孫佳悅，錢 方，姜淑娟，妥彥峰，牟光慶,2,*

（1.大連工業(yè)大學食品學院，遼寧 大連 116034；2.東北農(nóng)業(yè)大學，食品安全與營養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，黑龍江 哈爾濱 150030）

基于紅外光譜分析熱處理對牛乳蛋白質二級結構的影響

孫佳悅1，錢 方1，姜淑娟1，妥彥峰1，牟光慶1,2,*

（1.大連工業(yè)大學食品學院，遼寧 大連 116034；2.東北農(nóng)業(yè)大學，食品安全與營養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，黑龍江 哈爾濱 150030）

運用傅里葉變換紅外光譜技術對乳蛋白及其酰胺Ⅰ帶進行解析，進一步用紅外解譜法對其二級結構進行表征。以原料乳為對照，研究65 ℃/30 min（低溫長時巴氏殺菌）、80 ℃/15 s（高溫短時巴氏殺菌）、95 ℃/5 min（酸乳熱處理）、137 ℃/5 s（超高溫滅菌）等不同熱處理條件對乳中蛋白質二級結構的影響。結果表明，熱處理會導致乳蛋白間發(fā)生相互作用，乳蛋白原空間結構受到破壞，導致分子內氫鍵被破壞。不同熱處理程度的乳蛋白酰胺Ⅰ帶均向低波數(shù)方向發(fā)生了不同程度的紅移，表明乳蛋白變性過程中疏水氨基酸殘基暴露形成分子間氫鍵。同時熱處理后乳蛋白各二級結構比例發(fā)生明顯改變。α-螺旋含量顯著降低（p＜0.05），無規(guī)卷曲含量顯著升高（p＜0.05），β-轉角及β-折疊含量在加熱過程均呈先增加后減少變化趨勢，表明熱處理程度增強導致部分有序結構向無規(guī)卷曲結構轉化，蛋白質熱變性后會發(fā)生熱聚集現(xiàn)象，且β-折疊、β-轉角結構在熱聚集體的形成過程中具有重要作用。

傅里葉變換紅外光譜；熱處理；乳蛋白；熱聚集；二級結構

熱處理是乳品加工的重要環(huán)節(jié)，能保證產(chǎn)品保質期和安全性，影響乳制品加工性能。牛乳蛋白是人體優(yōu)質的食物蛋白來源，不僅能為生命成長和維持提供物質基礎，還由于其理化性質的獨特性賦予乳品各種功能特性。乳蛋白主要包括酪蛋白膠束（αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白）和乳清蛋白（β-乳球蛋白和α-乳白蛋白）。熱處理導致變性乳清蛋白除相互聚集外，還與酪蛋白膠束發(fā)生不可逆的結合[1]。目前人們普遍認為，在熱誘導乳蛋白變性并發(fā)生聚集過程中，非共價作用（疏水作用力和鹽鍵作用）及巰基和二硫鍵的交換反應起到了重要作用，但熱處理導致乳蛋白空間結構變化才是造成牛乳理化和功能特性改變的內在原因[2]。因此，研究不同程度熱處理導致的乳蛋白二級結構變化，對明確熱處理時乳蛋白間熱聚合反應的過程及機理具有重要意義。

分析蛋白質二級結構常用X射線衍射、圓二色譜（circular dichroism，CD）、核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）、傅里葉變換紅外光譜（Fourier transformation infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR）等方法。其中X射線衍射需獲得合格的單晶體，而牛乳體系復雜很難獲得；CD僅對測定α-螺旋含量較多單一體系的蛋白質二級結構較為準確[3]；NMR只能測定小分子蛋白質結構[4]。比較而言FT-IR具有分辨率高、測定所需樣品少、操作簡便、測量速度快等優(yōu)點，廣泛用于定性定量分析不同環(huán)境狀態(tài)下蛋白質的二級結構[5]。O’Loughlin等[6]認為FT-IR可準確有效地對熱處理時蛋白質的變化機理進行分析。目前，關于熱處理對乳蛋白結構影響的研究鮮有報道。本實驗基于FT-IR法，研究不同熱處理程度導致的牛乳中蛋白質二級結構的差異性，旨在探討不同熱處理方式對乳蛋白結構的影響，為進一步研究熱處理乳品質的變化提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料乳采集于大連三寰乳業(yè)有限公司。

1.2 儀器與設備

Spectrum 10型FT-IR儀 上海鉑金埃爾默儀器有限公司；PL303型電子分析天平 梅特勒-托利多（上海）儀器有限公司；Z326K型冷凍離心機 德國Hermle公司；SL-Ⅱ型層析實驗冷柜 寧波新芝生物科技股份有限公司；FD-1C-50型冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牛乳熱處理

