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(1.廣西大學(xué)， 南寧 530005； 2.廣西壯族自治區(qū)煙草公司百色市公司， 廣西 百色 533899；3.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)用生物技術(shù)研究所， 北京 100050)

靈發(fā)素(LFS)誘導(dǎo)煙草葉片愈傷組織的研究

李廷洋1，周鳳玨1，許鴻源1，周文亮2，龔銀花1，賴洪敏2，陳念平1，解云英3，許鴻章3

(1.廣西大學(xué)， 南寧 530005； 2.廣西壯族自治區(qū)煙草公司百色市公司， 廣西 百色 533899；3.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)用生物技術(shù)研究所， 北京 100050)

[目的]研究LFS誘導(dǎo)煙草葉片愈傷組織的生物活性和使用濃度；[方法]以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度LFS配制成誘導(dǎo)培養(yǎng)基，以煙草幼葉切片作外植體，進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)；[結(jié)果] 1) LFS 0.05～2.00 mg/L皆表現(xiàn)出誘導(dǎo)煙草葉片愈傷組織的生物活性；2) 最適濃度為1.50 mg/L，10 d出愈率48%，20 d達(dá)100%。愈傷組織的褐化與板結(jié)程度輕微，每瓶平均鮮重產(chǎn)量為8.3 g，而ck組只有1.7 g；[結(jié)論]LFS作為單一誘導(dǎo)劑添加于MS可以快速、優(yōu)質(zhì)、高效地獲得煙草葉片愈傷組織。

靈發(fā)素； 煙草； 愈傷組織

煙草(NicotianatabacumL.)的愈傷組織(Callus)是生產(chǎn)再生植株，獲得遺傳良性變異，進(jìn)行品種改良的重要材料。同時，煙草作為植物生物技術(shù)研究的模式植物，其愈傷組織也是細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)和基因?qū)W等基礎(chǔ)研究的重要試驗(yàn)材料。有關(guān)獲得煙草愈傷組織的技術(shù)研究報(bào)告頗多，但是歸納起來，其共同點(diǎn)有： 1) 基本培養(yǎng)基。絕大多數(shù)是用MS(Murashige和Skoog,1962)，偶然有用H(Bourgin和Nitsch,1967)。 2) 誘導(dǎo)劑。幾乎全部是使用以下2類5種植物生長物質(zhì)，即生長素類(Auxin)中的3種：2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)，NAA(萘乙酸)和IBA(吲哚丁酸)；細(xì)胞分裂素類(Cytokinin)中的2種：BA(N6-芐基腺嘌呤)和KT(激動素)，而且還必需是其中的2種，甚至3～5種進(jìn)行復(fù)配使用，才能達(dá)到誘導(dǎo)愈傷組織的效果。這些現(xiàn)有獲得煙草愈傷組織的技術(shù)方案有如下缺點(diǎn)： 1) 培養(yǎng)基的配制程序繁雜費(fèi)工。 2) 被大多數(shù)人普遍采用的2,4-D和NAA均有明顯的毒性和殘留。特別是廉價易得、應(yīng)用最廣的2,4-D原本就是除草劑，極易使剛獲得的愈傷組織發(fā)生褐化和板結(jié)，嚴(yán)重影響其質(zhì)量，甚至導(dǎo)致外植體和新生愈傷組織的死亡。為此，技術(shù)人員不得不頻繁地把外植體轉(zhuǎn)接到新鮮的培養(yǎng)基上，以減輕2,4-D的累積和傷害，耗費(fèi)工時。3) 獲得的愈傷組織產(chǎn)量低，質(zhì)量差。在相關(guān)報(bào)導(dǎo)中，幾乎無一例外，從原始外植體獲得愈傷組織后，都必須及時轉(zhuǎn)入另外某種不同的專用增殖培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)繁，才能達(dá)到收獲愈傷組織的目的[1-2]。靈發(fā)素(Lingfasu，LFS；代號PGR-08)是一種新型的生物源植物生長物質(zhì)，屬于腺嘌呤衍生物，無毒害和殘留。它同時兼具細(xì)胞分裂素(CTK)的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性，又同時具有生長素(Auxin)的生物活性[3-5]。LFS已在被公認(rèn)為難以組培的中藥材——三七的愈傷組織誘導(dǎo)中獲得成功[6]。藍(lán)桃菊等[7]、陳念平等[8]和梁瓊月等[9]已相繼在誘導(dǎo)甘蔗和半夏愈傷組織中獲得成功，但尚未見LFS誘導(dǎo)煙草愈傷組織的研究報(bào)告。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

煙草品種為云煙85，種子由廣西煙草公司百色市公司提供；LFS為中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所提供的重結(jié)晶品，純度≥98%；2,4-D，NAA和BA，等購自南寧市醫(yī)藥站化劑公司，進(jìn)口分裝。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和方法

