分子遺傳改良技術在楊樹上的研究與應用進展

王沛雅+楊暉+郭琪+杜維波+張軍+楊濤

摘要：楊樹作為全球使用最為廣泛的生態(tài)、能源、分子遺傳木本模式植物之一，其種質資源研究改良對我國生態(tài)環(huán)境建設意義重大。綜述不同目的基因（抗蟲、抗病、抗除草劑、抗逆境、降低木質素、促生長等）轉化楊屬植物的研究與應用，分析目前為止楊樹分子改良研究應用發(fā)展現(xiàn)狀、存在問題及解決途徑，為楊樹遺傳改良的進一步發(fā)展提供參考。

關鍵詞：楊樹；遺傳；種質資源；基因工程；生態(tài)環(huán)境建設；目的基因；分子改良；研究進展；存在問題；解決途徑

中圖分類號： S792.110.4 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）20-0017-07

楊樹是楊柳科（Salicaceae）楊屬（Populus）物種的統(tǒng)稱，全球約有100多種，一般在北緯30°～72°范圍，垂直分布多在海拔3 km以下[1]。楊樹是優(yōu)良的造林綠化樹種、建筑用材和造紙原料，此外，楊樹擁有很高的生物質產量，是重要的可再生生物質能源植物。楊屬植物單倍體基因組含有19條染色體，DNA含量為1.2 pg，總遺傳圖距約為2 500 cM [2-3]。楊屬植物因其基因組具有構成精簡、物種豐富、分布廣泛、童期短、生長快、遺傳轉化容易、再生能力強、嚴格的異交樹種、位點組成高度雜合，已構建成較飽和的各種連鎖圖等這些特點，使其成為林木基因工程模式物種[4-6]。2011年7月北京林業(yè)大學的科學家以百年古樹——白楊組毛白楊（Populus tomentosa）為樣本，繪制完成了毛白楊的基因組序列圖譜，這標志著楊樹分子育種正式進入基因組時代，推動了楊樹育種技術的全面進步。

楊樹作為保護脆弱生境環(huán)境的生態(tài)樹種，須要耐受惡劣的自然環(huán)境（如干旱、低溫、鹽堿、病蟲害等），因此培育生長迅速、抗逆性強的楊樹品種一直是全球相關科學家努力的方向之一。相對于常規(guī)育種方法費時長、效率低的缺陷，現(xiàn)代分子育種方法高效、靶向的優(yōu)點為楊樹改良品種開辟了新的途徑。Fillatti等將從沙門氏菌中分離出來的AroA基因導入楊樹NC-5339無性系并獲得了一批抗草甘膦植株[7]，使人們對樹木育種研究的認識有了重大的改變，基因工程逐漸成為樹木育種研究的焦點。1991年我國首次利用抗蟲基因成功轉化了歐洲黑楊[8]。到目前為止，進行的轉基因樹木有30多個屬，而研究最多、應用最廣泛的為楊屬，約占50%[9]。眾多科學家通過分子遺傳轉化的方法對楊樹現(xiàn)有品種進行了優(yōu)化改良，尤其是在抗性育種（包括抗蟲、抗病、抗旱、耐鹽堿等）方面。對近年來楊樹轉基因的研究應用現(xiàn)狀進行總結分析，以期為楊樹的分子育種研究及其應用的進一步發(fā)展提供參考。

1 不同目的基因的楊樹轉化

1.1 抗蟲基因轉化

楊樹的蟲害十分普遍，主要類型有蛀干害蟲，如光肩星天牛、桑天牛、云斑天牛等； 食葉害蟲，如楊尺蠖、分月扇舟蛾、楊梢葉甲等；枝梢害蟲和吸汁害蟲，如楊黃卷葉螟、草履蚧等，每年給楊樹的生長和生產造成巨大的損失?？瓜x基因工程為解決這一問題提供了非常有效的方法，我國對抗蟲轉基因楊樹研發(fā)處于國際前列，利用轉基因技術已獲得多種轉基因抗蟲楊樹，有效降低了林木蟲害的危害。

1.1.1 轉單個抗蟲基因 1993年田穎川等用帶有35S-Ω-Bt-Nos嵌合基因的雙元載體農桿菌轉化歐洲黑楊的葉片外植體，獲得再生植株，對楊尺蠖的毒理試驗表明，5～9 d內死亡率達80%～96%，存活昆蟲的生長和發(fā)育受到明顯抑制[10]。大田試驗結果表明，轉基因歐洲黑楊田間抗蟲效果明顯，轉基因試驗林葉片損失率不超過20%，健楊林帶和歐洲黑楊林帶土壤中的蟲蛹數(shù)分別為轉基因試驗林土壤中蟲蛹數(shù)的4.9、4.1倍[11]。2002年轉抗蟲基因歐洲黑楊獲得了商品化許可，2003年通過良種審定，我國成為世界上第1個商業(yè)化栽培轉基因林木的國家[12]。還有其他殺蟲基因也被導入楊樹中，郝貴霞等將廣譜抗蟲基因豇豆蛋白酶抑制劑基因（cowpea trypsin inhibitor，簡稱CpTI）導入毛白楊雌株和毛新楊×毛白楊回交雜種，獲得轉基因植株，現(xiàn)已進入大田檢測階段[13]。伍寧豐等將昆蟲特異性神經蝎毒素基因（AaIT）導入楊樹雜種N-106，獲得的轉基因植株A5對1齡舞毒蛾幼蟲的蟲試7 d的死亡率達80%[14]。