選用65 ℃/30 min（低溫長時殺菌）、80 ℃/15 s（高溫短時殺菌）、95 ℃/5 min（酸乳熱處理）、137 ℃/5 s（超高溫瞬時滅菌）4 種乳品加工常用的熱處理方法[7]對原料乳進行處理，熱處理后的乳樣于4 ℃冷藏。

1.3.2 乳蛋白制備

不同熱處理后的乳樣4 ℃、10 000 r/min離心10 min，棄上層脂肪，收集下層蛋白溶液[8]。于-20 ℃冷凍后，冷凍干燥呈粉末狀備用。

1.3.3 乳蛋白FT-IR分析

(6) 響應電流法是檢測開關開通和關斷時母線電流的值,而端電壓法需要計算開關管開通和關斷時非導通相端電壓的差值,比較導通兩相自感的大小來判斷轉子位置。

KBr壓片法制樣[9]：將乳蛋白樣品與一定量KBr用研缽充分研磨成均勻粉末，壓制成薄片。進行全波段掃描（4 000～400 cm-1），掃描次數(shù)為32 次，分辨率4 cm-1，每個樣品做3 次平行實驗。

1.3.4 FT-IR譜圖處理

用Omnic 8.2軟件進行譜圖采集、標峰、基礎紅外光譜圖解析。用Peakfit Version 4.12軟件在譜帶范圍內（酰胺Ⅰ帶1 700～1 600 cm-1）進行基線校正，并經(jīng)Savitsk-Golay函數(shù)平滑，去卷積處理，在二階導數(shù)譜圖基礎上用高斯曲線擬合[10]，估算出子峰的個數(shù)和位置，調整各子峰的峰高和半峰寬，計算機多次擬合使殘差最?。≧2≥0.999），確保重疊譜帶可完全分辨[11]。確定各子峰與各個二級結構單元的對應關系后，根據(jù)峰面積計算各二級結構組分的相對百分含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

以上所有實驗均至少重復3 次，結果以 ±s表示，并用IBM SPSS Statistics v20.0.0軟件，在α＝0.05水平用ANOVA分析方法進行數(shù)據(jù)顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 不同熱處理的乳蛋白FT-IR譜圖

表1 原料乳中乳蛋白FT-IR譜圖的各譜帶特性[12-13]Table 1 Characteristic absorption peaks in FT-IR spectra of milk proteins in raw milk[12-13]

表1為原料乳中乳蛋白FT-IR譜圖的各譜帶范圍和其特征吸收峰，以及相對應的化學結構表征信息。圖1整體上看，與原料乳的乳蛋白（未處理）相比，不同程度熱處理乳蛋白FT-IR譜圖譜型無較大差異。游離態(tài)O—H的特征振動吸收為3 600～3 500 cm-1，當形成分子內或分子間氫鍵時，羥基的吸收峰向低波數(shù)移動，且與N—H的振動吸收峰重疊而峰形變寬[14]。乳蛋白FT-IR譜圖中于3 400 cm-1左右呈現(xiàn)寬而強的吸收峰，表明乳蛋白分子多聚體中可能存在大量分子內或分子間氫鍵[15]。

圖1 不同熱處理條件下乳蛋白的FT-IR譜圖Fig. 1 FT-IR spectra of milk protein samples subjected to various heat treatment conditions

圖2 137 ℃/5 s熱處理不同質量濃度乳蛋白的FT-IR譜圖Fig. 2 FT-IR spectra of different concentrations of milk protein samples heated at 137 ℃ for 5 s

由于分子間氫鍵與溶液的濃度和性質有關，峰位隨濃度改變而移動，但分子內氫鍵不受溶液濃度影響[16]。因此將137 ℃/5 s熱處理的1.00、0.10、0.01 mg/mL的乳蛋白溶液與10.0 mg/mL乳蛋白溶液的FT-IR譜圖進行對比分析。從圖2可見，熱處理乳蛋白的O—H吸收峰的峰位不受溶液質量濃度改變的影響，保持在3 425 cm-1附近，表明該吸收峰代表乳蛋白分子內氫鍵的作用[17]。結合圖1可見，隨著熱處理程度的增加該峰位向高波數(shù)移動，即從3 418.72 cm-1位移至3 425.28 cm-1，說明熱處理直接影響乳蛋白原空間結構，熱變性過程中維持乳蛋白結構的分子內氫鍵被破壞。

圖3 不同熱處理條件下乳蛋白酰胺Ⅰ帶FT-IR譜圖Fig. 3 FI-IR spectra of amide Ⅰ of milk protein samples subjected to various heat treatment conditions

