時磊，魏明

白細胞介素17A體外刺激角質(zhì)形成細胞株對角蛋白17表達的影響

時磊，魏明

目的觀察白細胞介素 17A（IL-17A）對體外培養(yǎng)的人永生化角質(zhì)形成細胞株 HaCaT 分泌角蛋白 17（K17）及信號轉(zhuǎn)導和信號轉(zhuǎn)錄激活因子 3（STAT3）信號通路的影響。

方法RPMI1640 培養(yǎng)液培養(yǎng)的 HaCaT 細胞隨機分為空白對照組、IL-17A（50 μg/L）刺激孔（誘導組）和 IL-17A（50 μg/L）+ 10 μmol/L STAT3 抑制劑白皮杉醇（抑制劑組）。收集培養(yǎng)的 HaCaT 細胞，采用四甲基偶氮唑鹽（MTT）檢測 HaCaT 細胞增殖；采用流式細胞術(shù)（FCM）檢測HaCaT 細胞凋亡；采用 RT-PCR 檢測 HaCaT 細胞 K17 mRNA 表達水平；采用 Western blot 法檢測 HaCaT 細胞K17 和磷酸化 STAT3（p-STAT3）蛋白表達水平。

結(jié)果誘導組、抑制劑組和空白對照組 HaCaT 細胞增殖差異有統(tǒng)計學意義（F= 8.47，P= 0.006），誘導組 HaCaT 細胞增殖高于空白對照組和抑制劑組（均P＜ 0.05）；誘導組、抑制劑組和空白對照組 HaCaT 細胞凋亡率差異有統(tǒng)計學意義（F= 26.48，P= 0.001），誘導組 HaCaT 細胞凋亡率（5.96% ± 0.68%）低于空白對照組（15.34% ± 1.32%）和抑制劑組（15.62% ± 1.26%）（均P＜ 0.05）；誘導組、抑制劑組和空白對照組 HaCaT 細胞 K17 mRNA 表達差異有統(tǒng)計學意義（F= 10.25，P= 0.001），與空白對照組和抑制劑組比較，誘導組的 HaCaT 細胞 K17 mRNA 表達明顯升高（均P＜ 0.05）；3 組 HaCaT 細胞 K17 和 p-STAT3 蛋白表達差異有統(tǒng)計學意義（F分別為 11.62 和 9.86，P= 0.001和 0.003）。與空白對照組和抑制劑組比較，誘導組的HaCaT 細胞 K17 和 p-STAT3 蛋白表達明顯升高（均P＜0.05）。

結(jié)論IL-17A 能夠上調(diào)體外培養(yǎng)的 HaCaT 細胞 K17 的表達，其調(diào)控機制可能是通過激活 STAT3 來實現(xiàn)，表明IL-17A 在銀屑病中所發(fā)揮的作用可能與 K17 有關，為銀屑病的發(fā)病機制研究和治療提供了新的思路。

