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(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 遼寧 大連 116600)

·種子檢驗·

不同農(nóng)家類型林下山參種子的鑒定研究

張建逵，竇德強，康廷國，王冰

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 遼寧 大連 116600)

[目的]研究不同農(nóng)家類型林下山參種子的鑒定方法。[方法]采用測量、稱重、外部形態(tài)觀察、表面特征觀察等方法。[結(jié)果] 1) 長脖類種子的千粒重最重，大馬牙次之，二馬牙最輕； 2) 長脖類和大馬牙、二馬牙種子單粒重、長度均有極顯著性差異(p<0.01)，大馬牙和二馬牙種子單粒重、長度無顯著性差異(p>0.05)； 3) 三類種子的寬度、厚度兩兩之間均有顯著性差異(p<0.05)； 4) 三類種子的外觀形態(tài)有所不同，可作為鑒定特征。[結(jié)論]本研究可為林下山參種子的鑒別、選育提供科學(xué)依據(jù)。

種子； 林下山參； 人參； 長脖； 大馬牙； 二馬牙

人參(PanaxginsengC.A.Mey.)為我國傳統(tǒng)的名貴中藥材，具有大補元氣、固脈復(fù)脫、補脾益肺、生津養(yǎng)血、安神益智的功效。目前市售的人參商品主要有園參、林下山參、野山參等。2015版《中華人民共和國藥典》一部對于林下山參的定義為：播種在山林野生狀態(tài)下自然生長的稱“林下山參”，習(xí)稱“籽?！盵1]。有馬牙類(大馬牙、二馬牙)、長脖類(線蘆、圓膀圓蘆、竹節(jié)蘆、草蘆)等農(nóng)家類型[2-3]。

在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，常把內(nèi)含種子的果核稱為“種子”。近年來,關(guān)于人參種子的研究報道主要集中在種子帶菌檢測、種子萌發(fā)、種子飽滿度、種子大小及分布特征及化感作用等方面[4-8]。在對林下山參種植戶的走訪中發(fā)現(xiàn)，由于長脖類林下山參的形態(tài)更似野山參，其價格比馬牙類林下山參更高，因此目前市場上有不法商販以馬牙類的種子冒充長脖類種子銷售，給種植戶造成了經(jīng)濟損失。在各農(nóng)家類型的人參種子鑒定方面，研究報道較少。本實驗通過稱重、測量、外部形態(tài)觀察、表面特征觀察等方法對3種不同農(nóng)家類型的種子進行研究，為林下山參種子的鑒定提供參考。

1 儀器與樣品

1.1 儀 器

Sartorius BP 211 D型電子分析天平(德國賽多利斯公司)；Olympus SZX 9 體視顯微鏡，配PD 72顯微數(shù)碼相機及顯微攝影系統(tǒng)(日本奧林巴斯公司)；HITACHI SU 8010型高分辨場發(fā)射掃描電鏡(日本日立高新技術(shù)公司)；游標(biāo)卡尺(溫州三和量具儀器有限公司)。

1.2 樣 品

大馬牙、二馬牙林下山參種子于2015年8月采自遼寧省本溪縣東營坊鄉(xiāng)南營坊村；長脖類林下山參種子于2015年9月采自遼寧省寬甸縣振江鄉(xiāng)石柱村；采集時同時將地下部分取出，供鑒別用。以上均經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)康廷國教授鑒定為五加科植物(Panax ginseng C.A.Mey.)各農(nóng)家類型的種子。

2 方法與結(jié)果

2.1 種子千粒重的測定

將各類種子粒數(shù)查清后，全部稱重，計算千粒重。千粒重(g)=(W/n)×1 000，式中：W為凈種子重量，n為凈種子總粒數(shù)[9]。由表1可見，長脖類種子的千粒重最重，大馬牙次之，二馬牙最輕。

2.2 種子單粒重及形態(tài)指標(biāo)的測定及比較

從各類種子中各隨機選出30粒，分別用分析天平稱定其單粒重，用游標(biāo)卡尺量其長度、寬度、厚度并計算長寬比，結(jié)果見表2。

表3 三類種子各指標(biāo)間p值的兩兩比較

類型p值單粒重a長度b寬度a厚度b長寬比c長脖大馬牙0.002**0.000**0.000**0.001**0.530長脖二馬牙0.000**0.000**0.000**0.000**0.717大馬牙二馬牙0.2050.4120.040*0.000**0.790