同時，圖1中乳蛋白的酰胺Ⅰ帶（1 700～1 600 cm-1）信號較強，由羰基（C＝O）鍵伸縮振動產(chǎn)生[18]，其峰型受蛋白質特定二級結構影響。結合圖3酰胺Ⅰ帶的峰形可更清楚地看出，熱處理強度增強，峰形由尖銳趨于平緩。從峰位變化分析，原料乳中乳蛋白（未處理）酰胺Ⅰ帶為1 655.82 cm-1。熱處理后其酰胺Ⅰ帶向低波數(shù)方向發(fā)生了不同程度的位移：65 ℃/30 min和80 ℃/15 s熱處理乳蛋白質的酰胺Ⅰ帶向低波數(shù)方向紅移約1 cm-1，即從1 655.82 cm-1分別移至1 654.43 cm-1和1 654.16 cm-1；137 ℃/5 s熱處理乳蛋白的酰胺Ⅰ帶向低波數(shù)方向紅移約7 cm-1，即從1 655.82 cm-1位移至1 648.66 cm-1。說明乳蛋白具有熱不穩(wěn)定性，熱變性過程中隨著其球狀折疊結構的展開，游離氨基酸殘基間形成分子間氫鍵[19]。當氫鍵作用較強時C＝O的電子云密度降低，導致吸收峰位向低波數(shù)方向移動[20]。

2.2 不同熱處理乳蛋白酰胺Ⅰ帶的擬合

蛋白質二級結構包括α-螺旋、β-折疊、β-轉角、無規(guī)卷曲等[21]。不同二級結構信息均疊加在酰胺Ⅰ帶，而酰胺Ⅰ帶的二階導數(shù)譜圖卻保留吸收峰的積分面積，對譜圖進行多次曲線擬合可確定各子峰與各二級結構對應關系[22]，再根據(jù)積分面積計算各二級結構的相對百分含量。酰胺Ⅰ帶各峰位為：1 615～1 637 cm-1和1 682～1 700 cm-1為β-折疊特征峰；1 646～1 664 cm-1為α-螺旋特征峰；1 637～1 645 cm-1為無規(guī)卷曲特征峰；1 664～1 681 cm-1為β-轉角特征峰[23]。

圖 4 不同熱處理條件下乳蛋白酰胺Ⅰ帶高斯曲線擬合圖Fig. 4 Gaussian curve fi tting of amide Ⅰ of milk proteins subjected to different heat treatment conditions

表2 不同熱處理乳蛋白質二級結構的含量Table 2 Estimated secondary structures of milk protein subjected to different heat treatment conditions

圖4為未處理（原料乳中乳蛋白）及4 種熱處理的乳蛋白酰胺Ⅰ帶經(jīng)去卷積和二階導數(shù)技術處理后，疊加峰分解為各子峰的高斯曲線擬合圖。結合表2可知，對比原料乳的乳蛋白，4 種熱處理牛乳中乳蛋白二級結構發(fā)生如下變化：1）原料乳的乳蛋白二級結構主要組成為α-螺旋，占總量34.3%。α-螺旋經(jīng)137 ℃/5 s熱處理后含量顯著降低（p＜0.05）。α-螺旋是蛋白質二級結構中最穩(wěn)定的，隨著熱處理程度增大，蛋白的結構穩(wěn)定性下降，乳蛋白熱變性導致α-螺旋中的氫鍵逐漸斷裂，發(fā)生解螺旋。2）隨著溫度的升高，無規(guī)卷曲含量逐漸升高，137 ℃/5 s熱處理的乳蛋白中無規(guī)卷曲含量為30.5%，明顯高于原料乳蛋白的14.8%（p＜0.05）。表明熱處理導致蛋白二級結構部分被破壞，結構的隨機性增強。隨著熱處理程度的增強，乳蛋白部分有序結構逐漸向無規(guī)卷曲結構轉化[24]。3）相比于原料乳的乳蛋白，熱處理的乳蛋白中β-折疊和β-轉角含量在加熱過程中呈先增加后降低趨勢。這種變化趨勢與乳蛋白的變性及逐漸形成聚集體有關。乳蛋白中熱穩(wěn)定性較差的一種蛋白是β-乳球蛋白，60 ℃以上的熱處理主要使β-乳球蛋白熱變性并促進分子間的聚集[25]。β-折疊結構常見于蛋白質內部折疊區(qū)域，且β-折疊結構的含量增加與β-乳球蛋白熱變性有關[26-27]。加熱程度繼續(xù)增強，α-乳白蛋白也開始變性，進一步與β-乳球蛋白聚集體形成更大的熱聚合物[28]。此外乳蛋白熱變性后的聚集現(xiàn)象也可能導致β-折疊結構含量減少。對于137 ℃/5 s熱處理乳蛋白，其β-折疊結構顯著降低（p＜0.05），主要原因為100 ℃以上熱處理會導致酪蛋白膠束內部疏水基團暴露[29]，使酪蛋白膠束表面疏水作用力增強。由于熱處理形成熱聚集體，分子間的β-折疊結構易轉變?yōu)棣?轉角結構，同時部分β-轉角結構還會向無規(guī)卷曲結構轉變[30]。因而可以推斷不同熱處理過程中β-折疊、β-轉角結構在熱聚集體的形成過程中具有重要作用。