1.1.2 轉雙抗蟲基因 研究表明，昆蟲易對單個基因產生耐受性，將多個不同類型的抗蟲基因導入植物，轉基因植株的殺蟲活力增強。2000年，李明亮等用農桿菌介導2次轉化的方法，將蛋白酶抑制劑基因（proteinase inhibitor，簡稱PI）導入含Bt基因的歐洲黑楊，含有雙抗基因楊樹的抗蟲能力明顯高于含單一Bt毒蛋白基因或單一PI基因的植株[15]。饒紅宇等采用雙基因共轉法將經改造的Bt-Cry1Aa基因和CpTI基因轉入楊樹NL-80106，獲得的轉雙價基因楊樹對1齡舞毒蛾幼蟲有明顯的殺蟲活性，轉Bt基因的植株經過2～3年的抗蟲測定和優(yōu)良性狀選擇，目前已有3個無性系在我國6個省種植進行評估[16]。鄭均寶等首次將Bt毒蛋白基因和ApI構建成一個雙價表達載體成功導入741楊，對美國白蛾、楊扇舟蛾、楊小舟蛾、古毒蛾、舞毒蛾、盜蛾等具有較高抗蟲性，幼蟲總死亡率達83%～90%，這是國內外首次報道用雙價抗蟲基因獲得的抗蟲楊植株[17]。張冰玉等將BtCry3A和OCI導入銀腺雜種楊基因組中，獲得轉雙價抗蛀干害蟲基因楊樹，并初步篩選出抗性株系[18]。諸葛強等以南林895楊為受體，進行了Bt基因和CpTI基因的遺傳轉化，飼蟲試驗結果表明，楊小舟蛾的生長發(fā)育受到了明顯抑制[19]。

1.1.3 轉抗蟲基因楊樹的生物安全性研究 我國在抗蟲轉基因方面的技術體系已基本成熟，具備不斷推出抗蟲基因工程新品種并用于楊樹人工林建設的能力，走在世界研究的前列。隨著抗蟲轉基因楊樹的環(huán)境釋放及其商業(yè)化，近年來的研究多針對轉抗蟲基因楊樹的生物、生態(tài)安全性探討[20-23]。endprint

1.2 抗病基因轉化

由于抗病基因常與一些不良基因連鎖在一起，往往并非僅由單基因控制，所以利用有性雜交的傳統(tǒng)抗病育種研究受到一定程度的局限。目前，克隆的抗病基因主要有2類：抗病毒基因和抗菌基因?？共《净虻难芯恐饕峭ㄟ^導入病毒外殼蛋白基因，并借助交叉保護作用機制，達到降低病毒侵染的目的。楊樹抗菌性研究的主要病害有楊樹潰瘍病、爛皮病、銹病，導入的抗菌基因主要有幾丁質酶基因、抗菌肽基因（天蠶素基因、防御素基因等）。將幾丁質酶基因導入楊樹，通過幾丁質酶對真菌或細菌細胞壁成分幾丁質的降解達到抑菌的目的?？咕氖菑V泛存在于動植物體中的一類廣譜微生物抗性肽，其以物理的方式作用于微生物的細胞膜，使細胞膜穿孔、細胞質外溢而將微生物殺死。

1.2.1 抗病毒基因轉化 在楊樹的抗病毒基因研究中，英國牛津大學病毒所Cooper領導的研究小組將克隆的楊樹花葉病毒（poplar mosaic virus，簡稱PMV）外殼蛋白基因（PMV-cp）導入楊樹，育成了抗楊樹病毒病的無性系，對楊樹PMV的侵染起到一種類似于免疫學的交叉保護作用[24]。在楊樹的抗菌基因研究中，Rradshaw等從楊樹中克隆出類似于大豆胰蛋白酶抑制劑和幾丁質酶的損傷激活基因的cDNA并進行了轉化研究[25]。Nicolescu等將矮牽牛查爾酮合成酶CHSA基因導入楊樹，提高楊樹的抗病性[26]。Mentag等利用農桿菌介導法將抗菌肽基因D4E1轉入雜交楊樹中，轉化植株對多種病菌均有明顯抗性[27]。

