許雪梅，劉建

體外腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲定量方法的建立

許雪梅，劉建

侵襲是惡性腫瘤最重要的特征之一。腫瘤細(xì)胞由其原發(fā)部位侵入淋巴管、血管或體腔，部分細(xì)胞被血液、淋巴液帶到另一部位或器官繼續(xù)生長(zhǎng)，形成與原發(fā)瘤同樣類型的腫瘤，這一過程即為腫瘤的遷移和侵襲[1]。在腫瘤研究中，腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)是研究腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)特性的重要方法[2-3]，也是抗腫瘤藥物篩選的常用手段[4-6]。建立合適的腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲模型，并建立簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的定量方法，對(duì)于腫瘤研究具有重要的意義[7]。

傳統(tǒng)的定量方法是將遷移或侵襲的細(xì)胞用結(jié)晶紫染色，在顯微鏡下對(duì)幾個(gè)代表性視野中的染色細(xì)胞進(jìn)行拍照和計(jì)數(shù)[8-9]，耗時(shí)長(zhǎng)、通量低、準(zhǔn)確度差。本研究中，我們?cè)趥鹘y(tǒng)的模型基礎(chǔ)上，建立了一種結(jié)晶紫染色后進(jìn)行醋酸脫色、酶標(biāo)儀讀取吸光度值的定量方法。

1 材料與方法

1.1 材料

人纖維肉瘤細(xì)胞 HT-1080、小鼠成纖維細(xì)胞 NIH/3T3以及人乳腺癌細(xì)胞 MCF-7 均購(gòu)自美國(guó) ATCC；MEM 和DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清、PBS、matrigel、transwell 細(xì)胞培養(yǎng)小室（8 μm 孔徑 PET 膜）、T-25 細(xì)胞培養(yǎng)瓶、96 孔透明板等均為康寧公司產(chǎn)品；結(jié)晶紫染料購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；醋酸購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)；SpectraMax M4 多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美谷分子儀器（上海）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HT-1080 細(xì)胞用添加 10% 胎牛血清的MEM 進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。MCF-7 細(xì)胞用添加 10% 胎牛血清及 0.01 mg/ml 的人重組胰島素的 MEM 進(jìn)行培養(yǎng)。NIH/3T3細(xì)胞用添加 10% 胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)。細(xì)胞每隔 2 ～3 天換液，在達(dá)到 80% ～ 90% 匯合度時(shí)進(jìn)行傳代。

1.2.2 細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn) matrigel 使用前置于冰上，于 4 ℃ 冰箱融化過夜。所有接觸 matrigel 的試劑、耗材、器皿等都置于冰上預(yù)冷。將 matrigel 用無血清培養(yǎng)液稀釋至 200 μg/ml，上下吹打混勻。取 100 μl 稀釋后的 matrigel包被溶液，小心加入到侵襲組的 transwell 細(xì)胞培養(yǎng)小室中間。將包被 matrigel 的 transwell 置于 37 ℃ 孵育 1 h 以上。遷移組的小室不用包被 matrigel。HT-1080、NIH/3T3 和MCF-7 細(xì)胞用胰酶消化，離心收集，用不含 FBS 的培養(yǎng)液重懸。細(xì)胞計(jì)數(shù)，并用無血清培養(yǎng)液稀釋至 5 × 105個(gè)/ml。取出包被好 matrigel 的 transwell 小室，吸棄上層殘留的液體。遷移組和侵襲組均接種 150 μl 細(xì)胞懸液至 transwell 小室內(nèi)，細(xì)胞終密度為 75 000/孔。實(shí)驗(yàn)組向下室中加入 800 μl含血清的培養(yǎng)液，對(duì)照組中加入 800 μl 不含血清的培養(yǎng)液。每組 4 個(gè)復(fù)孔。置于 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 16 h。培養(yǎng)結(jié)束后，取出 transwell 小室，PBS 洗 2 次，用棉簽輕輕擦除上室膜上的細(xì)胞。將小室置于結(jié)晶紫染料中室溫染色 10 min，用 PBS 洗滌 2 ～ 3 次，直至洗滌液不再有顏色為止，晾干。

