天門冬對氟中毒大鼠認(rèn)知行為能力的影響及機(jī)制

劉洋，李艷菊，唐東昕，王寧，劉振華，王飛清

(1貴陽中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，貴陽550001；2貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院；3貴州省骨科醫(yī)院；4貴州省人民醫(yī)院)

天門冬對氟中毒大鼠認(rèn)知行為能力的影響及機(jī)制

劉洋1，李艷菊2，唐東昕1，王寧3，劉振華4，王飛清1

(1貴陽中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，貴陽550001；2貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院；3貴州省骨科醫(yī)院；4貴州省人民醫(yī)院)

目的探討天門冬水煎劑灌胃對氟中毒大鼠認(rèn)知行為能力的影響，并探討其作用機(jī)制。方法將60只SD大鼠分成5組各12只，模型對照組和天門冬低、中、高劑量組給予含氟50 mg/kg的玉米飼料制作氟中毒大鼠模型，對照組給予普通飼料喂養(yǎng)。天門冬低、中、高劑量組在大鼠食用含氟飼料當(dāng)天開始，每天給予天門冬水煎劑3、6、12 g/kg灌胃1次，連續(xù)90 d。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前7 d采用Morris水迷宮法檢測各組大鼠認(rèn)知行為能力；分離血清和腦組織，用黃嘌呤氧化酶法測定血清和腦組織中SOD活性，硫代巴比妥酸法測定血清和腦組織中MDA含量。結(jié)果空間探索實(shí)驗(yàn)顯示，模型對照組和天門冬低、中、高劑量組大鼠首次穿越平臺時(shí)間大于對照組，穿越平臺次數(shù)和穿越平臺區(qū)時(shí)間少于對照組，天門冬高劑量組大鼠首次穿越平臺時(shí)間少于中、低劑量組，穿越平臺次數(shù)和穿越平臺區(qū)時(shí)間高于中、低劑量組(P均<0.05)。模型對照組和天門冬低、中、高劑量組大鼠血清和腦組織SOD水平低于對照組，模型對照組低于天門冬低、中、高劑量組，天門冬高劑量組高于中、低劑量組(P均<0.05)。模型對照組和天門冬低、中、高劑量組大鼠血清和腦組織MDA水平高于對照組，模型對照組高于天門冬低、中、高劑量組，天門冬高劑量組低于中、低劑量組(P均<0.05)。結(jié)論氟中毒可導(dǎo)致大鼠血清及腦組織中氧化與抗氧化水平紊亂，影響大鼠的認(rèn)知行為能力；天門冬水煎劑灌胃可調(diào)整氟中毒大鼠血清及腦組織中的氧化水平與抗氧化水平，改善大鼠的認(rèn)知行為能力。

氟中毒；天門冬；丙二醛；超氧化物歧化酶；氧化應(yīng)激；認(rèn)知行為能力；腦損傷；中藥

流行病學(xué)調(diào)查顯示，氟化物蓄積于腦組織可引起大腦損傷、智力下降、學(xué)習(xí)記憶功能損害及行為障礙[1～4]。研究[5]發(fā)現(xiàn)，氟引起腦損傷與體內(nèi)的自由基、脂質(zhì)過氧化物水平明顯相關(guān)。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，中草藥天門冬具有抗氧化、抗衰老、抗凋亡等作用[6～8]，而天門冬能否通過較強(qiáng)的清除氧化應(yīng)激產(chǎn)物達(dá)到拮抗氟的毒性，目前尚無定論。2016年12月～2017年2月，我們構(gòu)建了氟中毒大鼠模型，觀察天門冬對大鼠認(rèn)知行為能力的影響，并探討其作用機(jī)制，為中草藥防治地方性氟中毒腦損傷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級SD大鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量90～100 g，由貴州醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)。天門冬購于貴陽仁濟(jì)堂，取天門冬50 g加入500 mL水，沸水煎煮2次，煮沸1 h，抽濾，用水補(bǔ)足減少的質(zhì)量，藥液在70 ℃減壓濃縮，得到濃度為1 g/mL的天門冬水煎劑，2～8 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。超氧化物歧化?SOD)和丙二醛(MDA)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所，氟化鈉(分析純)購自無錫市展望化工試劑有限公司；pF-1型氟離子選擇性電極為上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；Morris水迷宮圖像自動采集和處理系統(tǒng)為中科院藥物研究所產(chǎn)品。

1.2 動物分組及處理 將大鼠隨機(jī)分為模型組48只和對照組12只，對照組給予普通飼料喂養(yǎng)，模型組自由食用模擬氟病區(qū)配方的原煤加拌泥煤烘烤的玉米飼料(飼料內(nèi)含氟50 mg/kg)，連續(xù)90 d。以模型組尿氟和骨氟含量高于對照組為模型構(gòu)建成功。將模型組48只大鼠分為模型對照組和天門冬低、中、高劑量組各12只，天門冬低、中、高劑量組在大鼠食用含氟飼料當(dāng)天開始每天給予天門冬水煎劑3、6、12 g/kg灌胃1次，連續(xù)90 d。

1.3 認(rèn)知行為能力觀察 采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前第7天開始，連續(xù)4 d對大鼠實(shí)施定向航行實(shí)驗(yàn)，觀察大鼠在不同象限尋找平臺的時(shí)間。24 h后行空間探索實(shí)驗(yàn)，撤除平臺，將各組大鼠從平臺對側(cè)象限放入水中，記錄其在60 s內(nèi)首次穿越平臺時(shí)間、穿越平臺次數(shù)以及在平臺所在象限停留時(shí)間。

