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(河南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院， 鄭州 450008)

冬凌草種子檢驗(yàn)規(guī)程研究

楊朝帆，李曉婷，董誠明

(河南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院， 鄭州 450008)

[目的]為了規(guī)范中藥材種子市場，保證中藥材種子的質(zhì)量，制定冬凌草種子檢驗(yàn)規(guī)程。[方法]通過對冬凌草種子扦樣、千粒重、發(fā)芽率、含水量、生活力等常規(guī)指標(biāo)的不同檢測條件及檢測方法進(jìn)行對比分析，找出適合冬凌草種子的檢驗(yàn)方法。[結(jié)果與結(jié)論]制定出冬凌草種子檢驗(yàn)規(guī)程。

冬凌草； 種子質(zhì)量； 檢驗(yàn)規(guī)程

冬凌草為唇形科植物碎米椏(Rabdosiarubescenss(Hemsl.)Hara)的干燥地上部分，在夏、秋二季莖葉茂盛時采割，曬干，具有清熱解毒，活血止痛的功效[1]。種子質(zhì)量是促進(jìn)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展的重要保證，種子檢驗(yàn)是保證種子質(zhì)量的主要手段。中藥材種子的質(zhì)量是提高中藥產(chǎn)品產(chǎn)量、品質(zhì)的基礎(chǔ)。目前，我國可栽培的中藥材品種有200多種，只有少數(shù)品種如柴胡、三七、青蒿等中藥材種子有相應(yīng)的檢驗(yàn)規(guī)程標(biāo)準(zhǔn)，其中大多數(shù)中藥材的種子還沒有相應(yīng)的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn),無法對市場上的中藥材的種子質(zhì)量進(jìn)行檢驗(yàn)以及有效控制。本實(shí)驗(yàn)對冬凌草種子檢驗(yàn)規(guī)程的方法及其各項檢測指標(biāo)進(jìn)行了研究，制定出冬凌草種子檢驗(yàn)規(guī)程。

1 實(shí)驗(yàn)材料

冬凌草是重要的藥用資源之一，主產(chǎn)于我國河南、山西、湖南、湖北、四川、貴州等地。本實(shí)驗(yàn)冬凌草種子來源于河南濟(jì)源棗廟冬凌草規(guī)范化基地資源圃，2015年11月采收2份種子，分別命名為JY 1、JY 2。經(jīng)董誠明教授鑒定為冬凌草種子。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 扦 樣[2]

按照GB/T 3543.2—1995《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行扦樣。

2.2 種子凈度分析[2]

按照GB/T 3543.1—1995《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行凈度分析。

2.3 發(fā)芽測定

2.3.1 吸脹處理

扦樣法分取的冬凌草種子用萬分之一天平稱取約0.5 g，放入蒸餾水中室溫下浸泡，分別在1，2，4，6，8，10，12，24 h時取出用吸水紙吸干表面水分，稱重并記錄，直至恒重，得其最佳吸脹時間。

2.3.2 發(fā)芽溫度的選擇

發(fā)芽溫度：設(shè)定恒溫15，20，25，30，35 ℃等5個溫度處理。在此次實(shí)驗(yàn)中采用通用發(fā)芽床(紙床)，在實(shí)驗(yàn)過程中保持濾紙濕潤，且每天觀察并記錄種子的發(fā)芽率。通過分析、比較選擇最佳的發(fā)芽溫度。

2.3.3 消毒處理

消毒方法：75%乙醇浸泡1 min、2%次氯酸鈉溶液浸泡15 min、1%的高錳酸鉀溶液浸泡15 min 3個處理，每天記錄、觀察各處理種子的發(fā)芽率、霉變率，通過比較、分析選擇最佳的消毒方法。

2.3.4 發(fā)芽床的確定

設(shè)定紙上、紙間、砂土、海綿等4種發(fā)芽床，在最佳吸脹時間、最佳發(fā)芽溫度條件進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)。每天觀察并記錄種子的發(fā)芽率，確定冬凌草種子的最佳發(fā)芽床。

2.3.5 發(fā)芽的首末次計數(shù)時間的確定

在最佳吸脹時間、最佳發(fā)芽溫度、最佳消毒方法、最佳發(fā)芽床的條件下進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，觀察、記錄冬凌草種子每天的發(fā)芽情況，確定冬凌草種子的首末次發(fā)芽時間。