1.2.3 手動(dòng)計(jì)數(shù)法定量細(xì)胞遷移和侵襲率 顯微鏡下對(duì)遷移和侵襲的細(xì)胞進(jìn)行觀察并拍照，隨機(jī)選取 5 個(gè)視野，計(jì)數(shù)一定面積下結(jié)晶紫染色的細(xì)胞。將單個(gè)視野下計(jì)數(shù)細(xì)胞的平均值除以單個(gè)視野的面積，再乘以 transwell 小室的總生長(zhǎng)面積，即得到遷移或侵襲的總細(xì)胞數(shù)。用遷移或侵襲的總細(xì)胞數(shù)除以接種的初始細(xì)胞數(shù)，即得到遷移率和侵襲率。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取 HT-1080、NIH/3T3 和MCF-7 細(xì)胞，消化、計(jì)數(shù)，分別用培養(yǎng)液稀釋成一系列密度，接種至 96 孔板中，每個(gè)密度 4 個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)過夜。細(xì)胞用結(jié)晶紫室溫染色 10 min 后，PBS 洗滌 2 ～ 3 次。醋酸用雙蒸水稀釋至 33%（v/v）。取 200 μl 33% 醋酸加入到 96 孔板中，室溫振蕩 10 min，使染色的細(xì)胞充分脫色。洗脫液用酶標(biāo)儀讀取 590 nm 處吸光度值。原始數(shù)據(jù)扣除空白組（不含細(xì)胞、同樣處理）后，與對(duì)應(yīng)的細(xì)胞接種數(shù)進(jìn)行線性回歸，繪制細(xì)胞數(shù)和吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得到針對(duì)該細(xì)胞系的回歸直線方程。

1.2.5 光吸收法定量細(xì)胞遷移和侵襲率 將結(jié)晶紫染色后的 transwell 小室置于 24 孔板中，每孔加入 400 μl 33%醋酸溶液，室溫振蕩 10 min，充分洗脫與細(xì)胞結(jié)合的結(jié)晶紫。轉(zhuǎn)移 200 μl 洗脫液至 96 孔透明板中，用酶標(biāo)儀讀取590 nm 處的吸光度值。將遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)組的吸光度值減去空白組后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸直線方程換算成細(xì)胞數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù) 2，得到遷移或侵襲的總細(xì)胞數(shù)。用遷移或侵襲的總細(xì)胞數(shù)除以接種的初始細(xì)胞數(shù)，即得到遷移率和侵襲率。

2 結(jié)果

2.1 不同細(xì)胞的遷移和侵襲特性

3 種不同的細(xì)胞株 HT-1080、NIH/3T3 和 MCF-7 進(jìn)行細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)，結(jié)晶紫染色后顯微鏡下觀察結(jié)果如圖 1 所示。在 10% FBS 的誘導(dǎo)下，HT-1080 細(xì)胞能夠降解 matrigel 并穿透膜上的孔進(jìn)入到 transwell 下室，具有很強(qiáng)的侵襲能力。NIH/3T3 細(xì)胞在無 matrigel 時(shí)能夠遷移到下室，而在有 matrigel 作為屏障時(shí)不能穿透，表明該細(xì)胞具有很強(qiáng)的遷移能力，但侵襲能力弱。MCF-7 在有無matrigel 時(shí)均不能穿透到下室，表明該細(xì)胞遷移力很弱。在沒有 FBS 誘導(dǎo)時(shí)，3 種細(xì)胞均不遷移或侵襲?？瞻捉M上的黑色小點(diǎn)為顯微鏡下觀察到的 transwell 上的微孔。