1.4 血清和腦組織SOD、MDA檢測 實(shí)驗(yàn)第90天，股動脈取血處死各組大鼠，離心分離血清，低溫保存?zhèn)溆?。取腦組織，加入生理鹽水制成10%的組織勻漿，離心取上清，再用生理鹽水按1∶9稀釋成1%組織勻漿，待測。采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性，硫代巴比妥酸法測定MDA含量，具體步驟嚴(yán)格按照試劑說明書操作。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠認(rèn)知行為能力比較 模型對照組和天門冬低劑量組首次穿越平臺時(shí)間較對照延長，天門冬中、高劑量組首次穿越平臺時(shí)間較模型對照組和天門冬低劑量組縮短(P均<0.05)。對照組穿越平臺次數(shù)較其余各組增多，天門冬高劑量組穿越平臺次數(shù)多于中、低劑量組(P均<0.05)；對照組平臺停留時(shí)間較模型對照組和天門冬低劑量組延長，天門冬高劑量組平臺停留時(shí)間較中、低劑量組延長(P均<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型對照組比較，#P<0.05；與天門冬低劑量組比較，△P<0.05。

2.2 各組血清SOD、MDA水平比較 各模型組血清SOD水平低于對照組，模型對照組血清SOD水平低于天門冬中、高劑量組，天門冬高劑量組血清SOD水平高于中、低劑量組(P均<0.05)。各模型組血清MDA水平高于對照組，模型對照組血清MDA水平高于天門冬各劑量組，天門冬組高劑量組血清MDA水平低于中、低劑量組(P均<0.05)。見表2。

2.3 各組腦組織SOD、MDA水平比較 各模型組腦組織SOD水平低于對照組，模型對照組腦組織SOD水平低于天門冬中、高劑量組，天門冬高劑量組腦組織SOD水平高于中、低劑量組(P均<0.05)。

表2 各組血清SOD和MDA水平比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型對照組比較，#P<0.05；與天門冬高劑量組比較，△P<0.05。

各模型組腦組織MDA水平高于對照組，模型對照組腦組織MDA水平高于天門冬各劑量組，天門冬高劑量組腦組織MDA水平低于中、低劑量組(P均<0.05)。見表3。

表3 各組腦組織SOD和MDA水平比較

注:與對照組比較，*P<0.05；與模型對照組比較，#P<0.05；與天門冬高劑量組比較，△P<0.05。

3 討論

動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，過量攝入氟的大鼠學(xué)習(xí)記憶能力顯著下降。氟離子可通過血腦屏障蓄積于腦組織造成腦損傷，致使腦組織代謝、酶活性、學(xué)習(xí)記憶能力等異常改變，而脂質(zhì)過氧化作用被認(rèn)為是氟中毒的機(jī)制之一[9，10]。氟化物蓄積可消耗體內(nèi)的抗氧化物質(zhì)和自由基清除酶類，導(dǎo)致抗氧化水平與自由基之間失去平衡，造成機(jī)體組織損傷[11～13]。氟對腦組織的損傷作用逐漸受到人們重視。氟在大腦內(nèi)蓄積可直接損傷腦組織，從而影響記憶和思維能力[14，15]。研究[16]發(fā)現(xiàn)，飲用不同劑量氟化鈉溶液的小鼠學(xué)習(xí)記憶能力降低，并與染氟劑量明顯相關(guān)。腦組織富含不飽和脂肪酸，是氟化物損傷的主要靶器官，腦組織又是耗氧量最多的器官，容易產(chǎn)生活性氧，進(jìn)一步影響腦的正常生理功能[17]。氟中毒對大腦認(rèn)知行為能力改變可能是通過氟中毒致大腦氧化應(yīng)激損傷。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型對照組腦組織SOD水平明顯低于對照組，模型對照組腦組織MDA含量明顯高于對照組。

針對氟中毒致氧化應(yīng)激的抗氧化藥物研究較多，主要是利用一些礦物質(zhì)微量元素和維生素等治療慢性氟中毒[18，19]。近年來，具有抗氧化作用的中草藥逐漸用于防治氟中毒的研究。我們的前期實(shí)驗(yàn)[6～8]發(fā)現(xiàn)，天門冬具有明顯抗氧化作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大鼠血清SOD活力增高，血清MDA含量降低，機(jī)體抗氧化能力得到提升，且高劑量組效果更佳。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對氟中毒大鼠模型給予天門冬水煎劑灌胃，可提高大鼠腦組織SOD活力，降低腦組織MDA含量，腦組織抗氧化能力得到提升，且高劑量組效果更佳。水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，天門冬各劑量組首次穿越平臺時(shí)間較模型對照組縮短，穿越平臺次數(shù)增加，穿越平臺區(qū)時(shí)間延長。表明天門冬水煎劑灌胃可降低大腦組織氧化水平，提高大腦抗氧化能力，并進(jìn)一步改善大鼠的認(rèn)知行為能力。

綜上所述，氟中毒可降低大鼠血液和腦組織SOD水平，提高大鼠血液和腦組織MDA水平，降低大鼠認(rèn)知行為能力；天門冬水煎劑灌胃可降低血液和腦組織中MDA水平，提高血液和腦組織SOD水平，改善大鼠的認(rèn)知行為能力。這為今后中草藥用于氟中毒腦損傷提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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貴州省科技合作計(jì)劃項(xiàng)目(黔科合LH字2016-7511號，黔科合基礎(chǔ)2016-1019)；貴州省教育廳青年科技人才成長項(xiàng)目(黔教合KY2016-190)。

王飛清(E-mail: cnwangfeiqing2006@126.com)

2017-02-19)