2.4 真實(shí)性鑒定

種子外觀形態(tài)特征是植物最穩(wěn)定的性狀之一，通過對種子表面特征如顏色、大小、形態(tài)等的觀察，可鑒定種子的真實(shí)性。鑒定依據(jù)：冬凌草種子為小堅果，每個果萼中有3～4粒種子，倒卵形，長1.42～1.65 mm；寬1.00～1.10 mm，種皮革質(zhì)，表面光滑無毛色澤為淺棕色至褐色或有白色花紋，種子頂端呈近橢圓形，種子基端(著生種臍的一端)有隆起的種阜，種臍呈疣狀突起，種孔位于種阜尖端，尖端為灰白色，種阜周圍有明顯的暈環(huán)，呈深色，明顯深于種皮顏色，種子飽滿的種皮為白色花紋。

2.5 含水量測定[2]

冬凌草種子水分測定采用高恒溫烘干法測定。按照GB/T 3543.6—1995《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程》水分測定執(zhí)行。

2.6 生活力的測定[2]

按照GB/T 3543.7—1995《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程》其他項目檢測中種子生活力測定執(zhí)行。冬凌草種子生活力測定方法：種子在室溫下用蒸餾水浸泡6 h；將切開的種子置于0.5%四唑溶液中，于30 ℃恒溫染色4 h，迅速用自來水沖洗干凈。根據(jù)種子的染色情況記錄冬凌草種子有、無生活力種子的數(shù)目。

2.7 重量測定

千粒重是衡量種子活力的重要指標(biāo)，也是正確計算種子播種量的必要依據(jù)。按照GB/T 3543.7—1995《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程》其他項目檢驗(yàn)中重量測定執(zhí)行。

2.8 種子健康狀況檢測[4]

按照GB/T 3543.7—1995《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程》其他項目檢測中種子健康度檢查執(zhí)行。

2.8.1 種子外部帶菌檢測

參照淡紅梅[4]的方法檢測種子外部帶菌情況。

2.8.2 種子內(nèi)部帶菌檢測

將預(yù)先處理的種子蒸餾水浸泡1～2 h后，用2%NaClO溶液浸泡15 min后無菌水沖洗3遍，參照淡紅梅[4]的方法進(jìn)行。

由圖8可以看出兩者存在較強(qiáng)的相關(guān)性(經(jīng)計算得其相關(guān)系數(shù)為0.529)。在無法求得重建誤差的情況下,可以用距離誤差估計重建結(jié)果的好壞。

2.8.3 種子帶菌鑒定

將從冬凌草種子外部、內(nèi)部分離到的真菌分別進(jìn)行純化、鏡檢和轉(zhuǎn)管保存。根據(jù)真菌的培養(yǎng)性狀以及形態(tài)特征進(jìn)行鑒定。

3 結(jié)果分析

3.1 扦 樣

冬凌草種子批的最大重量為10 000 kg，種子凈度分析實(shí)驗(yàn)中送檢樣品的最小重量為1.6 g(至少含有2 500粒冬凌草種子)，送檢樣品的重量至少為16 g(應(yīng)超過凈度分析的10倍)。

3.2 凈度分析

種子批中種子包括雜質(zhì)、其他種子及凈種子，種子的增失差都小于5%，則檢驗(yàn)結(jié)果有效，冬凌草種子凈度分析結(jié)果見表1。

表1 冬凌草種子凈度分析結(jié)果

編號雜質(zhì)(%)其它種子(%)凈度(%)增失差(%)JY13.65510.127796.21711.1213JY21.24190.128898.62922.4026

3.3 發(fā)芽率測定

3.3.1 吸脹處理

冬凌草種子質(zhì)量在0～4 h變化比較大，4 h后變化緩慢，6 h后基本不變，可認(rèn)為種子已吸脹飽和，因此選取6 h作為冬凌草種子的最佳吸脹時間。結(jié)果見圖1。