注：“**”表示在0.01水平上有顯著性差異；“*”表示在0.05水平上有顯著性差異；a表示多重比較的方法為秩變換后的LSD法；b表示多重比較的方法為Tamhane’s T 2法；c表示多重比較的方法為LSD法。

表1 種子的千粒重

指標(biāo)類型大馬牙二馬牙長脖W(g)5.094.645.61n195208189千粒重(g)26.1022.3129.68

注：W為凈種子重量，n為凈種子總粒數(shù)。

指標(biāo)類型大馬牙二馬牙長脖單粒重(mg)25.88±0.0023.60±0.0029.31±0.01種子長度(mm)5.31±0.295.39±0.145.70±0.26種子寬度(mm)4.30±0.204.39±0.204.66±0.24種子長寬比1.23±0.041.23±0.051.23±0.06種子厚度(mm)2.72±0.292.18±0.162.47±0.22

對各組數(shù)據(jù)進行差異顯著性檢驗，由于二馬牙種子的單粒重數(shù)據(jù)不呈正態(tài)分布，大馬牙種子的寬度數(shù)據(jù)不呈正態(tài)分布，因此單粒重和種子寬度數(shù)據(jù)采用 Kruskal-WallisH檢驗，其他指標(biāo)采用單因素方差分析的方法。

經(jīng)Kruskal-WallisH檢驗，三類種子的單粒重、種子的寬度均有極顯著性的差別(p=0.000<0.05)； 種子的長度、厚度數(shù)據(jù)經(jīng)檢驗，數(shù)據(jù)方差不齊，采用Tamhane’s T 2的方法[10]，結(jié)果表明，三類種子的長度、厚度均有極顯著的差別(p=0.000<0.01)； 種子的長寬比數(shù)據(jù)經(jīng)檢驗，數(shù)據(jù)方差齊，采用LSD的方法[10]，結(jié)果表明，三類種子的長寬比沒有差別(p>0.05)。

進一步對有顯著性差別的指標(biāo)進行兩兩比較，結(jié)果見表3。

種子單粒重數(shù)據(jù)進行秩變換，得到秩次代替原變量，再采用LSD法進行兩兩比較[11]，由表3可知，長脖類和大馬牙、二馬牙種子單粒重均有極顯著性的差異(p<0.01)，大馬牙和二馬牙種子單粒重?zé)o顯著性差異(p>0.05)。

對種子寬度數(shù)據(jù)進行秩變換，得到秩次代替原變量,再采用LSD法進行兩兩比較[11]，由表3可知，三類種子的寬度兩兩之間均有顯著性差異(p<0.05)。

對種子的長度數(shù)據(jù)進行多重比較[10]，由表3可知，長脖類和大馬牙、二馬牙種子長度均有極顯著性的差異(p<0.01)，大馬牙和二馬牙種子長度無顯著性差異(p>0.05)。

對種子的厚度數(shù)據(jù)進行多重比較[10]，由表3可知，三類種子的厚度兩兩之間均有極顯著性差異(p<0.01)。

2.3 種子外觀形態(tài)鑒定

從各類種子中各隨機選出20粒，清洗干凈，晾干后，將種子置于體視顯微鏡下觀察并拍照，每類觀察10粒種子，結(jié)果見圖1。每類剩余的10粒種子分別用雙面膠將其固定在鉆臺上，標(biāo)號后噴金，將其置于掃描電鏡下，密封抽真空，觀察并拍照，結(jié)果見圖2。

2.3.1 大馬牙類種子

果核橢圓形。略扁，表面淺黃棕色，凹凸不平有皺紋，粗糙，體視顯微鏡下可見明顯的角質(zhì)化。背側(cè)呈弓形隆起，兩側(cè)較平，腹側(cè)平直或稍內(nèi)凹，基部珠孔呈略尖小突起。珠孔上方有1條脈，延至果核上端后分為數(shù)支，凡脈經(jīng)過處果核均向內(nèi)微凹而呈淺溝狀，一面有2條溝，另一面有1條溝，均較為明顯，溝內(nèi)有時有絲狀的中果皮殘存。掃描電鏡下可見：種皮表面紋飾呈嚼爛狀，即像被侵蝕后形成的不規(guī)則的溝和小孔穴[12]?？籽▋?nèi)常見球形顆粒。種皮表面可見少數(shù)形狀不規(guī)則的碎塊或片狀突起。