3 結 論

利用FT-IR技術分析表明，熱處理破壞乳蛋白原空間結構，熱變性過程中維持乳蛋白結構的分子內氫鍵被破壞。同時熱處理會導致乳蛋白間發(fā)生相互作用，形成熱變性乳蛋白聚合物。

熱處理后乳蛋白的FT-IR光譜圖中酰胺Ⅰ帶向低波數(shù)方向產(chǎn)生不同程度紅移，峰形由尖銳趨于平緩。表明在乳蛋白熱變性過程中，隨著蛋白質分子結構的展開，游離氨基酸殘基間形成分子間氫鍵。

通過FT-IR酰胺Ⅰ帶譜圖進行二階導數(shù)、去卷積處理后對乳蛋白的二級結構定量分析：熱處理程度增強會導致乳蛋白二級結構發(fā)生顯著改變，α-螺旋含量顯著降低（p＜0.05），無規(guī)卷曲含量顯著升高（p＜0.05），β-折疊結構和β-轉角結構含量在加熱過程均呈現(xiàn)先增加后減少的變化趨勢。表明熱處理后牛乳蛋白穩(wěn)定性下降，乳蛋白質熱變性疏水基團暴露，部分有序結構向無規(guī)卷曲結構轉化，β-折疊、β-轉角結構在熱聚集體的形成過程中具有重要作用。

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Effect of Heat Treatments on the Secondary Structure of Milk Proteins Analyzed by Fourier Transform Infrared Spectroscopy

SUN Jiayue1, QIAN Fang1, JIANG Shujuan1, TUO Yanfeng1, MU Guangqing1,2,*
(1. School of Food Science and Technology, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China;2. Synergetic Innovation Center of Food Safety and Nutrition, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

Fourier transform infrared spectroscopy was used to investigate protein conformation changes in pasteurized milk(65 ℃/30 min and 80 ℃/15 s), yoghurt (95 ℃/5 min) and ultra-high temperature sterilized milk (137 ℃/5 s) in comparison with raw milk as a control. The aim was to examine the effect of heat treatments on the secondary structure of milk proteins.The results showed that heat treatments could cause interactions between milk proteins, resulting in damage to the spatial structure of milk proteins and intramolecular hydrogen bonds. Different heat treatment conditions could result in different degrees of red shift of milk protein amide Ⅰ bands to lower wavenumbers, suggesting that intermolecular hydrogen bonds were formed between hydrophobic amino acid residues exposed during denaturation. Meanwhile, the secondary structure composition of milk proteins changed signif i cantly after heat treatments; α-helix content decreased signif i cantly(P ＜ 0.05), random coil content increased signif i cantly (P ＜ 0.05), and both β-sheet and β-turn content decreased after an initial increase, indicating that the ordered structure was partially transformed to random coil. Protein aggregation occurred after thermal denaturation, and β-sheet and β-turn played an important role in the formation of heat-induced protein aggregates.

Fourier transform infrared spectroscopy; heat treatment; milk protein; thermal aggregation; secondary structure

10.7506/spkx1002-6630-201723014

TS252.1

A

1002-6630（2017）23-0082-05

孫佳悅, 錢方, 姜淑娟, 等. 基于紅外光譜分析熱處理對牛乳蛋白質二級結構的影響[J]. 食品科學, 2017, 38(23): 82-86.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201723014. http://www.spkx.net.cn

SUN Jiayue, QIAN Fang, JIANG Shujuan, et al. Effect of heat treatments on the secondary structure of milk proteins analyzed by Fourier transform infrared spectroscopy[J]. Food Science, 2017, 38(23): 82-86. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201723014. http://www.spkx.net.cn

2016-09-28

遼寧省自然科學基金面上項目（201602053）；“十二五”國家科技支撐計劃項目（2013BAD18B04）；國家自然科學基金青年科學基金項目（31501513）；國家自然科學基金面上項目（31571813）

孫佳悅（1993—），女，碩士研究生，研究方向為乳品科學。E-mail：sunjiayue66@163.com

*通信作者：牟光慶（1967—），男，教授，博士，研究方向為乳品科學。E-mail：gq6552002@aliyun.com