圖1 冬凌草種子吸脹線形圖

3.3.2 發(fā)芽溫度的選擇

冬凌草種子在5個不同溫度(15，20，25，30，35 ℃)下，發(fā)芽差異性較顯著。在前4個溫度(15，20，25，30 ℃)下種子的發(fā)芽率無顯著差異；而在35 ℃溫度下其發(fā)芽率最低，與其它溫度下發(fā)芽率有顯著差異。在25 ℃條件下發(fā)芽率最高達(dá)到95%，始發(fā)芽天數(shù)1 d，且發(fā)芽最整齊，因此選擇25 ℃作為冬凌草種子的最佳發(fā)芽溫度。結(jié)果見表2。

表2 不同發(fā)芽溫度下的發(fā)芽情況

溫度(℃)始發(fā)芽時間(d)平均發(fā)芽率(%)標(biāo)準(zhǔn)差(S)變異系數(shù)(CV)差異顯著性15289.332.51662.8171a20192.671.52751.6484a251951.15471.2506a301922.64572.8758a35165.677.234111.0165ab

3.3.3 發(fā)芽前消毒處理

冬凌草種子在發(fā)芽過程中，易受霉菌的侵染影響發(fā)芽潛力，發(fā)芽前的清潔處理很有必要。發(fā)芽前分別用75%乙醇浸泡1 min、2%次氯酸鈉溶液浸泡15 min、1%的高錳酸鉀溶液浸泡15 min和直接用蒸餾水沖洗，10 d后統(tǒng)計發(fā)芽情況。發(fā)芽情況：75%乙醇溶液效果較差且推遲種子的發(fā)芽時間；1%KMnO4效果比較好；2%次氯酸鈉對抑制種子發(fā)霉效果最佳；水沖洗效果最差?？紤]方便、安全、經(jīng)濟(jì)等多方面因素，選2%次氯酸鈉溶液浸泡15 min作為冬凌草種子最佳消毒處理方法。發(fā)芽情況見表3。

表5 不同染色時間下的染色結(jié)果

染色情況 0.1% 0.3% 0.5% 1.0% 1h2h3h4h1h2h3h4h1h2h3h4h1h2h3h4h完全染色4406004835845661部分染色6234661035242332完全不染色8370445240023110

表3 不同消毒處理對冬凌草種子發(fā)芽率和霉變率的影響

參數(shù)75%乙醇1%KMnO42%NaClO水沖洗始發(fā)芽所需時間(d)211110d后霉?fàn)€率(%)255140消毒效果(%)759599—10d后發(fā)芽效果(%)56768760

3.3.4 發(fā)芽床的選擇

冬凌草種子在不同發(fā)芽床上發(fā)芽率差異并不顯著，而紙上發(fā)芽床發(fā)芽率最高、發(fā)芽整齊、始發(fā)芽時間短、水分保持情況較好且易于操作，因此選擇紙上發(fā)芽床為最佳發(fā)芽床。不同發(fā)芽床發(fā)芽情況見表4。

表4 不同發(fā)芽床對冬凌草種子發(fā)芽率的影響

發(fā)芽床始發(fā)芽時間(d)平均發(fā)芽率(%)標(biāo)準(zhǔn)差(S)變異系數(shù)差異顯著性紙間發(fā)芽床185.332.51662.9492a砂床286.333.78594.3853a海綿床185.331.15471.3532a紙上發(fā)芽床1931.00001.0752a

3.3.5 發(fā)芽的首末次計數(shù)時間

冬凌草種子在第1天時已經(jīng)開始發(fā)芽，到第2天3份樣品的發(fā)芽率均達(dá)到了30%以上，因此可選擇第2天作為冬凌草種子首次發(fā)芽計數(shù)時間；在第5天時發(fā)芽率達(dá)到最高，以后發(fā)芽率不再發(fā)生較大變化，因此建議第6天作為冬凌草種子發(fā)芽末次計數(shù)時間。選擇第2、6天作為冬凌草種子的首末次計數(shù)時間。發(fā)芽時間見圖2。

冬凌草種子發(fā)芽實(shí)驗(yàn)條件：種子先浸泡吸脹6 h，2%次氯酸鈉溶液浸泡15 min消毒，在紙上發(fā)芽床上于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱(12 h光照/12 h黑暗)中培養(yǎng)6 d，發(fā)芽床保持濕潤，第6天記錄發(fā)芽情況，即為發(fā)芽率。