1.2.1 外植體的制備

按常規(guī)方法用煙草種子獲得無菌煙草植株，當(dāng)生長至5、6片葉時，自上而下取其第3片展開功能葉，在無菌條件下，切除距葉柄以上約2 mm部分葉片和葉顯著差異水平。

表1 不同濃度LFS對煙草葉片愈傷組織誘導(dǎo)率的影響

愈傷組織誘導(dǎo)率(%)ckMS+LFS0.05MS+LFS0.10MS+LFS0.50MS+LFS1.00MS+LFS1.50MS+LFS2.0010d10.1aA10.0aA20.8bB35.6cC46.8dD48.3eE48.2eE20d72.4aA86.2bB90.4cC97.8dD100.0eE100.0eE100.0eE

注：ck為MS+2,4-D 0.10+NAA 0.50+BA 0.20。數(shù)據(jù)后的不同小寫字母表示處理間達(dá)到5%的顯著差異水平，大寫字母表示達(dá)到1%極

尖以下約2 mm部分葉片；再沿主脈兩側(cè)分切成約5 mm×5 mm的方片作外植體，備用。同時取15個方片分成3組，每組5個方片，用扭力天平快速稱量并計(jì)算每5個方片的平均鮮重FW1(g)，以便最后計(jì)算愈傷組織的產(chǎn)量。

1.2.2 培養(yǎng)基的制備

按常規(guī)配制MS固體培養(yǎng)基，分別添加LFS 0.05，0.10，0.50，1.00，1.50，2.00 mg/L作為煙草愈傷組織的單一誘導(dǎo)劑，形成6組含有不同濃度靈發(fā)素的煙草愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基。為了更直觀地比較LFS與傳統(tǒng)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)效果的差別，參考傳統(tǒng)方法擬定了MS+2,4-D 0.10 mg/L+NAA 0.50 mg/L+BA 0.2 mg/L作對照組(ck)。各組培養(yǎng)基均調(diào)pH=5.8～6.0；常規(guī)滅菌，備用。

1.2.3 接種與培養(yǎng)

上述7組誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每組接種10瓶，每瓶接5個方片外植體。在晝/夜(30±1)℃/(26±1)℃，光強(qiáng)2 000～2 500 lx條件下培養(yǎng)誘導(dǎo)煙草愈傷組織。

1.2.4 測定項(xiàng)目

培養(yǎng)10 d，每組隨機(jī)取3瓶統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率，愈傷組織誘導(dǎo)率(%)=出愈方片數(shù)/接種方片數(shù)×100%(不論出愈方片污染與否及出愈多少)；20 d終止培養(yǎng)，每組隨機(jī)取3瓶統(tǒng)計(jì)以下指標(biāo)：愈傷組織誘導(dǎo)率(同上)；轉(zhuǎn)綠率(%)=有愈傷組織轉(zhuǎn)綠方片數(shù)/出愈方片數(shù)×100%(不論愈傷組織轉(zhuǎn)綠方片的實(shí)際轉(zhuǎn)綠程度，以肉眼可辨為準(zhǔn))；褐變率(%)=出愈方片褐變數(shù)/出愈方片數(shù)×100%；褐變程度，以“+”多少表示；板結(jié)率(%)=愈傷組織緊實(shí)難以增殖分化的方片數(shù)/出愈方片數(shù)×100%；凈鮮重(g/瓶 )，每組隨機(jī)取3瓶無污染者，去除培養(yǎng)基后，以吸水紙去掉游離水，扭力天平迅速稱量每瓶培養(yǎng)物(含外植體方片及其愈傷組織和附生物)的總鮮重(FW2)(g)，計(jì)算每瓶收獲愈傷組織的凈鮮重(FW)(g)=FW2-FW1(培養(yǎng)前平均每5個方片的鮮重)。以上均記錄3瓶的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度LFS對煙草葉片愈傷組織誘導(dǎo)率的影響

由表1可見，添加LFS濃度在0.05～2.00 mg/L的情況下，都顯示出能夠誘導(dǎo)煙草葉片外植體脫分化發(fā)生愈傷組織的生物活性。培養(yǎng)10 d時，添加LFS濃度在0.10～2.00 mg/L的處理均與對照(ck)達(dá)到1%極顯著差異水平，并且在LFS濃度為1.50 mg/L時，對愈傷組織的誘導(dǎo)率最高；培養(yǎng)20 d時，所有添加LFS的處理與對照(ck)均達(dá)到1%極顯著差異水平，并且在LFS濃度為1.00 mg/L及以上時誘導(dǎo)率達(dá)到100.0%，添加LFS濃度為1.00 mg/L及以上的3個處理間沒有顯著性差異。

由此可知，LFS作為單一誘導(dǎo)劑，在相同的時間內(nèi)，無論是愈傷組織發(fā)生的快慢，還是效率的高低，都優(yōu)于目前常用的由2,4-D，NAA和BA組成的復(fù)合誘導(dǎo)劑。以添加LFS 1.50 mg/L為例，10 d愈傷組織誘導(dǎo)率即達(dá)48.3%，是ck組(10.1%)的4.8倍；20 d愈傷組織誘導(dǎo)率100%，而ck組只有86.2%。