1.2.2 抗病菌基因轉化 國內學者趙世民等將兔防御素基因NP-1導入毛白楊，轉基因植株組織提取液對枯草桿菌、農桿菌、立枯病原菌等的生長均有抑制作用[28]。Liang等將小麥的草酸鹽氧化酶（oxalate oxidase，簡稱OxO）基因轉化雜交楊樹無性系，提高了轉化植株的抗病和抗脅迫能力[29]。孟亮等利用植物幾丁質酶基因轉化美洲黑楊，提高了美洲黑楊對部分真菌性病害的抗性[30]。Jia等分別將來源于球孢白僵菌的幾丁質酶基因Bbchit1與益母草的陽離子抗菌肽基因LJAMP2成功導入毛白楊中，結果發(fā)現(xiàn)，轉Bbchit1基因楊樹對葉枯病具有良好的抗病效果，轉LJAMP2基因楊樹能顯著提高潰瘍病抗病性[31-32]。牛慶霖等將β -1，3-葡聚糖酶基因（BG2）轉入歐美楊107楊中，經抑菌試驗表明，BG2基因的表達提高了107楊對楊樹潰瘍病的抗性[33]。黃艷等利用農桿菌介導的二次遺傳轉化，將Bbchit1基因轉入過量表達無色花色素還原酶基因LAR3轉基因毛白楊中，結果表明，Bbchit1+LAR3共表達轉基因毛白楊細胞粗提液對楊樹葉枯病菌具有明顯的抑制作用，進一步將葉枯病菌接種在轉基因和非轉基因毛白楊葉片上培養(yǎng)30 d，轉基因植株的感病面積均低于非轉基因植株且Bbchit1+LAR3共表達轉基因株系抗病效果更明顯[34]。

目前為止，國內外轉基因的抗楊樹葉銹病、抗楊樹葉枯病、抗日本山楊腫瘤病等的研究還在進一步的試驗當中。近些年來，人們利用多種基因克隆技術，如圖位克隆法、轉座子標簽法等，克隆出了大量的抗病基因，相信這些基因的發(fā)現(xiàn)將給抗病基因工程帶來巨大的推動力，將會有更多成功的報道。

1.3 抗除草劑基因轉化

抗除草劑基因已經成功應用于林木基因工程研究。例如草甘膦，作為一種篩選標記既可用于轉化植株的篩選，又便于轉基因植株的苗期除草管理。除草劑的應用在發(fā)達國家已相當普及，幾乎85%～100%的栽培作物上都使用除草劑。1987年，F(xiàn)illatti等將aroA基因轉入楊樹無性系NC-5339，首次報道培育出楊樹抗除草劑植株，這是楊樹抗性基因工程研究的開端，也是基因工程技術在林木遺傳育種中應用成功的首例[7]。de Block 將抗膦絲菌素除草劑基因轉入楊樹[35]。Chupeau等以楊樹葉片原生質體作為受體，運用電激法將乙酰乳酸合成酶（acetolactate synthase，簡稱Als）突變基因轉入楊樹，獲得了抗磺胺脲類的楊樹植株；又分別轉化乙酰轉移酶（phosphinothricin acetyltransferase，簡稱PAT）基因和新霉素磷酸移酶（neomycin phosphotransferase，簡稱NPT）基因，獲得了抗草苷膦類除草劑的楊樹植株[36]。Confalonieri等得到了高抗草丁膦類除草劑-Basta的轉基因銀白楊[37]。Gullner等將編碼專一性抗除草劑乙酰替氯苯胺的谷氨酰丙氨酶（glutathione S-transferase，簡稱GST）基因轉入楊樹雜交種內，轉基因植株葉片的γ-GST和還原性谷胱甘肽（glutathione，簡稱GSH）含量提高，楊樹的除草劑抗性也得到提高[38]。2002年，Meilan等獲得了一批攜帶有CP4基因的抗草甘膦白楊雜種[39]。

抗除草劑轉基因植株可能出現(xiàn)負面影響，在抗除草劑轉基因植物應用的同時，農作人員會因為他的目標植物耐受除草劑，反而會加大除草劑的使用量，增加了土壤以及植株中的除草劑殘留。這個度的把握還需要科研人員與農作人員共同去實踐摸索。

1.4 抗逆境基因轉化

由于環(huán)境的不斷惡化，越發(fā)嚴重的非生物脅迫降低了林木產量。氧化劑、低溫、土壤的鹽漬化和沙漠化是限制森林樹木生長生存的重要因素，利用基因工程技術培育抗氧化、耐霜凍、耐干旱、耐鹽堿等品質的樹木新品種無疑具有廣闊的應用前景。楊樹的抗逆性研究主要集中在耐鹽、抗旱、抗寒等方面。用于抗逆研究的基因主要有編碼細胞滲透壓調節(jié)物質基因、逆境誘導的植物蛋白激酶基因、抗氧化基因、保護生物大分子及膜結構的蛋白質基因、編碼轉錄因子的調節(jié)基因等。