2.3.2 二馬牙類種子

果核橢圓形。略扁，表面黃白色，凹凸不平有皺紋，稍粗糙，體視顯微鏡下可見明顯的角質(zhì)化。背側(cè)呈弓形隆起，兩側(cè)較平，腹側(cè)平直或稍內(nèi)凹，基部珠孔呈略尖小突起。珠孔上方有1條脈，延至果核上端后分為數(shù)支，凡脈經(jīng)過處果核均向內(nèi)微凹而呈淺溝狀，一面有2條溝，另一面有1條溝，均不明顯，溝內(nèi)有時有絲狀的中果皮殘存。掃描電鏡下可見：種皮表面紋飾呈嚼爛狀，即像被侵蝕后形成的不規(guī)則的溝和小孔穴。種皮表面可見少數(shù)形狀不規(guī)則的碎塊或片狀突起。

2.3.3 長脖類種子

果核橢圓形。略扁，長5～6.5 mm，寬4～5 mm，厚2.1～3.0 mm。表面黃棕色，凹凸不平有皺紋，較粗糙，體視顯微鏡下可見其角質(zhì)化不明顯，十分粗糙。背側(cè)呈弓形隆起，兩側(cè)較平，腹側(cè)平直或稍內(nèi)凹，基部珠孔呈較尖小突起。珠孔上方有1條脈，延至果核上端后分為數(shù)支，凡脈經(jīng)過處果核均向內(nèi)微凹而呈淺溝狀，一面有2條溝，另一面有1條溝，均極為明顯，溝內(nèi)有時有絲狀的中果皮殘存。掃描電鏡下可見：種皮表面紋飾呈一些方向不定的平行短棱，相鄰的兩短棱間為1條較淺的長溝；孔穴較少見；種皮表面可見許多形狀不規(guī)則的碎塊狀或片狀突起，常成片存在。

注：1為大馬牙；2為大馬牙(表面放大)；3為二馬牙；4為二馬牙(表面放大)；5為長脖類；6為長脖類(表面放大)。下同。圖1 林下山參種子外觀形態(tài)

2.3.4 三類種子的檢索表

結(jié)合三類種子的千粒重、形態(tài)指標(biāo)測量及形態(tài)描述，編寫檢索表如下：

1. 千粒重約29 g，種子長度約5.70 mm，寬度約4.70mm，表面黃棕色，較粗糙，體視顯微鏡下可見角質(zhì)化不明顯，基部珠孔呈較尖小突起，表面溝狀紋理極明顯。掃描電鏡下可見種皮表面紋飾呈一些方向不定的平行短棱，相鄰的兩短棱間為一較淺的長溝；孔穴少見；種皮表面可見許多形狀不規(guī)則的碎塊狀或片狀突起，常成片存在

長脖類

1. 千粒重22～26 g，種子長度為5.30～5.40 mm，寬度為4.30～4.40 mm，表面淺黃棕色，或黃白色，體視顯微鏡下可見角質(zhì)化明顯，基部珠孔呈略尖小突起，表面溝狀紋理明顯或不明顯。掃描電鏡下可見種皮表面紋飾呈嚼爛狀，具稍深的溝，孔穴多見。種皮表面可見少數(shù)形狀不規(guī)則的碎塊或片狀突起

馬牙類

2. 種子厚度約2.70 mm，寬度約4.30 mm，表面淺黃棕色，體視顯微鏡下可見表面溝狀紋理明顯，掃描電鏡下可見孔穴內(nèi)常具球形顆粒

大馬牙

2. 種子厚度約2.20 mm，寬度約4.40 mm，表面黃白色，體視顯微鏡下可見表面溝狀紋理不明顯，掃描電鏡下可見孔穴內(nèi)的球形顆粒少見

二馬牙

圖2 林下山參種皮表面紋飾(掃描電鏡下)

3 討論與結(jié)論

3.1園參的種子最早源自野山參的種子，而林下山參最早是將園參的種子播撒在山林野生狀態(tài)下自然生長而成的。本實驗中3種農(nóng)家類型的種子均來自于由園參種子發(fā)育而成的林下山參，其千粒重及形態(tài)指標(biāo)等的差異可能與其生態(tài)環(huán)境上的差異及繁殖的代數(shù)不同有關(guān)。

3.2在進行種子形態(tài)觀察時，應(yīng)先將種子表面洗凈、烘干，再進行觀察，防止砂土、灰塵等影響觀察結(jié)果。

3.3肖盛元等的研究表明，人參種子寬度總體平均值約為4.5 mm，寬度>4.5 mm和<4.5 mm 的分別占總體的48.56%和51.44%。人參種子單粒重為10～50 mg[7]。本實驗的結(jié)果與之大體一致，但單粒重明顯偏低，其原因之一可能是由于林下山參的種植過程中沒有人為因素(如施肥、灌溉等)的影響，造成其種子中初生代謝產(chǎn)物積累不如園參種子中的多，所以林下山參種子單粒重較園參種子的要低。