圖2 發(fā)芽首末次計數(shù)時間

3.4 含水量測定

采用高恒溫烘干法測定。冬凌草種子在最初的1 h內(nèi)迅速失水，之后緩慢失水；待種子烘干到4 h以后，種子的含水量基本不變，故選擇烘干時間為4 h。見圖3。

圖3 冬凌草種子失水重量的變化與烘干時間的關(guān)系

3.5 生活力測定

3.5.1 染色濃度和時間

冬凌草種子隨著染色時間和染色濃度的增加，染色效果越好，但是實(shí)際觀察中濃度越大，染色越深，顏色過深不利于觀察判別且濃度越高毒性越大，0.5%的四唑溶液染色4 h效果最好(見表5、圖4)，因此采用0.5%的四唑溶液染色4 h作為冬凌草種子生活力測定的方法。

3.5.2 染色鑒定標(biāo)準(zhǔn)

冬凌草種子生活力鑒定標(biāo)準(zhǔn)[4]：

圖5 冬凌草有活力的種子

圖6 冬凌草無活力的種子

圖4 不同染色時間和染色濃度下的染色情況

有生活力的種子(見圖5)：胚和子葉全部均勻染色(圖5-a)；子葉遠(yuǎn)胚根≤1/3不染色，其余部分完全染色(圖5-b)；子葉側(cè)邊總面積≤1/3不染色，其余部分完全染色(圖5-c、圖5-d)。

無生活力的種子(見圖6)：胚和子葉完全不染色；胚和子葉染色不均勻，其上有斑點(diǎn)狀不染色(圖6-e)；子葉不染色面積占總面積的1/2(圖6-f)；子葉近胚根處或胚根不染色(圖6-g)；胚所染顏色異常，且組織軟腐(圖6-h)。

3.6 重量測定

千粒法測定冬凌草種子千粒重，千粒法2次重復(fù)之間的誤差為1.19%，<5%，結(jié)果有效(見表6)。

表6 冬凌草種子千粒重

編號千粒重(g)標(biāo)準(zhǔn)差(S)兩組重復(fù)之間的誤差范圍(%)10.501420.50400.00301.19

3.7 種子健康狀況

檢測出冬凌草種子所攜帶菌種主要為青霉屬、曲霉屬、毛霉屬、鏈格孢屬、頭孢霉屬等真菌，大部分真菌為空氣中常見菌屬，因此可考慮種子中攜帶菌與其本身生長環(huán)境之間的關(guān)聯(lián)性(見表7、表8)。

表7 種子外部帶菌檢測

編號帶菌率(%)真菌種類和分離比例(%)青霉屬曲霉屬毛霉屬頭孢霉屬其它13.4957.14—28.5714.29—22.4333.2614.2951.43—1.0234.3150.23—46.51—3.26

表8 種子內(nèi)部帶菌檢測

編號帶菌率(%)真菌種類和分離比例(%)毛霉屬青霉屬曲霉屬鏈格孢霉屬其它12.6114.295012.50—5.4822.4225.8149.19—18.756.2533.5839.2443.2517.51——

4 討 論

目前，冬凌草人工引種馴化已取得了初步成功，但關(guān)于其種子特性、種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究報道比較少。孔四新等[3]曾對冬凌草種子質(zhì)量形成的相關(guān)因子、標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)技術(shù)進(jìn)行了研究，但未系統(tǒng)地對冬凌草種子質(zhì)量相關(guān)因子的檢驗(yàn)技術(shù)進(jìn)行篩選和優(yōu)化。

冬凌草種子作為冬凌草植株更新?lián)Q代的有性繁殖體，在中藥材的生產(chǎn)過程中起著重要的作用。由于冬凌草種子成熟期不一致，造成了種子質(zhì)量不均一，在實(shí)際的生產(chǎn)中如不區(qū)分種子的優(yōu)劣而直接播種往往會造

Study on Seed Testing Regulations ofRabdosia

YANGChaofan，LIXiaoting，DONGChengming

2016-11-26

楊朝帆(1992—)，女，河南許昌人；在讀研究生，研究方向：中藥材規(guī)范化種植。

董誠明(1963—)，男，教授，研究方向：中藥材規(guī)范化種值研究；E-mail:dcm371@hactcm.edu.cn。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2017.04.119

S 567

A

1001-4705(2017)04-0119-05