1.4.1 抗旱及耐鹽堿基因轉化 我國森林覆蓋率僅為1821%，且分布不均，嚴重的干旱、半干旱、鹽堿地、荒漠化等極端脆弱生態(tài)區(qū)已占國土面積的近1/2，鹽漬化土地近0.4億hm2?？购怠⒛望}堿林草品種培育是實現(xiàn)困難立地造林、植被恢復的前提，可以阻止荒漠化、鹽漬化的進一步加劇，又能擴大種植面積，解決人口增加與耕地驟減的矛盾，促進我國生態(tài)環(huán)境特別是脆弱生態(tài)環(huán)境建設，保障社會經濟發(fā)展和人們生產生活安全[40]。endprint

有學者將來自枯草桿菌的果聚糖蔗糖轉移酶基因（SacB）導入銀腺楊，SacB基因在50個無性系中獲得表達，生物學檢測也證明植株的抗旱能力明顯提高[41-42]。研究人員將來自極端抗逆木本植物霸王C2H2鋅指蛋白轉錄因子基因（ZxZF）作為外源基因，對歐美楊渤豐1號進行遺傳轉化，轉基因株系葉片相對含水量和脯氨酸含量均顯著高于非轉基因植株10%以上，轉基因株系抗旱性得到一定程度提高[43-44]。王沛雅等將油菜素內酯合成酶基因DAS5轉入河北楊中，在干旱脅迫條件下轉基因植株的生長狀況和相關生理生化指標測定發(fā)現(xiàn)，轉DAS5基因河北楊的抗旱能力明顯提高[45]。

經多年研究，2004年世界上第1個可用于大田生產的轉基因抗鹽堿楊樹——中天楊（ 八里莊楊） 培育成功，由中國科學院、山東農業(yè)大學、山東金水木抗逆植物研究院聯(lián)合成立的課題組將mtlD基因轉入其中。1996年，研究人員將mtlD基因導入了八里莊楊，獲得了一批具較高抗鹽性的轉化植株，結果表明，轉化植株較對照有明顯提高，生長良好。后續(xù)的大田釋放造林試驗驗證，與對照相比，轉mtlD基因楊樹的造林成活率明顯提高，在0.3%～0.4%土壤鹽化范圍內提高0.7倍；林木生長量顯著增大、樹體健壯、耐鹽能力增強，轉基因楊的田間耐鹽極限為土壤含鹽量的0.43%，可在中度鹽堿地上正常生長[46]。劉桂豐等以小黑楊花粉植株為受體將betA基因轉入小黑楊，經檢測獲得的4個轉基因株系的甜菜堿含量顯著高于對照，顯著提高了轉基因株系的耐鹽性[47]。轉膽堿氧化酶基因（codA）的小黑楊也已被轉化成功，耐鹽性試驗證明轉化植株能在0.6%的NaCl 濃度下生長[48]。楊春霞等將脅迫脫水應答基因DREB1C轉入南林895抗性試驗結果初步表明，轉基因植株的抗旱性、耐鹽性均有所提高[49]。

藺娜將甜菜堿醛脫氫酶（betaine aldehyde dehydrogenase，簡稱BADH）基因和膽堿單加氧酶（choline monooxygenase，簡稱CMO）以2個獨立的表達框形式構建在1個載體上，轉入三倍體毛白楊中發(fā)現(xiàn)，轉BADH+CMO植株的抗旱、耐鹽、抗氧化，耐高/低溫能力均高于轉BADH、轉CMO及野生型植株[50]。姜超強等將擬南芥的AtNHX1基因轉入楊樹Tr品系，顯著提高了楊樹的耐鹽性[51]。2010年，周陳力分別將吉春半乳糖苷酶基因AtGolS2和蔗糖非發(fā)酵相關蛋白激酶基因SRK2C轉入南林895楊，耐鹽性初步試驗表明，轉基因植株的耐鹽性有一定程度的提高[52]。

1.4.2 抗氧化基因轉化 由于環(huán)境的污染及大氣層的破壞，臭氧逐漸成為森林樹木的重要脅迫。一般情況下，臭氧可以破壞植物體內抗氧化劑的防御機制、破壞細胞膜、降低葉綠素的活性及核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶和氧化酶的活性，進而降低植物的光合作用，使植物體過早地衰老，同時降低植物體對其他脅迫的抗性。在1998 年，Arisi等將擬南芥的含有結合鐵的超氧化物歧化酶（Fe-superoxide dismutase，簡稱Fe-SOD）基因導入楊樹，提高了工程植株的耐凍性和抗氧化能力[53]。Gallardo等將松樹胞質谷胱苷肽合成酶基因導入雜種楊獲得表達[54]。Foyer等將谷胱甘肽還原酶基因轉入雜種白楊，得到了過量表達谷胱甘肽還原酶的轉基因植株，大大提高了雜種白楊對氧化劑的抗性，同時也解除了光合作用中產生的氧自由基對植物體的光合抑制現(xiàn)象[55]。Strohm等利用谷胱甘肽合成酶基因GshS和谷胱甘肽降解酶基因GR轉化雜種楊樹，結果表明GshS基因和GR基因的過量表達并不能緩解暴露在高濃度臭氧環(huán)境中轉基因楊樹受到的傷害[56]。陳彩霞等利用農桿菌介導的葉盤法將PeNhaD1基因轉入鹽敏感且速生的派間雜種110楊中，獲得轉PeNhaD1基因的110楊再生植株[57]。Wang等將Mn-SOD基因導入楊樹，使轉基因楊樹SOD活性增強[58]。

