穆曉紅，高 健，劉銅華，秦靈靈，孫 文，吳麗麗，李偉笠，鄧博文，李筱葉

(1.北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院，北京100700;2.對外經(jīng)濟貿(mào)易大學，北京100023;3.北京中醫(yī)藥大學，北京100029)

糖痹康對糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠坐骨神經(jīng)PERK-Nrf2信號通路的影響*

穆曉紅1，高 健2，劉銅華3，秦靈靈3，孫 文3，吳麗麗3，李偉笠3，鄧博文3，李筱葉3

(1.北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院，北京100700;2.對外經(jīng)濟貿(mào)易大學，北京100023;3.北京中醫(yī)藥大學，北京100029)

目的:觀察糖痹康對糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)中PERKNrf2信號通路的影響。方法:將雄性SD大鼠采用STZ法造模，成功后隨機分為模型對照組，彌可保組，糖痹康高、中、低劑量組，另選正常SD大鼠為正常對照組。彌可保組腹腔注射彌可保0.026 8g/(kg·d);糖痹康高、中、低劑量組依次灌胃糖痹康16.700，8.350，4.175 g/(kg·d)。所有藥物均以9 g/L生理鹽水配制，給藥量為0.01 mL/g體質量。模型對照組和正常對照組均予等量的生理鹽水灌胃，1 d 1次，連續(xù)16周。剖取大鼠坐骨神經(jīng)，Western blot檢測坐骨神經(jīng)中磷酸化的蛋白激酶樣內質網(wǎng)激酶(PERK)、轉錄因子NF-E2相關因子2(Nrf2);Real-time PCR檢測坐骨神經(jīng)中血紅素加氧酶-1(HO-1)、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)mRNA 表達。結果:與正常對照組對比，模型對照組大鼠坐骨神經(jīng)PERK、Nrf2蛋白表達顯著降低，HO-1、γ-GCS mRNA表達顯著降低，差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。與模型對照組對比，彌可保組和糖痹康高、中、低劑量組大鼠坐骨神經(jīng)PERK、Nrf2蛋白表達顯著升高，HO-1、γ-GCS mRNA表達顯著升高，差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。結論:糖痹康通過上調PERK-Nrf2信號通路表達，發(fā)揮抗氧化作用，延緩糖尿病周圍神經(jīng)病變進展。

糖痹康/藥效學;糖尿病周圍神經(jīng)病變;磷酸化的蛋白激酶樣內質網(wǎng)激酶(p-PERK);轉錄因子NF-E2相關因子2(Nrf2);血紅素加氧酶-1(HO-1);γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS);動物;大鼠

糖尿病周圍神經(jīng)病變(diabetic peripheral neuropathy，DPN)是糖尿病患者常見并發(fā)癥，常導致感覺神經(jīng)、運動神經(jīng)損傷，出現(xiàn)肢體麻木、疼痛、肌肉無力及萎縮等癥狀。研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)病變與氧化應激關系密切［1-3］，其中磷酸化的蛋白激酶樣內質網(wǎng)激酶(PERK)—轉錄因子NF-E2相關因子2(Nrf2)信號通路對高糖環(huán)境下活性氧的產(chǎn)生有抑制作用，能夠改善抗氧化應激損傷［4］，在DPN的防治中發(fā)揮重要作用。血紅素加氧酶-1(HO-1)、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)是PERK-Nrf2信號通路調節(jié)的抗氧化蛋白，同樣參與抗氧化應激作用［5］。糖痹康由黃芪、女貞子、桂枝、赤芍、黃芩、黃連、水蛭等組成，是在《金匱要略》黃芪桂枝五物湯基礎上根據(jù)臨床經(jīng)驗加減化裁而成，已獲發(fā)明專利(專利申請?zhí)?200810167551.1)。前期研究［6-8］發(fā)現(xiàn):糖痹康能夠改善DPN大鼠神經(jīng)傳導速度、調節(jié)大鼠血清及坐骨神經(jīng)中神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)含量和表達、抑制神經(jīng)細胞凋亡等發(fā)揮抗氧化應激的作用。本研究建立DPN大鼠模型并以糖痹康進行干預，研究PERK-Nrf2及其下游基因 HO-1、γ-GCS的表達，以探討糖痹康對DPN的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動 物

