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(1.成都大學(xué)生物產(chǎn)業(yè)學(xué)院， 四川 成都 610016； 2.廣元市璽府開發(fā)有限公司， 四川 廣元 648017)

·種子生產(chǎn)·

山葵愈傷組織誘導(dǎo)的最佳條件篩選

王躍華1，何新友1，劉洪明1，任三軍2，劉鑫1

(1.成都大學(xué)生物產(chǎn)業(yè)學(xué)院， 四川 成都 610016； 2.廣元市璽府開發(fā)有限公司， 四川 廣元 648017)

[目的]獲得誘導(dǎo)山葵愈傷組織的最佳條件。[方法]通過L16(44)正交試驗(yàn)法考察了外植體種類、消毒時(shí)間、培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)溫度等四方面因素對(duì)山葵愈傷組織誘導(dǎo)率的影響。[結(jié)果]試驗(yàn)結(jié)果顯示，各因素與山葵愈傷組織的誘導(dǎo)率密切相關(guān)，影響大小為：外植體種類>培養(yǎng)溫度>培養(yǎng)基配方>消毒時(shí)間。[結(jié)論]誘導(dǎo)山葵愈傷組織的最佳組合為，選擇胚軸為外植體，經(jīng)5 min消毒后接種于MS+2,4-D 1 mg/L+6-BA 0.5 mg/L培養(yǎng)基中，在20 ℃條件下培養(yǎng)25 d，山葵愈傷組織的誘導(dǎo)率可達(dá)100%。

正交試驗(yàn)； 山葵； 愈傷組織

山葵(WasabijaponicaMatsum)為十字花科山崳菜屬多年生草本植物，又名山崳菜，是一種珍稀名貴的香辛蔬菜[1]；目前山葵主產(chǎn)日本、東南亞國(guó)家及港澳臺(tái)地區(qū)，除地區(qū)消費(fèi)外，其產(chǎn)品主要用于出口創(chuàng)匯，市場(chǎng)價(jià)值顯著，極具發(fā)展前景[2]。山葵植物中所含有的異硫氰酸酯類物質(zhì)，具有很好的抗菌、抗癌、抗感染、防腐、抑制血小板凝聚和增進(jìn)食欲等功效[3-5]，具有廣泛的應(yīng)用前景。然而，目前山葵植物資源極其匱乏，一直處于供不應(yīng)求的狀況。這主要是因?yàn)樯娇参锏纳L(zhǎng)對(duì)環(huán)境要求極為苛刻，僅適于在海拔高度為1 000～2 000 m的高山地區(qū)種植，生育溫度超過30 ℃易發(fā)生軟腐病，但低于-3 ℃時(shí)又易受凍害；另外，山葵植物生長(zhǎng)過程中病蟲害也嚴(yán)重,尤其是墨入病的嚴(yán)重危害,極大的影響山葵的產(chǎn)量和質(zhì)量[6-8]。因此，完全靠自然條件下生產(chǎn)山葵植物產(chǎn)量較低，有必要通過組織培養(yǎng)的方式快速生產(chǎn)山葵，以滿足市場(chǎng)的需求。本研究通過對(duì)不同組織培養(yǎng)條件進(jìn)行篩選，獲得山葵愈傷組織誘導(dǎo)的最優(yōu)條件組合。

1 材料和方法

1.1 材 料

山葵種子來源于四川省廣元市，試驗(yàn)材料為山葵種子萌發(fā)幼苗的真葉、子葉、子葉柄和胚軸。

1.2 方 法

本實(shí)驗(yàn)采用L16(44)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法(見表1)。分別取萌發(fā)10 d左右山葵幼苗的子葉、真葉、子葉柄和胚軸為外植體，采用0.1%升汞溶液消毒3，5，7 min和9 min后，接入A 1 (MS+2,4-D 1 mg/L+6-BA 0.5 mg/L)、A 2( MS+2,4-D 2 mg/L+6-BA 0.5 mg/L)、A 3(MS+2,4-D 4 mg/L+6-BA 0.5 mg/L)和A 4(MS+2,4-D 8 mg/L+6-BA 0.5 mg/L)4種不同激素配比的培養(yǎng)基，分別放置在溫度為10，15，20 ℃和30 ℃的條件下培養(yǎng)，各種處理的外植體數(shù)為40個(gè)，進(jìn)行3次重復(fù)，在培養(yǎng)25 d后進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)率的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

表1 L16(44)水平和因素表

水平A消毒時(shí)間(min)B培養(yǎng)基配方C培養(yǎng)溫度(℃)D外植體13A110子葉25A215真葉37A320胚軸49A430子葉柄

1.3 數(shù)據(jù)處理方法

2 結(jié)果與分析

2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

從表2可以看出，本試驗(yàn)的愈傷組織誘導(dǎo)率差異明顯；其中編號(hào)5組合的愈傷組織誘導(dǎo)率最高，即選擇胚軸為外植體，經(jīng)5min消毒后接種于MS+2,4-D 1 mg/L+6-BA 0.5 mg/L培養(yǎng)基中，放于20 ℃條件下培養(yǎng)25 d，愈傷組織誘導(dǎo)率為(100±0.00)%。而編號(hào)7的組合愈傷組織誘導(dǎo)率最低，即以子葉柄為外植體，經(jīng)5 min消毒后接種于接種于MS+2,4-D 4 mg/L+6-BA 0.5 mg/L培養(yǎng)基中，放于10 ℃條件下培養(yǎng)25 d，愈傷組織誘導(dǎo)率僅為(3.24±4.81)%。