白細胞介素 17； 銀屑病； Th17 細胞； 角蛋白 17； STAT3 轉(zhuǎn)錄因子

銀屑病是一種由 T 細胞介導的持續(xù)存在的慢性、炎癥性疾病，其主要表現(xiàn)是角質(zhì)形成細胞（keratinocytes，KC）的異常分化和增殖[1-2]。Th17細胞為一種新型細胞，其標志性細胞因子IL-17 具有強大的致炎性，在銀屑病的發(fā)生發(fā)展過程中有重要作用[3-4]。近年來研究表明，銀屑病患者血清及皮損組織中 Th17 相關細胞因子水平以及皮損組織中 IL-17A 和 IL-23R 均表達升高[5-6]，由于 K17 與鏈球菌 M 蛋白具有交叉抗原特性，其表面含有多個 T 淋巴細胞活化表位，能夠刺激炎癥皮損浸潤 T 淋巴細胞[7]，使之活化、增生，釋放IL-17 等炎性因子，這些因子又能夠誘導 K17 的表達，從而在 K17 和 T 細胞之間形成一個相互促進的環(huán)路[8-10]，導致炎性反應和表皮細胞周期異常等病理改變[7]。為此本研究以體外培養(yǎng) HaCaT 細胞為模型，探析 K17 在銀屑病 T 淋巴細胞介導免疫機制中的作用以及對信號轉(zhuǎn)導和信號轉(zhuǎn)錄激活因子 3（STAT3）信號通路的影響，為銀屑病的發(fā)病機制研究提供新思路，并為今后開展銀屑病的靶向治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞與試劑 皮膚角質(zhì)形成細胞株 HaCaT購于南京凱基生物有限公司；TRIzol 購于美國Invitrogen 公司；重組 IL-17A 購于美國 PeproTech公司；改良 Eagle 培養(yǎng)基（DMEM）、胎牛血清、0.25% 胰酶-EDTA、青霉素-鏈霉素雙抗溶液、二甲基亞砜（DMSO）、RPMI1640 培養(yǎng)液購于美國 Gibco公司；5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽（BCIP）-四唑硝基藍（NBT）顯色試劑盒購于瑞士 Roche 公司；四甲基偶氮唑藍（MTT）試劑盒購于美國 Sigma 公司；逆轉(zhuǎn)錄 PCR 試劑盒購于大連寶生物工程有限公司；異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標記的 AnnexinV 細胞凋亡試劑以及流式細胞儀檢測相關試劑購于美國 BD 公司；細胞培養(yǎng)箱為美國 Thermo 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 HaCaT 細胞培養(yǎng) HaCaT 細胞在含 10%胎牛血清及 1% 青鏈霉素的改良 DMEM 培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，待細胞單層鋪滿培養(yǎng)瓶后，磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗 1 次，加0.25% 胰蛋白酶消化液，待鏡下細胞圓縮時，DMEM 培養(yǎng)液終止消化，細胞收集于離心管中，600 ×g離心 5 min，棄上清，將細胞懸液分別移至冷凍管中，每管 1.5 ml，將凍存管先置于 4 ℃ 冰箱 2 h，再移至 -80 ℃ 低溫冰箱 24 h，然后投入-196 ℃ 液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 HaCaT 細胞分組 將 HaCaT 細胞重懸于細胞培養(yǎng)液中，以 5 × 105個/ml 細胞鋪于 6 孔板中，用含 10% 胎牛血清的 RPMI1640 培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。待其細胞達到 70% ～ 80% 融合度時，按實驗要求分組如下：空白對照組（僅加 DMEM 高糖培養(yǎng)基）、誘導組（加含 50 μg/L IL-17A 的 DMEM高糖培養(yǎng)基）和抑制劑組（先加含 50 μg/L IL-17A的 DMEM 高糖培養(yǎng)基和 10 μmol/L STAT3 抑制劑白皮杉醇），孵育 6 h 后，置換為含 10% 胎牛血清的 RPMI1640 培養(yǎng)液，根據(jù)實驗要求繼續(xù)培養(yǎng)，每組重復 3 次。

1.2.3 MTT 比色法檢測 HaCaT 細胞增殖 HaCaT細胞分組處理后，于 12、24、36、48 h 時，用 MTT法檢測 HaCaT 細胞增殖情況。胰酶消化細胞制備單細胞懸液，每組細胞以 6 × 104個/孔接種于96 孔培養(yǎng)板，細胞融合達到 80% 左右時開始檢測。吸棄原培養(yǎng)基，每孔加入 5 mg/ml 的 MTT 20 μl，37 ℃ 恒溫箱中孵育 4 h。吸棄上清后，每孔加入 150 μl DMSO，振蕩 10 min 充分溶解藍色結(jié)晶，測 490 nm 波長處的吸光值。

1.2.4 流式細胞儀檢測 HaCaT 細胞凋亡 取培養(yǎng) 48 h 分組 HaCaT 細胞，用不含 EDTA 的胰蛋白酶消化分組處理，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌后離心。吸棄上清后加入緩沖液 100 μl 重懸細胞，隨后加入 AnnexinV-FITC 5 μl 和碘化丙啶（PI），5 μl 放置于室溫避光孵育 15 min。加入 500 μl 緩沖液，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.5 RT-PCR 測定 HaCaT 細胞 K17 的表達 提取培養(yǎng) 48 h 后的各組 HaCaT 細胞總 RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，目的基因 K17 上游引物：5' ATGG ATCCATGACCATGCAGGCCTTGGAGA 3'，K17下游引物：5' AGGAATTCTCACGTCTTCACATCCA GCAGGA 3'，β-肌動蛋白（β-actin）上游引物：5' CA CGATGGAGGGGCCGGACTCATC 3'，β-actin 下游引物：5' TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT 3'。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄得到 cDNA。PCR反應體系為 25 μl，擴增條件為：94 ℃ 預變性 3 min；94 ℃ 變性 30 s，57 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 50 s，共 35 個循環(huán)；最后 72 ℃ 延伸 5 min。PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng) 2% 瓊脂糖凝膠電泳后，用凝膠成像系統(tǒng)掃描拍照，檢測各電泳條帶的灰度，計算與 β-肌動蛋白比值，得到目的產(chǎn)物的相對含量。

