T4期(81.3%vs72.2%)。

在宮頸癌和口咽癌中HPV感染的致病機制已經(jīng)基本明了，但是在口腔癌中的致病機制尚不明了[17]。本研究中口腔癌共60 例，其中硬腭癌12 例，頰癌15 例，舌癌18 例和口底癌15 例。在口腔癌臨床指標(biāo)與P16表達(dá)的研究中：女性患者的比例高，與研究[7]相符。在年齡上，P16陽性組與陰性組相比， 小于60 歲人群居多(80%vs57.1%)，與研究[18]一致。P16陽性組吸煙少者比例高(60%vs36.4%)，符合研究[3,19]，但與研究[20]不符，考慮可能是因為組內(nèi)分層的標(biāo)準(zhǔn)不一樣，存在入組偏倚。P16陽性組多為低中分化，具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=7.375，Plt;0.05)，符合現(xiàn)有研究[17]。然而，另有研究[19,21]發(fā)現(xiàn)HPV陽性口腔癌以高分化為主，與本研究不相符，考慮可能是因為樣本量小和上述研究中入選的高分化病例占比高達(dá)88.5%，存在選擇偏倚。

除上述因素，P16陽性組與陰性組相比，T1+T2者比例高，與研究[17,20]相符，無統(tǒng)計學(xué)意義。P16陽性組多為N0，不易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，與研究[17]相符。I～I(xiàn)I期患者多，與研究[19,21]相符，具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=6.325，Plt;0.05)，表明P16蛋白在口腔癌的癌變、轉(zhuǎn)移與發(fā)展中起到重要的作用，可以作為口腔癌早期診斷和預(yù)后評估的重要標(biāo)志物。

綜上所述，HPV感染對口咽癌和口腔癌的致病機制是全世界研究的熱點，相比口腔癌，目前對口咽癌的研究更深入。本實驗中口咽癌P16表達(dá)與臨床指標(biāo)的關(guān)系與現(xiàn)有研究基本一致，但是口腔癌與現(xiàn)有研究少有出入，將來通過加大樣本量和多中心協(xié)作，相信會對HPV相關(guān)口腔癌的研究提供更多的數(shù)據(jù)支持。

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(收稿： 2016-11-03 修回： 2017-01-10)

TheclinicalsignificanceofP16expressioninoralandoropharyngealsquamouscellcarcinoma

WANGFengze1,XUEYang2,WENJiao3,ZHOUJun4,LIUYuan4,WEIJianhua1.

1. 710032Xi'an,DepartmentofProsthodontics, 2.DepartmentofOralBiology, 3.DepartmentofAnesthesiology, 4.StateKeyLaboratoryofMilitaryStomatologyamp;NationalClinicalResearchCenterforOralDiseasesamp;ShaanxiClinicalResearchCenterforOralDiseases,DepartmentofOralHistologyandPathology，SchoolofStomatology,TheFourthMilitaryMedicalUniversity,China

Objective: To analyze the expression and clinical significance of P16 in oral and oropharyngeal squamous cell carcinoma(OSCC and OPSCC).MethodsSpecimens from 70 patients with OPSCC and 60 with OSCC were immunostained by mouse anti-human P16 monoclonal antibody. The relationship between P16 status and clinicopathological parameters were investigated.ResultsThe positive rate of P16 staining in OPSCC was 22.9%(16/70). The expression of P16 was closely associated with age, smoking index, histotype, N stage and TNM clinical stage of OPSCC(Plt;0.05). The positive rate of P16 protein was 8.3%(5/60) in OSCC. The expression of P16 protein was associated with histotype and TNM clinical stage of OSCC(Plt;0.05).ConclusionThe positive propotion of P16 expression was higher in OPSCC than that in OSCC. HPV infection is a precipitating factor for OPSCC and OSCC.

Oropharyngealsquamouscellcarcinoma(OPSCC);Oralsquamouscellcarcinoma(OSCC);HPV;P16

710032 西安，軍事口腔醫(yī)學(xué)國家重點實驗室，口腔疾病國家臨床醫(yī)學(xué)研究中心，陜西省口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院頜面外科( 王鳳澤魏建華) ，口腔生物學(xué)教研室( 薛洋) ，麻醉科( 溫嬌) ，組織病理學(xué)教研室( 周峻劉源)

魏建華E-mail: weiyoyo@ fmmu． edu． cn

R739.8

A

10.3969/j.issn.1001-3733.2017.02.010