汪璐璐 袁帥 杜樣 周志斐 鄔禮政 王小競

生理性根吸收過程中乳牙牙髓干細胞通過α7 nAChR調(diào)節(jié)破骨細胞分化能力的研究

汪璐璐 袁帥 杜樣 周志斐 鄔禮政 王小競

目的探討生理性根吸收過程中乳牙牙髓干細胞(DDPSCs)通過 α7 亞型煙堿型乙酰膽堿受體(α7 nAChR)對破骨分化能力的調(diào)節(jié)作用。方法酶消化法和有限稀釋法分離培養(yǎng)根吸收不同時期DDPSCs和恒牙牙髓干細胞(DPSCs)。采用實時定量PCR和Western blot，檢測各組細胞α7 nAChR、RANKL、OPG的表達及其比值差異，以及阻斷α7 nAChR后RANKL、OPG的表達及其比值變化。結(jié)果α7 nAChR表達及RANKL/OPG比值在根吸收中期DDPSCs中明顯升高(Plt;0.05)。 阻斷α7 nAChR后，RANKL/OPG明顯下降(Plt;0.05)。結(jié)論在乳牙生理性根吸收過程中，α7 nAChR通過上調(diào)自身表達，參與對RANKL/OPG的調(diào)節(jié)，影響DDPSCs的破骨分化能力。

生理性根吸收； 乳牙牙髓干細胞； 煙堿型乙酰膽堿受體α7亞型

乳牙生理性根吸收是乳恒牙替換及恒牙咬合順利建立的前提條件[1]。目前對于牙根吸收的認識主要集中于成骨細胞與破骨細胞所主導(dǎo)的骨吸收過程[2]。其中，RANKL和OPG在破骨細胞的分化成熟中發(fā)揮著重要作用[3-4]。乳牙牙髓干細胞(deciduous dental stem cells, DDPSCs)能夠調(diào)控自身RANKL/OPG的表達[5]，在乳牙生理性根吸收中發(fā)揮作用，但具體調(diào)控機制尚不清楚。α7亞型煙堿型乙酰膽堿受體(alpha 7 nicotinic acetylcholine receptors，α7 nAChR)被證實可介導(dǎo)骨吸收以及調(diào)控破骨細胞生成[6-7]。

本實驗檢測了α7 nAChR在不同根吸收時期DDPSCs中的表達及其對RANKL/OPG比值的影響，旨在探討生理性根吸收過程中DDPSCs通過α7 nAChR對破骨分化能力的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑

12 顆6～7 歲兒童因乳牙滯留拔除的健康乳切牙和4 顆14 歲患者因正畸需要拔除的健康第一前磨牙(第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院兒童口腔科、頜面外科)；α-MEM培養(yǎng)液，鏈霉素，青霉素鈉，胎牛血清(Gibco,美國);Trizol Reagent(Invitrogen,美國);反轉(zhuǎn)錄試劑盒，Syber Green熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa,日本)；兔抗人β-actin抗體，兔抗人α7nAChR抗體，兔抗人RANKL抗體，兔抗人OPG抗體，山羊抗兔IgM二抗(Abcam,美國)；PVDF膜(DUPONT,美國)；甘氨酸，丙烯酰胺，過硫酸氨(AP)，TEMED，Tris(上海生物工程公司)；PCR儀，蛋白電泳儀，半干電轉(zhuǎn)膜儀(BIO-RAD,美國)；實時定量PCR系統(tǒng)(ABS7500,美國)；培清掃描分析系統(tǒng)(上海培清)。

1.2 DDPSCs和恒牙牙髓干細胞的分離、培養(yǎng)

臨床檢查乳牙松動度,排除藥物過敏史、全身疾病史以及家族遺傳病史。將乳牙分為3 個時期:穩(wěn)定期乳牙,乳牙根基本完整尚未吸收;吸收中期乳牙,乳牙根縱向吸收面處于牙根長度1/3～2/3;吸收晚期乳牙，吸收超過根長度2/3。

消毒后劈開牙齒取出牙髓。采用酶消化法(膠原酶消化60 min后組織塊接種至6孔板)獲取原代DDPSCs和恒牙牙髓干細胞(dental pulp stem cells, DPSCs)。采用有限稀釋法克隆純化。各組細胞分別標(biāo)記為:穩(wěn)定期(S),吸收中期(M),吸收晚期(F),恒牙組(P)。

1.3 α-BTX處理M組DDPSCs

取第4代M組DDPSCs,以 1×105個/ml接種于6孔板中。待其密度達到80%時向培養(yǎng)液中加入α-BTX(10-8mol/L),培養(yǎng)24 h。