1.2.6 Western blot 法測定 HaCaT 細胞 K17 和p-STAT3 蛋白的表達 培養(yǎng) 48 h 后收集各組HaCaT 細胞，提取總蛋白，用二喹啉甲酸蛋白（BCA）法檢測蛋白濃度，上樣 40 μg 電泳、轉(zhuǎn)膜及封閉，一抗孵育（兔抗人 K17、p-STAT3 多克隆抗體滴度為 1∶1000，鼠抗人 β-actin 單克隆抗體為1∶1000），4 ℃ 過夜，二抗孵育（山羊抗兔 IgG 抗體滴度為 1∶2000，馬抗小鼠 IgG 抗體為 1∶2000）2 h，BCIP/NBT 顯色液顯色，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果，目的蛋白條帶 K17 和 p-STAT3 與相應內(nèi)參β-actin 條帶的灰度值比值作為其蛋白水平的半定量指標。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用 SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料用±s表示。多組間比較采用單因素方差分析，兩兩間比較采用 LSD-t檢驗。以P＜ 0.05 為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 RNA 質(zhì)量鑒定和濃度測定

取適量 RNA 水溶液行變性瓊脂糖凝膠電泳，以鑒定 RNA 質(zhì)量?？梢姌颖?28S 和18S 條帶清晰明亮，28S 亮度大于 18S，表明 RNA 質(zhì)量合格，沒有發(fā)生降解（圖 1）。OD260/280比值接近 2，提示 RNA 純度良好，可進行下一步檢測。

2.2 IL-17A 體外刺激對 HaCaT 細胞增殖的影響

MTT 檢測 IL-17A 刺激 HaCaT 細胞 12、24、36、48 h 對 HaCaT 細胞增殖能力的影響，結(jié)果見表 1。重復測量方差分析顯示，空白對照組、誘導組和抑制劑組間 HaCaT 細胞增殖不同（F= 8.47，

圖 1 RNA 瓊脂糖電泳圖Figure 1 Agarose gel electrophoresis of RNA

P= 0.006），提示 IL-17A 能促進 HaCaT 細胞的增殖；時間因素有統(tǒng)計學意義（F= 15.36，P＜ 0.001），說明 HaCaT 細胞增殖率有隨時間變化的趨勢；時間和分組的交互作用沒有統(tǒng)計學意義（F= 1.25，

P= 0.26），說明各組 HaCaT 細胞增殖隨時間變化的趨勢沒有明顯差異。

2.3 IL-17A 體外刺激對 HaCaT 細胞凋亡的影響

空白對照組、誘導組 HaCaT 細胞凋亡率分別為（15.34% ± 1.32%）和（5.96% ± 0.68%），抑制劑組 HaCaT 細胞的凋亡率為（15.62% ± 1.26%），差異有統(tǒng)計學意義（F= 26.48，P= 0.001）。兩兩比較，誘導組 HaCaT 細胞凋亡率較空白對照組和抑制劑組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（LSD-t= 6.32，LSD-t= 6.38，P＜ 0.05），見圖 2。

2.4 IL-17A 體外刺激對 HaCaT 細胞 K17 mRNA表達的影響

空白對照組、誘導組和抑制劑組 HaCaT 細胞K17 mRNA 表達差異有統(tǒng)計學意義（F= 10.25，P= 0.001），與空白對照組和抑制劑組比較，誘導組的 HaCaT 細胞 K17 mRNA 表達明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（LSD-t分別為 4.69 和 4.98，P＜0.05），見圖 3 和圖 4。

2.5 IL-17A 體外刺激對 HaCaT 細胞 K17 蛋白表達的影響

空白對照組、誘導組和抑制劑組 HaCaT 細胞K17 蛋白表達差異有統(tǒng)計學意義（F= 11.62，P= 0.001），與空白對照組和抑制劑組比較，誘導組的HaCaT 細胞 K17 蛋白表達明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（LSD-t分別為 3.68 和 4.21，P＜ 0.05），見圖 5 和圖 6。

表 1 IL-17A 對 HaCaT 細胞增殖的影響（A490，±s ）Table 1 Effects of IL-17A on the proliferation of HaCaT cells (A490,±s )

表 1 IL-17A 對 HaCaT 細胞增殖的影響（A490，±s ）Table 1 Effects of IL-17A on the proliferation of HaCaT cells (A490,±s )

注：a每個時間點 3 個分組間的比較。*與空白對照組比較，12 h：LSD-t = 3.26；24 h：LSD-t = 4.51；36 h：LSD-t = 8.68；48 h：LSD-t = 9.62；#與抑制劑組比較，12 h：LSD-t = 3.29；24 h：LSD-t = 4.65；36 h：LSD-t = 7.37；48 h：LSD-t = 9.74。Notes： aCompared the three groups at each time point. *Compared blank control group, 12 h： LSD-t = 3.26; 24 h： LSD-t = 4.51; 36 h： LSD-t = 8.68; 48 h：LSD-t = 9.62; #Compared inhibitor group, 12 h： LSD-t = 3.29; 24 h： LSD-t = 4.65; 36 h： LSD-t = 7.37; 48 h： LSD-t = 9.74.