1.4.3 抗寒、耐澇基因轉化 植物在生長發(fā)育過程中，溫度作為一個重要的環(huán)境因子對其生長、生殖和分布起著關鍵的作用。低溫不僅在很大程度上限制植物的分布區(qū)域，而且嚴重影響生物產量，甚至造成大面積死亡。研究人員雖然從生理學、形態(tài)學、生物化學、生物物理學等多學科對植物抗凍機制進行深入廣泛地研究，找到了一些與抗寒相關的基因，如抗凍蛋白基因（antifreeze protein gene，簡稱AFP）、低溫信號轉錄因子基因（C-repeat binding transcription factor，簡稱CBF）、膜穩(wěn)定相關基因（FAD、GPAT、SAD）、抗氧化酶活性基因（Fe-SOD、Mn-SOD）、滲透調節(jié)蛋白（BADH、LEA、SacB），但是目前林木抗寒育種還主要依靠天然雜種選育和人工雜交育種，通過基因工程手段改良林木的抗寒性育種發(fā)展還較為緩慢，尚處在探索階段。法國農業(yè)科學研究院（Institut National de la Recherche Agronomique，簡稱INRA）的Lise Jouanin 實驗室將查爾酮合成酶（chalcone synthase，簡稱CHS）基因導入楊樹，轉基因植株對低溫的敏感性降低。1998年，Arisi等用擬南芥的Fe-SOD基因轉化楊樹時發(fā)現(xiàn)，轉基因楊樹不僅葉綠體中Fe-SOD活性高于對照5～ 8倍，而且楊樹的抗凍性也明顯提高[53]。李春霞從胡蘿卜中克隆到抗凍蛋白基因，對山楊進行遺傳轉化，PCR檢測初步證明AFP基因已整合到山楊基因組中[59]。周洲利用2個與增加不飽和脂肪酸相關的基因（fatty acid desaturase，簡稱FAD）及其相應的反義表達載體，分別轉化84K楊，對脂肪酸去飽和酶基因的表達水平進行調控發(fā)現(xiàn)，這2個基因都可以提高轉化植株三烯酸的含量，能在一定程度上改變楊樹脂肪酸組成，轉化植株在低溫脅迫下表現(xiàn)出較強耐抗能力，這為楊樹的抗寒基因工程育種提供了一個研究方向[60]。2011年，張薇用抗凍轉錄因子CBF3基因轉化歐美楊108，通過PCR、RT-PCR檢測初步認定轉化成功，對其抗凍能力還未研究[61]。endprint

楊樹耐澇性較差，南方常常由于大量降水造成長時間積水，給楊樹生產造成了巨大損失。對轉基因楊樹的耐澇能力的研究鮮見報道。2009年，李義良等對轉透明顫菌血紅蛋白基因（vitreoscilla hemoglobin gene，簡稱vgb）的銀腺楊雜種進行耐澇能力的試驗研究，淹水脅迫下vgb基因的表達增強了銀腺雜種楊葉綠素含量的積累，進而促進了轉基因植株的生長，提高了轉基因株系對淹水的忍受能力[62]。這是國內首例轉基因楊樹耐澇性研究。

1.5 降木質素基因轉化

楊樹木質素生物合成基因工程是當前研究的熱點，在紙漿和造紙工業(yè)的林木培育中具有廣闊的前景。木質素硬度很大，在植物的生長過程中具有很重要的作用，但它的存在嚴重阻礙了造紙業(yè)的發(fā)展，很難從木漿里將其剔除，須要加入多種化學試劑去除，增加環(huán)境污染與生產成本。木質素的生物合成是一個復雜的生理生化過程，研究人員通過導入反義抑制、正義共抑制和RNA干擾的相關酶基因載體方法使木質素生物合成過程中一個或幾個酶的表達抑制，降低木質素的含量來改良木材品質。