1.4 實時定量PCR 檢測

Trizol法提取第4代各期DDPSCs和DPSCs總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板,以β-actin為內(nèi)參,采用ABI7500熒光實時定量PCR系統(tǒng)檢測α7 nAChR、RANKL、OPG表達情況，實驗重復(fù)3 次。各引物序列見表 1。

1.5 Western blot 檢測

提取第4代各期DDPSCs和DPSCs總蛋白。根據(jù)測定的蛋白樣品濃度確定上樣量,保證每孔蛋白量一致，用10%SDS-PAGE膠進行電泳。電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，加入1∶1 000稀釋的一抗4 ℃孵育過夜；TBST洗膜,二抗37 ℃孵育1 h;免疫反應(yīng)條帶用ECL增強化學(xué)發(fā)光(參照說明書)。對掃描條帶用image-J進行平均灰度值測定,實驗重復(fù)3 次。

表 1 各分子基因擴增引物序列

1.6 統(tǒng)計方法

采用SPSS 16.0計算機統(tǒng)計分析軟件對所得數(shù)據(jù)進行分析。數(shù)據(jù)組間差異采用單因素方差分析方法(one-way ANOVA)進行統(tǒng)計,各組間兩兩比較采用t檢驗。Plt;0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各期 DDPSCs 和 DDPSCs 形態(tài)

原代培養(yǎng)2 d后組織塊呈顆粒狀松解散開,5～7 d后組織塊周圍有牙髓細胞爬出,呈長梭形,胞核圓且占據(jù)胞體大部,兩側(cè)細胞突纖細較長(圖 1A)。20 d左右細胞已長至6孔板底面積約3/4，細胞均呈放射或漩渦狀分布排列(圖 1B)。DPSCs與根吸收各期DDPSCs相比，爬出時間相對較晚，為7～10 d左右，胞體相對較大，但形態(tài)基本相似(圖 2)。

2.2 不同根吸收期DDPSCs和DPSCs中α7 nAChR、RANKL和OPG的表達

實時定量PCR結(jié)果顯示，α7 nAChR在M組DDPSCs中表達明顯升高(Plt;0.05)，RANKL/OPG基因表達比值也在M組顯著升高(圖 3A)(Plt;0.05)。

Western blot結(jié)果提示，M組DDPSCs中α7 nAChR和RANKL的表達顯著高于其他各組(Plt;0.05)，而OPG的表達在M組顯著下調(diào)，RANKL/OPG蛋白表達比值在M組顯著升高(圖 3B，Plt;0.05)。與實時定量PCR結(jié)果一致。

A： 5～7 d后細胞爬出； B： 20 d左右細胞形態(tài)

圖 1 DDPSCs和DPSCs原代培養(yǎng)(×40)

A： Cells around tissue block after 5-7 day culture; B: Cells after 20 day culture

Fig 1 The primary culture of DDPSCs and DPSCs(×40)

A： S組DDPSCs； B： M組DDPSCs； C： F組DDPSCs； D：DPSCs

圖 2 各組DDPSCs和DPSCs形態(tài)(×40)

A： DDPSCs of S group; B: DDPSCs of M group; C: DDPSCs of F group; D: DPSCs

Fig 2 Morphology of DDPSCs and DPSCs(×40)

A： α7 nAChR、RANKL/OPG的基因表達； B： α7 nAChR、RANKL/OPG蛋白表達

2.3 阻斷DDPSCs α7 nAChR后RANKL/OPG比值的變化

實時定量PCR結(jié)果顯示，α7 nAChR拮抗劑α-BTX作用24 h后,M組DDPSCs中RANKL/OPG比值顯著下降(圖 4A)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05)。Western blot結(jié)果顯示：α-BTX作用24 h后,M組DDPSCs中RANKL蛋白表達明顯下降，而OPG表達則顯著上升，其比值隨之下降(圖 4B，Plt;0.05)，蛋白結(jié)果與實時定量PCR結(jié)果一致。

A： RANKL/OPG基因表達比值； B： RANKL和OPG蛋白表達

3 討 論

生理性根吸收常起始于牙根外側(cè)且靠近繼承恒牙胚[8]。在繼承恒牙胚先天缺失的情況下,牙根同樣能緩慢吸收, 且吸收多起始于牙根髓腔一側(cè)[9]。已有研究證實,在根吸收期的乳牙牙髓中，RANKL表達明顯高于恒牙牙髓,提示牙髓可能參與調(diào)節(jié)牙根吸收[5]。恒牙和乳牙牙髓中均存在干細胞龕,可在外界刺激下快速增殖分化并參與組織修復(fù)[4,10-11]。