圖 1 顯微鏡下 HT-1080、NIH/3T3 和 MCF-7 細(xì)胞的遷移和侵襲染色結(jié)果（比例尺：200 μm）

圖 2 手動(dòng)計(jì)數(shù)法選取的一個(gè)隨機(jī)視野

2.2 手動(dòng)計(jì)數(shù)法定量細(xì)胞遷移和侵襲率

本次實(shí)驗(yàn)采用的 transwell 小室的生長(zhǎng)面積為 0.33 cm2。計(jì)數(shù)所選取的視野為邊長(zhǎng) 200 μm 的正方形，單個(gè)視野的面積為 0.0004 cm2，如圖 2 所示的白色線框所選范圍。當(dāng)細(xì)胞數(shù)量較多時(shí)，計(jì)數(shù)工作量大，同時(shí)細(xì)胞和細(xì)胞之間形成交叉重疊，計(jì)數(shù)時(shí)較難分辨。手動(dòng)計(jì)數(shù)通過將單個(gè)視野的細(xì)胞數(shù)換算成一個(gè) transwell 小室的總細(xì)胞數(shù)后，除以接種細(xì)胞數(shù)，得到細(xì)胞遷移率和侵襲率，如圖 3 所示，結(jié)果與顯微鏡下觀察到的遷移和侵襲染色結(jié)果所反映的不同細(xì)胞遷移和侵襲特性一致。

圖 3 手動(dòng)計(jì)數(shù)法的 HT-1080（A）、NIH/3T3（B）和 MCF-7（C）細(xì)胞遷移率和侵襲率（***P ＜ 0.001）

2.3 結(jié)晶紫標(biāo)準(zhǔn)曲線

通過不同細(xì)胞數(shù)對(duì)應(yīng)的醋酸洗脫液OD590nm數(shù)值，進(jìn)行線性回歸，繪制得到標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖 4）。HT-1080 細(xì)胞的回歸方程：y = 1.207 × 10-5x + 0.007287（r2= 0.9925）；NIH/3T3 細(xì)胞的回歸方程：y = 0.8613 × 10-5x - 0.00307（r2= 0.9989）；MCF-7 細(xì)胞的回歸方程：y = 0.9383 × 10-5x -0.004072（r2= 0.9943）。

2.4 光吸收法定量細(xì)胞遷移和侵襲率

HT-1080、NIH/3T3 和 MCF-7 遷移和侵襲細(xì)胞，結(jié)晶紫染色后脫色，醋酸洗脫液呈現(xiàn)出與細(xì)胞染色結(jié)果一致的藍(lán)紫色（圖 5），而細(xì)胞上不再顯現(xiàn)顏色。洗脫液測(cè)定 590 nm吸光度值，扣除空白組后，將吸光度值根據(jù)對(duì)應(yīng)細(xì)胞的線性回歸方程換算成細(xì)胞數(shù)。由于 24 孔板侵襲實(shí)驗(yàn)洗脫液體積是 96 孔板標(biāo)準(zhǔn)曲線洗脫液的兩倍，細(xì)胞數(shù)乘以稀釋倍數(shù)2，即得到遷移或侵襲的總細(xì)胞數(shù)，再除以接種的起始細(xì)胞數(shù)，即得到細(xì)胞遷移率和侵襲率（圖 6），結(jié)果與手動(dòng)計(jì)數(shù)法的結(jié)果及顯微鏡下觀察結(jié)果一致。

圖 4 HT-1080（A）、NIH/3T3（B）和 MCF-7（C）細(xì)胞結(jié)晶紫染色標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖 5 遷移和侵襲細(xì)胞結(jié)晶紫染色的醋酸洗脫液

圖 6 結(jié)晶紫洗脫液光吸收法的 HT-1080（A）、NIH/3T3（B）和 MCF-7（C）細(xì)胞遷移率和侵襲率（***P ＜ 0.001，**P ＜ 0.005）

2.5 遷移和侵襲定量實(shí)驗(yàn)流程的建立

圖 7 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)晶紫光吸收法定量流程

采用 transwell 細(xì)胞培養(yǎng)小室成功地建立了一種新的基于結(jié)晶紫光吸收的遷移和侵襲定量實(shí)驗(yàn)流程（圖 7）。transwell 包被（不包被）matrigel 之后，用無血清培養(yǎng)液接種細(xì)胞至上室，在下室中用 10% FBS 誘導(dǎo)。無 matrigel 包被時(shí)，遷移性的細(xì)胞穿透 transwell 上的多孔膜進(jìn)入下室；有 matrigel 包被時(shí)，侵襲性的細(xì)胞降解 matrigel 后進(jìn)入下室。下室細(xì)胞用結(jié)晶紫染色后，可采用傳統(tǒng)手動(dòng)計(jì)數(shù)的方法進(jìn)行定量，也可采用醋酸對(duì)染色細(xì)胞進(jìn)行脫色，洗脫液用酶標(biāo)儀讀取 590 nm 處的吸光度值，即可對(duì)遷移和侵襲的細(xì)胞進(jìn)行定量。