1995年，Doorsselaere等將甲基轉移酶基因導入楊樹中，其工程植株的甲基轉移酶活性減少達93%[63]。Hu等從白楊中克隆得到4CL基因，通過反義抑制使木質素的含量降低45%，而纖維素的含量升高15%，并能大大促進白楊的生長[64]。2000年，Jouanin等發(fā)現(xiàn)，由于基因沉默使再生楊樹苗中35S啟動子作用的兒茶酚-O-甲基轉移酶（catecholamine-O-methyl transferase，簡稱COMT）活性降低為0，木質素含量降低17%，木質素的結構得到顯著改變，纖維素含量提高，使木質素更易被工業(yè)降解，而CAD啟動子作用下的COMT轉基因楊樹的纖維素含量增加[65]。2000年，F(xiàn)ranke等在轉基因楊樹中證實了F5H的過量表達對木質素單體含量的影響，并認為林木中過量表達F5H是對木質素生物合成進行修飾的有效代謝基因工程策略[66]。幾乎與國外同步，我國報道了利用反義RNA技術、通過抑制編碼木質素合成關鍵酶基因的表達，獲得了木質素顯著降低的轉基因植株。魏建華等將CCoAOMT基因的反義表達載體轉入楊樹，檢測發(fā)現(xiàn)，內源CCoAOMT基因的表達在轉錄和翻譯水平均受到抑制，木質素含量均有不同程度的降低，其中木質素含量下降幅度較大的株系比非轉基因對照下降最高可達41.73%[67-68]。堿法制漿試驗表明，轉基因楊樹在降低堿量的同時，還可以獲得高的紙漿得率，顯示了該轉基因楊樹用于紙漿材培育的潛在應用價值。賈彩紅等將反義4CL基因轉入三倍體毛白楊中發(fā)現(xiàn)，木質素含量下降，但總纖維素含量沒有明顯區(qū)別，推測4CL基因可能并非木質素與碳水化合物的代謝調節(jié)點[69]。Li等將反義CoA連接酶基因和有義CAld5H基因同時導入楊樹，獲得了3種工程植株，攜帶反義CoA連接酶基因的植株木質素含量降低40%，纖維素增加14%；在攜帶有義CAld5H基因植株中，木質素含量基本保持不變；而攜帶2個基因的植株中，木質素含量下降52%，纖維素含量增加30%[70]，這個試驗是首次進行改良楊樹生物質的雙價基因轉接，在楊樹木質素基因改良工程起到了引領作用。2014年，Wilkerson等將當歸的阿魏酸轉移酶基因（ferulic acid transferase，簡稱FMT）轉入楊樹中，干擾了楊樹的木質素的合成，使木質素更易處理[71]，此結果得到了學術界的認同。

在林木材性轉基因改良方面，研究主要集中在改變楊樹木材化學成分，通過改變木質素、纖維素、半纖維素的含量，木質素的化學組成等，降低造紙成本和減少環(huán)境污染，而對于其物理材性（木材密度、微纖絲角）的改良，基本上還未見報道。

1.6 激素合成酶相關基因轉化

提高林木的生長速率、增加莖干生物量積累、縮短輪伐時間、改良林木的木材性狀是林木育種的重要目標。樹木被看作是潛在的低碳生物燃料的重要組成部分，是具有廣闊應用前景的生物質能源。將激素合成相關基因導入楊樹中，有利于提高楊樹生物性能。

Tuominen 等將與生長素合成有關的IaaM、IaaH基因導入楊樹，獲得2個基因同時表達的工程植株，使楊樹木材的維管直徑變小、維管密度增大、射線發(fā)育模式發(fā)生改變，該研究團隊又將帶有rolC啟動子的IaaM基因導入楊樹，使工程植株形成層的吲哚乙酸（indole-3-acetic acid，簡稱IAA）濃度顯著提高[72-73]。Nilsson等將rolC基因導入楊樹，提高了楊樹中游離態(tài)細胞分裂素的濃度，進而影響楊樹的生長和發(fā)育[74]。Eriksson等將赤霉素生物合成關鍵酶基因GA20導入楊樹，提高了楊樹的生長速率[75]。擬南芥內源葡聚糖酶CEL1基因在楊樹中的過量表達也能顯著增加樹高、葉面積、樹干直徑和纖維素含量[76-77]。李偉等將rolB/pttGA20ox雙價基因導入銀白楊中，獲得4株轉基因植株，分析轉化與非轉化組培苗在生根與生長方面的差異，發(fā)現(xiàn)轉雙價基因銀白楊在形態(tài)特征方面具有rolB 和pttGA20ox 單個基因在其他植物中表達的優(yōu)良性狀，且生根速度快、量多、轉化植株生長率高[78]。郝宇等將多拷貝rolB、rolC基因轉入三倍體毛白楊中發(fā)現(xiàn)，rol基因的多拷貝促使轉化植株快速大量生成毛狀根[79]。將棉花中的油菜素內酯合成酶基因DET2導入毛白楊，可以增加轉基因植株的生長量，使木質部纖維細胞增長，還可以打破芽休眠[80-81]。研究人員將油菜素內酯合成酶基因DAS5導入河北楊中發(fā)現(xiàn)，轉DAS5基因河北楊的生長量顯著提高，特別是根干質量顯著增加，同時轉化植株較野生型的抗旱能力明顯增強[45，82]。通過研究證實了將激素相關基因導入楊樹，可以明顯改良楊樹的生物特征，進而達到改良生長周期、抗性、木材質量的效果。