SPF級雄性健康SD大鼠80只，6～7周齡，體質量180～230 g，購自北京維通利華動物實驗中心，動物許可證號:SCXK(京)2006-0009。大鼠飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學實驗動物中心SPF級動物實驗室，溫度(23±2)℃、濕度(55±10)%，12/12 h光照、黑暗循環(huán)，自由攝食、飲水。

1.2 藥品、試劑與儀器

糖痹康顆粒處方組成:黃芪、女貞子、桂枝、赤芍、黃芩、黃連、水蛭等，顆粒劑由北京中醫(yī)藥大學中藥學院提取、制備;彌可保(a-硫辛酸)，購自衛(wèi)材藥業(yè)有限公司，批號141003;鏈脲佐菌素(STZ)，美國Sigma公司產(chǎn)品，批號S0130;高脂飼料(基礎飼料65.75%、蔗糖20%、豬油10%、蛋黃粉3%、膽固醇1%、豬膽鹽0.25%)，北京科奧協(xié)力飼料有限公司產(chǎn)品;Trizol試劑盒，購自Life Technologies公司，批號98903;I抗 Nrf2 Rabbit mAb(貨號 12721)、Phospho-PERK Rabbit mAb(貨號3179)、Ⅱ抗Anti-rabbit IgG(H+L)(貨號14708)，均為 CST公司產(chǎn)品;THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix，日本 TOYOBO 公司產(chǎn)品，貨號QPS-201;ECL發(fā)光液，購自美國BIORAD公司，批號170-5060。E9032型酶標儀，美國Promega公司產(chǎn)品;Prism 7 500型PCR擴增儀，美國ABI公司產(chǎn)品;BX53型光學顯微鏡，日本Olympus公司產(chǎn)品;Mini-PROTEAN Tera System型垂直電泳儀、轉移槽，美國Bio-Rad公司產(chǎn)品;ChemiDocTM XRS+with Image LabTM Software凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.3 模型的建立、分組與給藥

將雄性SD大鼠適應性喂養(yǎng)1周，按體質量隨機取10只作為正常對照組，以普通飼料喂養(yǎng);其余大鼠以高脂飼料喂養(yǎng)8周后，禁食不禁水過夜，次日腹腔注射STZ 45 μg/g造模，72 h后用血糖儀測尾尖血血糖，血糖水平持續(xù)≥16.7 mmol/L且穩(wěn)定3 d者為造模成功［7］。將造模成功的大鼠按體質量、血糖隨機分為模型對照組，彌可保組，糖痹康高、中、低劑量組5組，每組10只。各組大鼠按體表面積法換算給藥劑量:彌可保組腹腔注射彌可保0.026 8 g/(kg·d);糖痹康高、中、低劑量組依次灌胃糖痹康16.700 0，8.350 0，4.175 0 g/(kg·d)。所有藥物均以 9 g/L生理鹽水配制，給藥量為0.01 mL/g體質量，模型對照組和正常對照組均予等量的生理鹽水灌胃，1 d 1次，連續(xù)16周。

1.4 檢測指標

連續(xù)給藥16周后，禁食不禁水12 h，根據(jù)大鼠體質量，按350 μg/g的劑量腹腔注射100 g/L水合氯醛麻醉，腹主動脈取血，處死大鼠，迅速剖取大鼠兩側坐骨神經(jīng)并以液氮凍存，待用。