3.4本實驗結(jié)果表明： 1) 長脖類種子的千粒重最重，大馬牙次之，二馬牙最輕； 2) 長脖類和大馬牙、二馬牙種子單粒重、長度均有極顯著性的差異(p<0.01)，大馬牙和二馬牙種子單粒重、長度無顯著性差異(p>0.05)； 3) 三類種子的寬度、厚度兩兩之間均有顯著性差異(p<0.05)； 4) 三類種子的外觀形態(tài)有所不同，可作為鑒定特征。本研究結(jié)果可為林下山參種子的鑒別、選育提供科學(xué)依據(jù)。

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成出苗不齊，甚至斷苗的情況，進而影響冬凌草的產(chǎn)量和質(zhì)量。在實際生產(chǎn)過程中，種子的千粒重、發(fā)芽率、發(fā)芽勢等指標(biāo)的高低對種子的出苗情況影響較大。

冬凌草種子顆粒微小，應(yīng)用種子形態(tài)鑒定法鑒別較為困難，采用幼苗形態(tài)鑒別則周期較長，時效性不高，不利于實現(xiàn)冬凌草的現(xiàn)代化栽培。經(jīng)查閱相關(guān)資料文獻，考慮下一步將采用生化鑒定的方法和色譜技術(shù)對冬凌草種子的真實性進行研究。

在種子發(fā)芽實驗過程中，冬凌草種子的吸脹前處理是種子發(fā)芽的前提。在不同的發(fā)芽條件下，首、末次發(fā)芽時間是不同的，因此，在發(fā)芽率測定前，要進行種子的最佳消毒處理、最佳發(fā)芽床、最佳發(fā)芽溫度等的單因素考察，再在最佳發(fā)芽條件下進行發(fā)芽首末次計數(shù)時間的確定，方便統(tǒng)一種子的發(fā)芽時間，對種子發(fā)芽率的測定有重大意義。

介于實驗過程中發(fā)現(xiàn)部分冬凌草種子出現(xiàn)病菌感染的情況，對冬凌草種子健康度檢測的方法進行研究，并制定了冬凌草種子健康度的測定方法。在探索研究影響冬凌草種子發(fā)芽率的病原微生物的過程中發(fā)現(xiàn)：所分離出的大部分菌種對冬凌草種子的萌發(fā)影響很小。但實驗觀察中發(fā)現(xiàn)，鐮刀菌屬真菌在種子萌發(fā)前期抑制種子的萌發(fā)，后期導(dǎo)致種苗腐爛而死亡；鏈格孢菌屬真菌在種子萌發(fā)前期對冬凌草種子影響較小，后期導(dǎo)致種苗腐爛而死亡；毛霉屬真菌在種子萌發(fā)前期抑制冬凌草種子的萌發(fā)，但較鐮刀菌屬真菌抑制作用弱，后期影響較小。青霉屬真菌對冬凌草種子的萌發(fā)幾乎無影響。其中，鏈格孢屬真菌和鐮刀菌屬真菌對冬淩草種子正常萌發(fā)影響較大，而鏈格孢屬真菌出現(xiàn)頻率最高，因此，最終將鏈格孢屬真菌作為影響冬凌草種子的主要菌種。對影響冬凌草種子發(fā)芽率的病原微生物及防治方法有待進一步研究。

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(本欄目責(zé)任編輯：申 曉)

Study on the Authentication of the Seed of Ginseng Cultivated Under Forest of Different Farm Types

ZHANGJiankui,DOUDeqiang,KANGTingguo,WANGBing

2016-11-26

2015年遼寧省教育廳科學(xué)研究一般項目(L 2015349)；遼寧省中藥原料藥質(zhì)量監(jiān)測技術(shù)服務(wù)中心建設(shè)項目。

張建逵(1980—)，男，遼寧省大連市人；副教授，博士研究生，主要從事中藥種質(zhì)資源及品質(zhì)評價研究；E-mail：lnzyzjk@sina.com。

康廷國(1953—)，男，內(nèi)蒙古赤峰人；教授，博士生導(dǎo)師，主要從事中藥鑒定及品質(zhì)評價研究；E-mail：kangtg@lnutcm.edu.cn。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2017.04.115

S 567.5+1

A

1001-4705(2017)04-0115-05