2 研究進展

對林木來說，繁殖周期長、遺傳雜合性高、許多性狀的遺傳機制不明、性狀分析困難及種間地理隔離、生殖隔離等因素的限制，使利用常規(guī)育種手段完成優(yōu)質、高抗、高森林生產力等育種目標十分困難。借助現(xiàn)代分子生物學技術手段，尤其是利用基因工程手段解決一些用經典遺傳育種方法很難解決或根本解決不了的問題，使之成為常規(guī)育種方式的有力補充，大力推進我國林木育種進程。從第1個轉基因楊樹工程植株的產生到現(xiàn)在，已經約有30年的時間。在這一時期，分子生物學、植物組織培養(yǎng)蓬勃發(fā)展，為楊樹轉基因打下了牢固的基礎。目前已將不少的目的基因和標記基因導入楊樹，完成了遺傳轉化的系統(tǒng)構建，有些已經開始進行商品化生產。endprint

2.1 我國抗蟲轉基因研究應用處于世界先列，安全性評價同步進行

國內外對抗蟲轉基因楊樹的研發(fā)工作都高度重視，而我國在這一領域的研究水平處于世界前列。由我國林業(yè)科學院林業(yè)研究所培育的轉Bt基因Cry1A歐洲黑楊和河北農業(yè)大學培育的轉雙抗蟲基因（Cry1Ac+API）741楊2個抗食葉害蟲轉基因楊樹品種已進入了商業(yè)化應用階段，我國也因而成為林木抗蟲基因工程應用最早的國家，其中轉Bt基因歐洲黑楊是目前世界上釋放面積最大的轉基因林木品種，栽培面積已達450 hm2。我國獲得的歐美楊、美洲黑楊、小黑楊、毛白楊等10多個抗蟲轉基因楊樹品系（無性系）也已相繼進入了田間試驗階段[83]。面對轉基因抗蟲楊樹的商業(yè)化步伐，研究人員近幾年來開展了轉抗蟲基因楊樹對生態(tài)安全性的評價研究，包括對非靶標生物的影響、昆蟲抗性的影響、昆蟲群落結構的影響以及對土壤微生態(tài)系統(tǒng)的影響等方面。有研究發(fā)現(xiàn)，抗蟲轉基因楊樹對非靶標生物無明顯毒害作用、對根際土壤微生物群落無明顯影響，其節(jié)肢動物群落更穩(wěn)定、多樣[20，22，84]。也有研究發(fā)現(xiàn)，轉抗蟲基因楊樹在殺蟲的同時，有可能會破壞局部地區(qū)的生態(tài)種群平衡，或會促使靶標害蟲產生抗性并遺傳。李海峰等對移栽7個月的轉Bt-蜘蛛神經毒肽重組基因的小黑楊根際土壤微生物數(shù)量與基因水平轉移情況檢測發(fā)現(xiàn)，轉基因植株根際土壤微生物數(shù)量略有升高，但其中有部分微生物產生抗生素抗性，并且有轉基因植株目的基因水平轉移到根際土壤微生物的情況發(fā)生，這一結果還須更大范圍地檢測驗證[23]。轉基因樹木的安全評估是一個長期而復雜的過程，必須進行長期的持續(xù)跟蹤研究，才能獲得較全面的數(shù)據(jù)，以評估其大面積釋放的安全性。

2.2 耐寒轉基因楊樹研究尚在探索階段進展緩慢

在我國北方地區(qū)，楊樹在生長過程中經常會遇到低溫脅迫，尤其是在晚秋和早春時期，由于現(xiàn)有的許多速生豐產系不耐低溫，氣溫的驟然下降會對樹木產生極大傷害。而林業(yè)上通常使用的防寒措施，如施肥、樹干涂白也只能在一定程度上提高楊樹的抗寒能力，卻又費時費力，難以廣泛開展。因此，對楊樹進行抗寒機制研究，從而篩選出不同抗寒能力的楊樹品種，為楊樹的適地、適樹、適品種推廣提供理論依據(jù)，對楊樹速生豐產林的發(fā)展意義重大。在對楊樹的轉基因和抗凍基因工程研究中，用于楊樹抗寒遺傳轉化的外源基因較少，因此，對其他林木中的抗寒相關基因進行克隆、分離，為楊樹抗寒基因工程提供基因儲備，這些都須要進一步深入研究。有學者將抗凍相關基因導入楊樹中，對其抗凍性還未檢測[59，61]。周洲將增加不飽和脂肪酸相關的基因（PtFAD2、PtFAD2）轉化84K楊發(fā)現(xiàn)，可以提高轉化植株三烯酸的含量，能在一定程度上改變楊樹脂肪酸組成，轉化植株在低溫脅迫下表現(xiàn)出較強耐寒能力[60]，這為楊樹的抗寒基因工程育種提供了一個新的研究方向。目前在楊樹的抗寒性研究上，對引起這些抗寒生理生化變化的分子機制研究甚少，而且通過轉基因或植入抗凍蛋白等技術來提高楊樹抗寒性的研究也較缺乏，這將會是下一步研究的重點[85]。