1.4.1 大鼠坐骨神經(jīng)中PERK、Nrf2蛋白表達

以Western blot測定。取凍存的大鼠坐骨神經(jīng)，按RIPA試劑盒步驟提取總蛋白，加上樣緩沖液，100℃ 5 min 蛋白變性;上樣 20 μg/孔，10%SDSPAGE凝膠跑電泳，100V 2 h;半干法凝膠轉膜100 A 1 h;TBS溶液室溫洗膜15 min;Blocking one/Blocking one-P封閉30 min，I抗(1∶1 000稀釋)孵育，4℃ 過夜;洗膜后II抗(1∶10 000稀釋)孵育，室溫1 h;洗膜后，ECL發(fā)光液室溫反應1 min，凝膠成像系統(tǒng)成像，以Image J 7.0分析蛋白條帶。

1.4.2 坐骨神經(jīng)中 HO-1、γGCS mRNA 表達

以Real-time PCR測定。取凍存的大鼠坐骨神經(jīng)，Trizol提取總RNA;GoScriptTMReverse Transcription System試劑盒反轉錄，退火25℃ 5min，延伸42℃ 1 h，滅活 70℃ 15 min，得到 cDNA。配制20 μL反應體系:2 μL cDNA 稀釋液 +10 μL GoTaq反應液 +7.2 μL Nuclease-Free Water+0.8μL 引物混合，Applied Biosystems 7500 Real Time PCR System擴增，條件:95℃ 10 min;95℃ 15 s，60℃1 min(共40次循環(huán));95℃ 15s，60℃ 15 s溶解。結果采用2-△△CT相對定量法比較各組目標mRNA表達差異。引物見表1。

表1 引物

1.5 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 各組大鼠坐骨神經(jīng)PERK、Nrf2蛋白表達對比

與正常對照組對比，模型對照組大鼠坐骨神經(jīng)PERK、Nrf2蛋白表達顯著降低，差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。與模型對照組對比，各給藥組PERK、Nrf2蛋白表達顯著升高，差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表2、圖1。

表2 各組大鼠坐骨神經(jīng)PERK、Nrf2蛋白表達對比n=10±s

表2 各組大鼠坐骨神經(jīng)PERK、Nrf2蛋白表達對比n=10±s

注:與正常對照組對比，*P＜0.05;與模型對照組對比，#P＜0.05

分組 劑量/(g·kg－1·d －1)PERK/β-actin Nrf2/β-actin正常對照組 —0.86 ±0.13 0.80 ±0.04模型對照組 — 0.37±0.06* 0.28±0.11*彌可保組 0.026 8 0.82 ±0.17# 0.78 ±0.07#糖痹康高劑量組 16.700 0 0.94 ±0.10# 0.98 ±0.14#糖痹康中劑量組 8.350 0 0.76 ±0.07# 0.85 ±0.15#糖痹康低劑量組 4.175 0 0.70 ±0.12# 0.80 ±0.10#

圖1 各組大鼠坐骨神經(jīng)PERK、Nrf2蛋白條帶

2.2 各組大鼠坐骨神經(jīng)HO-1、γGCS mRNA表達對比

與正常對照組對比，模型對照組大鼠坐骨神經(jīng)HO-1、γGCS mRNA表達顯著降低，差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。與模型對照組對比，各給藥組HO-1、γGCS mRNA表達顯著升高，差別有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)。結果見表3。

表3 各組大鼠坐骨神經(jīng)HO-1、γGCS mRNA表達對比n=10，±s

表3 各組大鼠坐骨神經(jīng)HO-1、γGCS mRNA表達對比n=10，±s

注:與正常對照組對比，*P＜0.05;與模型對照組對比，#P＜0.05

分組 劑量/(g·kg－1·d －1) HO-1 γGCS正常對照組 —0.96 ±0.06 0.98 ±0.02模型對照組 — 0.66±0.11* 0.72±0.15*彌可保組 0.026 8 1.01 ±0.10# 1.13 ±0.10#糖痹康高劑量組 16.700 0 1.45 ±0.17# 1.25 ±0.10#糖痹康中劑量組 8.350 0 1.17 ±0.13# 1.12 ±0.06#糖痹康低劑量組 4.175 0 1.13 ±0.08# 1.04 ±0.12#