3 討論

在腫瘤侵襲機(jī)制研究以及抗腫瘤藥物篩選中，細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)都是應(yīng)用非常廣泛的體外模型。遷移是指細(xì)胞在遷移信號(hào)或物質(zhì)濃度梯度的作用下從一個(gè)位置到另一個(gè)位置的運(yùn)動(dòng)。而侵襲則需要細(xì)胞首先通過酶促降解細(xì)胞外基質(zhì)而通過這一屏障[10]。

康寧 transwell 小室是一種常用的研究腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲的工具[11]。Transwell 小室上的多孔膜將細(xì)胞生長(zhǎng)的空間分成兩個(gè)部分，膜上面的空間稱為上室，膜下面稱為下室。將細(xì)胞接種到上室內(nèi)，由于多孔膜的通透性，在下室培養(yǎng)液中的營(yíng)養(yǎng)成分會(huì)誘導(dǎo)上室細(xì)胞穿過多孔膜進(jìn)入下室，從而可以很方便地研究細(xì)胞的遷移。而侵襲可通過在transwell 上包被一層康寧 matrigel 進(jìn)行。Matrigel 是從小鼠肉瘤中提取的可溶性基質(zhì)蛋白，可以模擬細(xì)胞侵襲中的細(xì)胞外基質(zhì)屏障[12-13]。細(xì)胞需要首先分泌基質(zhì)金屬蛋白酶來消化屏障，然后才能通過多孔膜運(yùn)動(dòng)到下室，這一過程即為侵襲。在遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞接種密度、誘導(dǎo)物濃度、遷移和侵襲時(shí)間、屏障濃度等是實(shí)驗(yàn)中至關(guān)重要的因素，需根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化[14]。

本研究采用 3 種不同類型的細(xì)胞驗(yàn)證了實(shí)驗(yàn)的有效性。低遷移性的 MCF-7 細(xì)胞表明無自發(fā)性的細(xì)胞遷移發(fā)生；低侵襲性的 NIH/3T3 細(xì)胞驗(yàn)證了 matrigel 模擬組織屏障阻止侵襲的有效性；侵襲性的 HT-1080 細(xì)胞驗(yàn)證了侵襲實(shí)驗(yàn)的有效性。

細(xì)胞結(jié)晶紫染色是廣泛應(yīng)用于遷移和侵襲的檢測(cè)方法，該方法的定量通常是在顯微鏡下對(duì)幾個(gè)代表性的視野中被染色的細(xì)胞進(jìn)行拍照和計(jì)數(shù)，但手工計(jì)數(shù)耗時(shí)長(zhǎng)、通量低、工作量大，隨機(jī)選取的幾個(gè)視野不能準(zhǔn)確地反映所有的情況，同時(shí)細(xì)胞密度大時(shí)的交叉重疊會(huì)造成計(jì)數(shù)的不準(zhǔn)確，使得該方法的應(yīng)用受到限制。

在本研究的細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)中，我們?cè)趥鹘y(tǒng)的結(jié)晶紫染色后，采用 33% 醋酸將細(xì)胞結(jié)合的結(jié)晶紫染料洗脫下來，通過測(cè)量洗脫液的吸光度值，可以對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲進(jìn)行定量。結(jié)合細(xì)胞數(shù)-吸光度值標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以計(jì)算出細(xì)胞遷移和侵襲的百分率。該方法可以很方便地在常規(guī)結(jié)晶紫染色后進(jìn)行，將細(xì)胞的手動(dòng)計(jì)數(shù)轉(zhuǎn)換成均質(zhì)溶液吸光度值的測(cè)量，消除了人為判斷的不準(zhǔn)確性，免除了繁瑣乏味的手工計(jì)數(shù)步驟，簡(jiǎn)便易行，結(jié)果與手工計(jì)數(shù)方法具有一致性，是一種有效的細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)的定量方法。

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10.3969/j.issn.1673-713X.2017.06.013

201206 上海，康寧生命科學(xué)亞洲技術(shù)中心

劉建，Email：liuj11@corning.com

2017-08-30