表2 山葵正交試驗(yàn)結(jié)果

編號(hào)ABCD誘導(dǎo)率(%)111114.93±1.462122380.43±2.163133267.92±1.34414446.16±5.7352133100±0.00622416.68±2.84723143.24±4.818242231.28±6.539312410.56±5.241032125.87±1.4611334378.19±1.571234319.16±3.6813414215.43±4.501442347.61±2.6515432120.47±4.341644136.35±2.49

注：表中數(shù)據(jù)為25 d統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

通過觀察上述各外植體產(chǎn)生愈傷組織的情況還可發(fā)現(xiàn)，胚軸的愈傷組織最先從接入培養(yǎng)基的游離端開始產(chǎn)生，隨后整個(gè)胚軸都可愈傷化產(chǎn)生出愈傷組織，并且愈傷組織生長(zhǎng)速度快、數(shù)量多、顏色多為黃綠色和淺黃色，質(zhì)地較緊密；子葉柄的愈傷組織最先也是從其接入培養(yǎng)基的游離端開始產(chǎn)生的，但子葉柄在產(chǎn)生愈傷組織的部位先要生產(chǎn)明顯的膨大，隨后表皮出現(xiàn)脹爆開，愈傷組織的產(chǎn)生主要是由子葉柄皮層以內(nèi)細(xì)胞產(chǎn)生的，愈傷組織生長(zhǎng)較慢、數(shù)量也少，顏色淺黃色、質(zhì)地較疏松；真葉的愈傷組織產(chǎn)生最先是從其傷口處產(chǎn)生，隨后在真葉的上下葉片表面也都有愈傷組織長(zhǎng)出，愈傷組織的顏色為綠色和淺綠色，質(zhì)地較緊密；子葉外植體的愈傷組織主要在其傷口處產(chǎn)生，愈傷組織的生長(zhǎng)速度很慢，顏色多為黃色和黃褐色，后期很難再增殖生長(zhǎng)。

2.2 極差分析

極差值在正交試驗(yàn)中表示各因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響程度，且兩者間呈正相關(guān)關(guān)系，即極差值越大，試驗(yàn)因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響越大[9]。為了進(jìn)一步明確各因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，對(duì)表2所示結(jié)果進(jìn)行極差分析(見表3)。結(jié)果顯示，因素A、B、C、D的極差值分別為27.395、29.218、41.075、59.350，可見各因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響大小依次為：外植體種類>培養(yǎng)溫度>培養(yǎng)基配方>消毒時(shí)間。

表3 極差分析

因素ABCDK1159.440130.92020.39041.240K2141.200100.590142.740120.500K3103.780169.820184.690264.970K449.86052.950106.46027.570k139.86032.7305.09810.310k235.30025.14835.68530.125k325.94542.45546.17366.243k412.46513.23826.6156.893R27.39529.21841.07559.350

2.3 方差分析

由表4可以看出，各因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響差異明顯，其中因素D達(dá)到極顯著水平，因素C達(dá)到顯著水平，而因素A、B影響并不顯著；由此可見，山葵愈傷組織誘導(dǎo)過程中，外植體種類與培養(yǎng)溫度是其愈傷組織誘導(dǎo)的關(guān)鍵因素，尤其是外植體種類影響最為顯著，這是由于植物不同器官的細(xì)胞在產(chǎn)生愈傷組織的過程中，必須要完成細(xì)胞的脫分化過程，而山葵植物不同器官的細(xì)胞其脫分化的能力各不相同，因此各外植體的愈傷組織誘導(dǎo)情況各不相同，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，山葵胚軸外植體器官細(xì)胞的脫分化能力最強(qiáng)。

表4 方差分析

因素SS自由度MSFF0.05F0.01顯著性A1755.573585.197.449.2829.46—B1827.093609.037.749.2829.46—C3660.5031220.1715.509.2829.46*D8899.4032966.4737.699.2829.46**

注：“**”表示在0.01水平上差異極顯著；“*”表示在0.05水平上差異顯著。

3 討 論

植物愈傷組織的誘導(dǎo)是組織培養(yǎng)過程中的重要環(huán)節(jié)，通過建立植物的愈傷組織培養(yǎng)體系，還可進(jìn)行細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，并為實(shí)現(xiàn)植物組織細(xì)胞的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。然而，不同植物器官組織要離體培育出愈傷組織，會(huì)受到諸多因素的綜合影響；所以，如何篩選出最佳組合條件誘導(dǎo)山葵愈傷組織產(chǎn)生就顯得尤為重要。王安虎等[10]、張建佳等[11]和王建美等[12]曾對(duì)山葵愈傷組織的誘導(dǎo)條件進(jìn)行了一些單因素研究，而本實(shí)驗(yàn)利用正交試驗(yàn)的方法，突破了傳統(tǒng)單一變量篩選法的諸多缺點(diǎn)，一次性綜合分析研究了影響山葵愈傷組織誘導(dǎo)的4個(gè)因素即外植體種類、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)基配方及外植體消毒時(shí)間，探明了不同因素的影響大小并在此基礎(chǔ)上篩選出了誘導(dǎo)山葵愈傷組織培養(yǎng)的最佳組合，為進(jìn)一步開展山葵細(xì)胞大規(guī)模的工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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Screening the Best Conditions ofWasabiCallus Induction

WANGYuehua1，HEXinyou1，LIUHongming1，RENSanjun2，LIUXin1

2016-10-19

成都市科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2015-NY 02-00148-NC)。

王躍華(1963—)，女，教授，主要從事藥用植物栽培與生藥學(xué)研究；E-mail:1961689636@qq.com。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2017.04.124

S 567.23+9

A

1001-4705(2017)04-0124-03