3 討論

氧化應激是機體氧自由基生成和(或)消除能力之間的不平衡，出現(xiàn)活性氧簇(ROS)增加與抗氧化清除減弱，最終導致?lián)p傷組織細胞、蛋白的過程［9］。研究表明，高糖狀態(tài)下機體多條旁路代謝途徑激活，引起細胞內產(chǎn)生過多ROS，誘導氧化應激發(fā)生［10］。因此，氧化應激在在糖尿病發(fā)展中至關重要。據(jù)糖尿病并發(fā)癥的統(tǒng)一機制學說，DPN發(fā)病核心是高糖引起線粒體中ROS生成過多，引發(fā)組織細胞發(fā)生氧化應激，導致DNA損傷，引起周圍血管、神經(jīng)病變，出現(xiàn)血流變異常，神經(jīng)傳導速度減低以及病理改變等，最終導致 DPN［11］。

PERK作為內質網(wǎng)上跨膜蛋白之一，正常情況下發(fā)生磷酸化而被激活，激活后的PERK能夠激活Nrf2，活化后的Nrf2進入細胞核內與小Maf蛋白結合調控基因轉錄，包括 HO-1、γGCS［12－13］。PERKNrf2是重要的抗氧化應激通路，在延緩糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)展中發(fā)揮重要作用。研究表明，DPN患者存在氧化應激導致體內ROS產(chǎn)生過多，各種抗氧化物質如 HO-1、γGCS 等降低，抗氧化能力下降［14］。PERK-Nrf2信號通路激活可降低DPN患者ROS的產(chǎn)生，同時調控抗氧化基因HO-1、γGCS的轉錄，而HO-1、γGCS能夠啟動機體抗氧化系統(tǒng)，清除自由基起到保護細胞的作用［15－16］。本研究結果顯示:模型對照組大鼠坐骨神經(jīng)內PERK、Nrf2蛋白表達與HO-1、γGCS mRNA表達均較正常大鼠顯著降低，而經(jīng)過糖痹康治療后，此4個指標表達均顯著升高，表明糖痹康對PERK-Nrf2信號通路及其下游分子HO-1、γGCS的表達具有調控作用。

中醫(yī)學認為DPN屬于“痹癥”“痿證”等范疇，是氣陰兩虛基礎上導致久病入絡、脈絡瘀阻、氣血運行阻滯的過程，治療上應以益氣養(yǎng)陰、化瘀通絡為法［17］。糖痹康方中黃芪、女貞子益氣養(yǎng)陰，黃芩、黃連清熱解毒，赤芍、水蛭活血化瘀通絡，桂枝通脈。全方共奏益氣養(yǎng)陰清熱、化瘀通絡之效。本實驗結果提示:糖痹康通過調控調PERK-Nrf2信號通路及其下游分子HO-1、γGCS的表達而抵抗活躍氧化應激，從而改善神經(jīng)細胞功能來狀態(tài)，進而起到了神經(jīng)保護作用。

［1］安春耀，劉德山.晚期糖基化終末產(chǎn)物與糖尿病周圍神經(jīng)病變關系新進展［J］.醫(yī)學綜述，2017，23(15):3062－3067.

［2］饒瀟瀟，姚廣濤，文小平.中藥干預糖尿病周圍神經(jīng)病變作用機制研究進展［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2017，24(4):130－133.

［3］秦保鋒，朱旭瑩，翁偉力，章麗瓊，張紅智，郭詠梅.黃芪桂枝五物湯對糖尿病周圍神經(jīng)病變患者血清谷胱甘肽過氧化物酶活性的影響［J］.上海中醫(yī)藥大學學報，2017，31(2):36 －39.