2.3 多基因共轉化研究初見成效

迄今為止，已有諸多遺傳轉化成功的報道，但獲得理想的轉基因楊樹并不多。究其原因，首先是自然界生物的多數(shù)性狀往往是由多基因控制的，多數(shù)的遺傳轉化研究是將1個或2個外源基因轉入受體楊樹。對轉基因楊樹的多數(shù)性狀來說，一兩個外源基因可能因為表達強度不夠或作用機制單一，難以實現(xiàn)轉基因的目的，為達到培育高產、優(yōu)質、多抗等性狀的品種目的，就須要把3個或更多有用基因導入楊樹中進行多基因操縱。夏永剛等利用基因槍共轉化法將5個外源基因[調節(jié)基因（JERF36）、枯草桿菌果聚糖蔗糖酶基因（SacB）、透明顫菌血紅蛋白基因（vgb）、雙價抗蛀干害蟲基因（BtCry3A+OC-1）、報告基因（NPTⅡ）]導入庫安托楊，獲得含有5個外源基因的轉基因楊樹新品種，經在鹽堿地中試驗表現(xiàn)出較強的耐鹽堿性，隨后進行抗旱、耐澇、及生產能力試驗均表現(xiàn)良好，對目標害蟲有一定抗蟲性，對昆蟲群落多樣性無明顯影響，NPTⅡ蛋白的表達量并沒有隨著目的基因數(shù)量的增加而升高，轉多個基因楊樹可能由標記基因引起的生物安全問題并不會加劇[22，86-88]。這開創(chuàng)了多價基因同時轉入楊樹，并同時表達的實踐先河。目前尚未獲得可以大面積推廣的具有優(yōu)良基因的楊樹新品種，未來的發(fā)展方向是進行多基因共價轉化、試圖獲得優(yōu)良的楊樹新品種。

3 楊樹轉基因研究存在問題及展望

楊樹基因的改良雖然取得了不少的成果，但在實際應用中還存在很多困難，有很多問題亟須解決。目前楊樹基因改良的總體特征是進行楊樹遺傳轉化體系研究的多，進入大田栽培的品種少；進行單個基因轉化的多，多個基因共同轉化的少，而且所選用的目的基因大都不是來自楊樹本身，多數(shù)是來源于微生物和草本植物。應加快對楊樹本身基因組的研究，針對抗旱耐鹽、抗病蟲等關鍵抗逆性狀，開展楊樹多基因遺傳轉化研究，建立轉多基因楊樹種苗繁育、生物安全評價及管理示范體系，構建高效、安全、快捷的林木轉基因及評價技術平臺，為我國林業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供技術支撐。目前，我國是以美洲黑楊種質為基礎的品種國產化育種，將楊樹產業(yè)種質擴大到江淮流域，但黑楊派種質不能很好地適應西北干旱、半干旱地區(qū)栽種，亟須培育抗旱、抗寒、耐鹽堿能力強的楊樹品種，使我國遼闊的荒漠化日益嚴重的西北干旱、半干旱地區(qū)獲得性狀優(yōu)良的更新?lián)Q代品種。

在化石燃料急劇枯竭、溫室效應不斷加劇的今天，楊樹作為可持續(xù)再生生物質能源中重要的一員，可為新能源的開發(fā)利用貢獻力量。但其自身豐富的木質素組成阻礙了對纖維素的降解利用，降低了生物染料產出，同時也增加了造紙生產中的污染與成本。在過去的幾十年中，研究工作者們一直致力于通過改造植株中的木質素組成，來降低其對工業(yè)生產和畜牧造成的影響。能否通過改造得到自身合成易于處理或消化的木質素的植株，成為整個纖維素利用領域的關鍵。2014年，一項由威斯康星大學麥迪遜分校生物化學系教授Ralph負責的研究，即從當歸中克隆得到阿魏酸輔酶A轉移酶基因并導入楊樹中，通過對木質素取樣并使用高效液相色譜檢測，轉基因楊樹合成的木質素中含有阿魏酸，用6.25 mmol/L NaOH在90 ℃下處理3 h后，木質素含量就減少到滿足進行后續(xù)工業(yè)生產的標準，而目前常用的處理溫度是160～200 ℃。這使進一步改造和設計易于利用纖維素和木質素的植物的設想成為了可能。這一研究結果為楊樹木材利用提供了新基礎，相信在不久的將來，木質素降解與促進生長相結合的轉基因楊樹在造紙工業(yè)及新能源等領域扮演重要角色。endprint

在全球范圍內，轉基因樹木的發(fā)展將在優(yōu)良樹種的選育、瀕危樹種保護等方面發(fā)揮更大的作用。隨著我國已繪制出毛白楊基因組序列框架，楊樹的基因改良將進入一個新的時代，運用楊樹自身龐大豐富的優(yōu)良基因進行多基因共價轉化，獲取性狀優(yōu)良的楊樹新品種[79]。隨著分子生物學理論和技術的進步，各種轉化體系的建立和逐步完善，遺傳轉化技術將得到進一步的發(fā)展，這些都為轉基因樹木的研究奠定了堅實的基礎。通過基因工程手段改造的樹木新品種，必在凈化大氣、改良土壤、恢復生態(tài)、生物質能源及提供優(yōu)質木材等方面發(fā)揮巨大作用。

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