組別 G r o u p s 1 2 h 2 4 h 3 6 h 4 8 h空白對照組 B l a n k c o n t r o l g r o u p 0 . 2 1 ± 0 . 0 5 0 . 3 2 ± 0 . 0 5 0 . 4 0 ± 0 . 0 6 0 . 5 1 ± 0 . 0 5誘導組 I n d u c t i o n g r o u p 0 . 3 1 ± 0 . 0 6 0 . 4 5 ± 0 . 0 5 0 . 6 2 ± 0 . 0 7 *# 0 . 8 1 ± 0 . 0 8 *#抑制劑組 I n h i b i t o r g r o u p 0 . 1 9 ± 0 . 0 4 0 . 2 9 ± 0 . 0 6 0 . 3 9 ± 0 . 0 8 0 . 4 8 ± 0 . 0 6 Pa ＜ 0 . 0 5 ＜ 0 . 0 5 ＜ 0 . 0 0 1 ＜ 0 . 0 0 1

圖 2 IL-17A 刺激對 HaCaT 細胞凋亡的影響（A：空白對照組；B：誘導組；C：抑制劑組）Figure 2 IL-17A stimulating on effect of HaCaT cells apoptosis (A： Blank control group; B： Induction group; C： Inhibitor group)

圖 3 K17 mRNA 電泳圖Figure 3 Electrophoregram of K17 mRNA

圖 4 IL-17A 刺激對 HaCaT 細胞 K17 mRNA 表達的影響（*與空白對照組和抑制組比較，P ＜ 0.05）Figure 4 Effect of IL-17A on the expression of K17 mRNA in keratinocyte (*P ＜ 0.05, compared with control group and inhibitor group)

圖 5 IL-17A 刺激對 HaCaT 細胞 K17 蛋白表達的影響Figure 5 Effect of IL-17A on the expression of K17protein in keratinocyte

2.6 IL-17A 體外刺激對 HaCaT 細胞 STAT3 信號通路 p-STAT3 蛋白表達的影響

空白對照組、誘導組和抑制劑組 HaCaT 細胞p-STAT3 蛋白表達差異有統(tǒng)計學意義（F= 9.86，P= 0.003），與空白對照組和抑制劑組比較，誘導組的 HaCaT 細胞 p-STAT3 蛋白表達明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（LSD-t分別為 4.13 和 4.27，P＜ 0.05），見圖 7 和圖 8。

圖 6 K17 蛋白相對表達水平（*與空白對照組和抑制組比較，P ＜ 0.05）Figure 6 Expression of K17 protein (*P ＜ 0.05, compared with control group and inhibitor group)

圖 7 IL-17A 刺激對 HaCaT 細胞 p-STAT3 蛋白表達的影響Figure 7 Effect of IL-17A on the expression of p-STAT3 protein in keratinocyte

圖 8 p-STAT3 蛋白相對表達水平（*與空白對照組和抑制組比較，P ＜ 0.05）Figure 8 Expression of p-STAT3 protein (*P ＜ 0.05, compared with control group and inhibitor group)

3 討論

角蛋白是角質(zhì)細胞中的主要骨架蛋白，多于上皮細胞中表達，是上皮細胞生長、分化及成熟的重要標志物[11]。有研究表明，在銀屑病患者皮損中，KC 所表達的角蛋白譜會發(fā)生改變，K17 水平顯著升高。K17 作為銀屑病增殖相關角蛋白在正常皮膚中不表達或表達量很低，而在銀屑病患者的皮損中則是高表達，同時其表達水平與銀屑病發(fā)病過程和嚴重程度有一定相關性[12-13]。所以 K17 與銀屑病的關系非常密切，在銀屑病的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。