［4］YANG X，YAO W，LIU H，et al.Tangluoning，a traditional Chinese medicine，attenuates in vivo and in vitro diabetic peripheral neuropathy through modulation of PERK/Nrf2 pathway［J］.Sci Rep，2017，7(1):1014.

［5］姚偉潔，楊鑫偉，李情琴，等.糖絡寧對糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠Nrf2/ARE通路的影響［J］.北京中醫(yī)藥，2016，35(3):218 －221，289.

［6］易文明，孫文，郭翔宇，等.糖痹康對糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠氧化應激及細胞凋亡的影響［J］.環(huán)球中醫(yī)藥，2015，8(7):798 －802.

［7］張巖，穆曉紅，孫文，等.糖痹康對糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)Keap1/Nrf2信號的作用機制［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2016，31(5):1822 －1827.

［8］呂翠巖，張勝容，徐暾海，等.中藥復方糖痹康改善氧化應激的分子機制探討［J］.中華中醫(yī)藥學刊，2016，34(3):529－531.

［9］ZHAI CM，JIA BY，WANG ZB，et al.Nrf2-NF-κB pathway axes，epigenetic regulation and traditional Chinese medicine(natural medicine)to treat type 2 diabetes［J］.Zhongguo Zhong Yao Za Zhi，2016 ，41(23):4314 －4319.

［10］COUDRIETGM， DELMASTRO-GREENWOODMM，PREVITE DM，et al.Treatment with a Catalytic Superoxide Dismutase(SOD)Mimetic Improves Liver Steatosis，Insulin Sensitivity，and Inflammation in Obesity-Induced Type 2 Diabetes［J］.Antioxidants(Basel)，2017 ，6(4):E85

［11］JI ZH，LIU ZJ，LIU ZT，et al.Diphenyleneiodonium Mitigates Bupivacaine-Induced Sciatic Nerve Damage in a Diabetic Neuropathy Rat Model by Attenuating Oxidative Stress［J］.Anesth Analg，2017 ，125(2):653 －661.

［12］YANG X，YAO W，LIU H，et al.Tangluoning，a traditional Chinese medicine，attenuates in vivo and in vitro diabetic peripheral neuropathy through modulation of PERK/Nrf2 pathway［J］.Sci Rep，2017，7(1):1014.

［13］SZTANEK F，MOLNRN MOLNR ，BALOGH Z.The role of oxidative stress in the development of diabetic neuropathy［J］.Orv Hetil，2016 ，157(49):1939 －1946.

［14］MCDONNELL C，LENEZ S，POL O.The induction of the transcription factor Nrf2 enhances the antinociceptive effects of delta-opioid receptors in diabetic mice［J］.PLoS One，2017，12(7):e0180998.

［15］THIPKAEW C，WATTANATHORN J，MUCHIMAPURA S.Electrospun Nanofibers Loaded with Quercetin Promote the Recovery of Focal Entrapment Neuropathy in a Rat Model of Streptozotocin-Induced Diabetes［J］.Biomed Res Int，2017，2017:2017493.

［16］SHI Y，LIANG XC，ZHANG H，et al.Combination of quercetin，cinnamaldehyde and hirudin protects rat dorsal root ganglion neurons against high glucose-induced injury through Nrf-2/HO-1 activation and NF-κB inhibition［J］.Chin J Integr Med，2017 ，23(9):663－671.

［17］方朝暉，吳以嶺，趙進東.糖尿病周圍神經(jīng)病變中醫(yī)臨床診療指南(2016年版)［J］.中醫(yī)雜志，2017，58(7):625－630.

R573.1

B

10.3969/j.issn.1001 －6910.2017.11.32

1001－6910(2017)11－0070－04

劉銅華，北京中醫(yī)藥大學，教授，thliu@vip.163.com

國家自然基金項目(81202970);教育部新世紀人才項目(NCET－12－0805)

2017－10－19;

2017－11－16(編輯 陶 珠)