2.2 LFS對煙草葉片愈傷組織產(chǎn)量和質(zhì)量的影響

表2表明：所有添加LFS的處理都顯著提高了煙草葉片愈傷組織的凈鮮重和轉(zhuǎn)綠率，并且顯著降低了愈傷組織的褐化率、褐化程度及板結(jié)率。在煙草葉片愈傷組織產(chǎn)量和質(zhì)量的各方面，添加LFS的處理與ck處理均達(dá)到5%的顯著差異水平，其中褐化率和板結(jié)率已達(dá)到1%極顯著差異水平，但各處理間在不同性狀方面的具體表現(xiàn)差異各不相同。

在凈鮮重和轉(zhuǎn)綠率方面，添加LFS濃度在0.10～2.00 mg/L的處理均與對照(ck)達(dá)到1%極顯著差異水平，并且在添加LFS濃度為1.50 mg/L時，凈鮮重質(zhì)量最大，但添加LFS濃度為1.50 mg/L的處理與濃度為2.00 mg/L的處理間不存在顯著性差異；而轉(zhuǎn)綠率最高的是添加LFS濃度為1.00 mg/L的處理，LFS濃度為1.00～2.00 mg/L的3個處理間不存在顯著性差異。

在褐化率和板結(jié)率方面，添加LFS的各處理均與對照(ck)達(dá)到1%極顯著差異水平，在添加LFS濃度為1.50 mg/L時，愈傷組織的褐化率和板結(jié)率都最低，并且添加LFS濃度為1.50 mg/L的處理與濃度為2.00 mg/L的處理間不存在顯著性差異。

由此可見，在同樣條件下： 1) LFS誘導(dǎo)煙草葉片愈傷組織的產(chǎn)量高于傳統(tǒng)配方的ck組。如LFS 1.50 mg/L，20 d收獲鮮重8.3 g/瓶，是ck組(1.7 g/瓶)的4.9倍。2) LFS誘導(dǎo)煙草葉片愈傷組織的質(zhì)量優(yōu)于傳統(tǒng)配方的ck組。具體表現(xiàn)在，與ck組相比板結(jié)率和褐化率低，褐化程度輕，而轉(zhuǎn)綠率(即自養(yǎng)能力)卻顯著高于ck組。

表2 不同濃度LFS對煙草葉片愈傷組織產(chǎn)量和質(zhì)量的影響(培養(yǎng)20 d)

凈鮮重(g/瓶)轉(zhuǎn)綠率(%)褐化率(%)褐化程度板結(jié)率(%)ck1.7aA1.5aA53.1fE+++++46.3fFMS+LFS0.052.2bA2.0bA21.2eD+++28.5eEMS+LFS0.103.2cB3.8cB11.7dC++10.5dDMS+LFS0.506.1dC4.6dC9.3cB++6.7cCMS+LFS1.007.6eD5.9eD8.6bB+3.3bBMS+LFS1.508.3fE5.8eD5.2aA+1.7aAMS+LFS2.008.1fDE5.6eD5.3aA+1.7aA

注：ck為MS+2,4-D 0.10+NAA 0.50+BA 0.20。不同小寫字母表示處理間達(dá)到5%的顯著差異水平，大寫字母表示達(dá)到1%極顯著差異水平。

3 結(jié) 論

LFS作為單一誘導(dǎo)劑添加到MS基本培養(yǎng)基中，可以快速、高效地獲得優(yōu)質(zhì)煙草葉片愈傷組織。并且在本次試驗(yàn)條件下，添加LFS濃度為1.50 mg/L時，在培養(yǎng)煙草葉片愈傷組織的各時期的誘導(dǎo)率以及愈傷組織在產(chǎn)量和質(zhì)量的各方面都表現(xiàn)優(yōu)良，是培養(yǎng)煙草葉片愈傷組織時添加LFS的最佳濃度。

[1]余光輝,梅劉娟,余劉卉,等.煙草光能兼養(yǎng)型愈傷組織的誘導(dǎo)和培養(yǎng)條件[J].中南民族大學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2012,31(2):42-44.

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Study on LFS to Induce Callus of Tobacco Leaf

LITingyang1,ZHOUFengjue1,XUHongyuan1,ZHOUWenliang2,GONGYinhua1，LAIHongmin2,CHENNianping1,XIEYunying3,XUHongzhang3

2016-10-27

國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)(2012 ZX 09301002-001-018)；廣西壯族自治區(qū)煙草公司應(yīng)用基礎(chǔ)專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)(桂煙科2012-26號)資助。

李廷洋(1990—)，女，河南南陽人，碩士研究生，研究方向：作物生理與調(diào)控。

許鴻源，E-mail:xuhy08@126.com。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2017.04.126

S 572

A

1001-4705(2017)04-0126-03