文獻[15]報道，來源于 Th17、Th22 細胞的IL-17A 和 IL-22 在角質(zhì)形成細胞以劑量相關性方式上調(diào) K17 mRNA 水平及蛋白水平，這些效應被STAT-1 和 STAT-3 特異抑制劑小干擾 RNA 部分阻斷[14]。在該報道中還提出存在 K17-T 細胞-細胞因子免疫環(huán)，其中異位表達 K17 通過激活自身反應性 T 細胞影響銀屑病。應用反義寡核苷酸和RNAi 抑制 K17 mRNA 和蛋白在銀屑病皮膚的表達，在臨床和組織學上均發(fā)揮對銀屑病的改善作用[15]。也有研究表明，K17 攜帶某些和鏈球菌 M6蛋白相似的表位[16]，這些表位可以激活 T 細胞增殖，如 Th1 細胞 T 細胞，活化的 T 細胞產(chǎn)生銀屑病相關細胞因子 IFN-γ，細胞因子 IFN-γ 又可以依賴 STAT1 和 STAT3 信號通路激活 KC 表達K17，繼而形成了一個反應環(huán)路再次激活 T 細胞增殖和銀屑病相關細胞因子的產(chǎn)生[17]。

Th17 細胞在銀屑病形成中發(fā)揮關鍵作用[18]，分泌的 IL-17A 通過多種途徑影響角蛋白細胞[19]，有關 IL-17A 激活 KC 中 STAT3 信號通路未見文獻報道，為此我們對 IL-17A 調(diào)控 KC 中 K17表達的具體機制做了進一步的探索。我們預先用STAT3 信號通路抑制劑白皮杉醇處理 KCs，再用IL-17A 進行刺激后發(fā)現(xiàn)，與誘導組比較，K17 mRNA 和蛋白的表達均下降，表明 IL-17A 調(diào)控K17 的表達可能是通過激活 JAK-STAT3 這條信號轉(zhuǎn)導通路實現(xiàn)的。這個結(jié)果與 STAT3 在銀屑病患者皮損 KC 中特異性高表達是一致的[20]。其調(diào)控機制是 IL-17A 通過與 KC 表面受體結(jié)合后激活 STAT3 來上調(diào) K17 的表達。IL-17A 可在角蛋白水平上參與促進銀屑病的發(fā)生發(fā)展，進一步肯定了 Th 細胞及其細胞因子在銀屑病中的作用。為銀屑病的發(fā)病機制研究和將來對細胞因子、信號通路的抗銀屑病臨床治療提供新的靶點和思路。

綜上所述，K17 在 T 細胞免疫調(diào)節(jié)下，通過STAT3 信號轉(zhuǎn)導通路調(diào)節(jié)細胞增殖和凋亡，活化相關生長因子，在促進銀屑病發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，為銀屑病的發(fā)病機制研究提供了理論依據(jù)。

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www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2017, 12(6):526-531

Effect of interleukin-17A on keratin 17 in keratinocyte and its molecular mechanismin vitro

SHI Lei, WEI Ming

ObjectiveTo explore the effect of IL-17A on the expression of K17 in keratinocytes (KCs) and its molecular mechanism.

MethodsIL-17A (50 μg/L) was used to stimulate the KCs for 12 to 48 h, and three groups were divided that included control group, induction group and both induction and inhibitor (abbreviated as inhibitor) group. MTT assay was used to detect the proliferation. Flow cytometry was used to test apoptosis. Real-time PCR and Western blot were used to detect K17 mRNA and protein levels, as well as STAT3 signaling pathway.

ResultsHaCaT cell proliferation was different among the blank control group, induction group and inhibitor group, as tested by MTT (F= 8.47,P= 0.006). The apoptosis rate of HaCaT cells was (15.34% ± 1.32%), (5.96% ± 0.68%) and (15.62% ± 1.26%) in the blank control group, induction group and inhibitor group, respectively (F= 26.48,P= 0.001). K17 mRNA and protein expression levels were statistically significant among the three groups (F= 10.25,P= 0.001 for mRNA andF= 11.62,P= 0.001 for protein, respectively). The p-STAT3 protein expression was statistically significant as well (F= 9.86,P= 0.003).

Conclusions IL-17A can up-regulate the expression of K17 in KC, and its specific regulation mechanism is by the activation of STAT3. Our experimental results prove that IL-17A takes part in the pathogenesis of psoriasis on the level of keratin. This work provides a new strategy toward pathogenesis and remedy in psoriasis.

Interleukin-17; Psoriasis; Th17 cells; Keratin17; STAT3 transcription factor

Author Affiliation:Department of Pharmacy, The Fifth Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, China

WEI Ming, Email： gushiweiming@126.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2017.06.006

450052 鄭州大學第五附屬醫(yī)院藥學部

魏明，Email：gushiweiming@126.com

2017-09-13

www.cmbp.net.cn 中國醫(yī)藥生物技術(shù), 2017, 12(6):526-531