前期實驗證實，尼古丁可通過與牙周膜細胞表達的α7 nAChR上調(diào)NF-κB、IL-1、IL-6、TNF-α等炎性因子的表達，還能通過CD4+T細胞，調(diào)控RANKL/OPG的比值，加重牙周組織炎性反應(yīng)和支持骨組織的喪失[12-13]。同時還證實α7 nAChR可通過激活Wnt信號通路，調(diào)控成骨/破骨過程[14]。

目前已經(jīng)證實,乳牙根吸收的過程存在吸收活躍期與靜止期的交替[15]。因此，本實驗將乳牙分為穩(wěn)定期(S),吸收中期(M)和吸收晚期(F)3 組, 并加入恒牙組(P)作對照,分別進行DDPSCs和DPSCs的分離、培養(yǎng)。

本實驗對各期DDPSCs和DPSCs中α7 nAChR的表達進行了檢測，結(jié)果提示其基因和蛋白表達在M組DDPSCs中表達明顯高于其他各組。結(jié)合根吸收進程的各期特點和前期研究所揭示的α7 nAChR在骨質(zhì)吸收中的調(diào)節(jié)作用，作者認為，在乳牙生理性根吸收過程中，α7 nAChR同樣可能參與了對DDPSCs的調(diào)控。

本實驗在基因和蛋白水平檢測了各組DDPSCs和DPSCs中RANKL和OPG的表達水平。目前較常采用計算RANKL/OPG比值的方法來具體呈現(xiàn)細胞破骨能力的高低[16]。本實驗發(fā)現(xiàn)在破牙吸收較活躍的吸收中期,即M組DDPSCs中RANKL/OPG比值最高,說明DDPSCs可以促進這一時期破骨細胞的分化。在吸收晚期,RANKL/OPG比值明顯下降,表示其調(diào)節(jié)破骨分化能力也隨之下降。這一趨勢也與α7 nAChR表達水平變化一致。

本實驗對α7 nAChR高表達的M期DDPSCs進行干預(yù)，使用α-BTX阻斷該受體后檢測RANKL和OPG的基因/蛋白表達。結(jié)果顯示，α7 nAChR被阻斷后，DDPSCs中RANKL表達明顯下降，而OPG表達上升，RANKL/OPG比值顯著下降。進一步提示在乳牙生理性根吸收過程中，DDPSCs可能通過高于非吸收期的表達α7 nAChR參與對下游RANKL/OPG的調(diào)節(jié)，進而影響破骨調(diào)節(jié)能力的發(fā)揮。綜上所述，本實驗創(chuàng)新性的探究了α7 nAChR與乳牙生理性根吸收的關(guān)聯(lián)，證實了DDPSCs中的特異性變構(gòu)受體α7 nAChR可通過一定的細胞內(nèi)分子途徑調(diào)節(jié)RANKL/OPG比值，進而影響DDPSCs對破骨分化的調(diào)控能力。為乳牙生理性根吸收過程和乳恒牙替換機制的研究提供理論依據(jù)，也為臨床上預(yù)防、治療乳牙滯留以及保留繼承恒牙胚缺失的乳牙提供新的思路。

[1] Sahara N. Cellular events at the onset of physiological root resorption in rabbit deciduous teeth[J]. Anat Rec, 2001, 264(4):387-396.

[2] Obersztyn A. Experimental investigation of factors causing resorption of deciduoud teeth[J]. J Dent Res, 1963, 42: 660-674.

[3] Ten Cate AR. Oral histology: Development, structure, and function[J]. Elsevier SP, 1990, 48(1):98-99 .

[4] Miura M, Gronthos S, Zhao M, et al. SHED: Stem cells from human exfoliated deciduous teeth[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2003, 100(10): 5807-5812.

[5] Zhu Y, Shang L, Chen X, et al. Deciduous dental pulp stem cells are involved in osteoclastogenesis during physiologic root resorption[J]. J Cell Physiol, 2013, 228(1):207-215.

[6] Grando SA, Kawashima K, Wessler I. Introduction: The non-neuronal cholinergic system in humans[J]. Life Sci, 2003, 72(18-19): 2009-2012.

[7] Mandl P, Hayer S, Karonitsch T, et al. Nicotinic acetylcholine receptors modulate osteoclastogenesis[J]. Art Res Ther, 2016, 18: 63.

[8] Harokopakis-Hajishengallis E. Physiologic root resorption in primary teeth: Molecular and histological events[J]. J Oral Sci, 2007, 49(1): 1-12.

[9] 楊杰, 趙玉鳴, 葛立宏. 恒牙胚缺失動物模型的建立及相應(yīng)乳牙牙根的吸收[J]. 北京大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版), 2008, 40(1): 60-63.

[10]路博聞，劉娜，徐璐璐, 等. 人脫落乳牙牙髓干細胞與人恒牙牙髓干細胞成骨分化及破骨能力的差異[J]. 南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報, 2016, 36(2)：180-185.

[11]孫艷艷，袁夢桐，胡偉平. 牙髓干細胞的研究與應(yīng)用[J]. 實用口腔醫(yī)學(xué)雜志, 2016，32(3):426-429.

[12]Wu Z, Zhou Y, Zhou Z, et al. Nicotine induces the production of IL-1β and IL-8 via the α7 nAChR/NF-κB pathway in human periodontal ligament cells: Aninvitrostudy[J]. Cell Physiol Biochem, 2014, 34(2): 423-431.

[13]Wu LZ, Duan DM, Liu YF, et al. Nicotine favors osteoclastogenesis in human PDL cells co-cultured with CD4+T cells by up-regulating IL-1β [J]. Int J Mol Med, 2013, 31(4): 938-942.

[14]Zhou ZF, Li B, Liu F, et al. Nicotine deteriorates the osteogenic differentiation of periodontal ligament stem cells through α7 nicotinic acetylcholine receptor regulating Wnt pathway[J]. PLoS One, 2013, 8(12): e83102.

[15]Li B, Zhang Y, Wang Q, et al. Periodontal Ligament Stem Cells Modulate Root Resorption of Human Primary Teeth via Runx2 Regulating RANKL/OPG System[J]. Stem Cells Dev, 2014, 23(20): 2524-2534.

[16]Silva I, Branco JC. Rank/Rankl/opg: Literature review[J]. Acta Reumatol Port, 2011, 36: 209-218.

(收稿： 2016-09-18 修回： 2016-10-17)

Decidiuousdentalpulpstemcellsregulatetheosteoclastdifferentiationviaα7nAChRduringphysiologicalrootresorption

WANGLulu1,YUANShuai1,DUYang1,ZHOUZhifei1,WULizheng2,WANGXiaojing1.

1. 710032Xi'an,StateKeyLaboratoryofMilitaryStomatologyamp;NationalClinicalResearchCenterforOralDiseasesamp;ShaanxiClinicalResearchCenterforOralDiseases,DepartmentofPediatricDentistry，SchoolofStomatology,TheFourthMilitaryMedicalUniversity,China; 2.DepartmentofStomatology，AffiliatedHospitalofLogisticUniversityofChinesePeople'sArmedPoliceForces,Tianjin

Objective: To explore the ability of decidiuous dental pulp stem cells(DDPSCs) in the regulation of osteoclast differentiation via α7 nAChR during physiological root resorption.MethodsDDPSCs from deciduous teeth in different stages of physiological root resorption and from permanent teeth were respectively culturedinvitro. Expression of α7 nAChR, RANKL and OPG were detected by quantitative real-time PCR and western blot analysis respectively. After α7 nAChR were blocked, expression difference of RANKL/OPG were detected again.ResultsThe expression of α7 nAChR and RANKL/OPG was upregulated in the middle stage of root resorption(Plt;0.05). When α7 nAChR were blocked, the expression ratio of RANKL/OPG was decreased significantly both in gene and protein levels(Plt;0.05).ConclusionDuring the procedure of physiological root resorption of deciduous teeth, the expression of α7 nAChR is up regulated and the osteoclast differentiation of DDPSCs is affected by the RANKL/OPG expression change.

Physiologicalrootresorption;Deciduousdentalpulpstemcells;Alpha7nicotinicacetylcholinereceptors

國家自然科學(xué)基金(編號： 81470743, 81500805)

710032 西安， 軍事口腔醫(yī)學(xué)國家重點實驗室， 國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心, 陜西省口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院兒童口腔科(汪璐璐 袁帥 杜樣 周志斐 王小競)； 中國人民武裝警察部隊后勤學(xué)院附屬醫(yī)院口腔科(鄔禮政)

王小競 E-mail： wxjing@fmmu.edu.cn

R780.2

A

10.3969/j.issn.1001-3733.2017.02.012