胡馨月，李艷萍，李卓榮

抗體藥物偶聯(lián)物的彈頭分子研究進(jìn)展

胡馨月，李艷萍，李卓榮

在腫瘤治療中，化療為主要的治療手段，在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也對(duì)正常細(xì)胞存在殺傷作用，從而產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副作用。如何將細(xì)胞毒性藥物準(zhǔn)確輸送到病灶部位，選擇性地殺傷腫瘤細(xì)胞，漸漸引起了人們的重視。追溯到 100 年前，Paul Ehrlich 就提出了利用抗體靶向治療癌癥的“魔術(shù)子彈”概念[1]。隨著抗體技術(shù)的發(fā)展，掀起了抗體藥物偶聯(lián)物（antibody-drug conjugate，ADC）的研究浪潮，ADC 是抗體與細(xì)胞毒藥物的完美“聯(lián)姻”。ADC 是由“抗體”、“連接子”和“彈頭分子”三個(gè)主要組件構(gòu)成，抗體藥物偶聯(lián)物能夠特異性識(shí)別腫瘤抗原，形成的 ADC-抗原復(fù)合物通過受體介導(dǎo)的胞吞作用進(jìn)入靶細(xì)胞內(nèi)部，釋放出高活性的彈頭分子，完成對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性殺傷（圖 1）[2]。

圖 1 抗體藥物偶聯(lián)物的作用機(jī)制

理論上說化療藥物、細(xì)胞毒素、放射性核素等對(duì)腫瘤細(xì)胞具有較大殺傷作用的細(xì)胞毒性物質(zhì)都可以作為 ADC 的彈頭分子，通常必須同時(shí)具備以下三點(diǎn)特征：①作用機(jī)制明確。基于 ADC 的作用機(jī)制，理想的彈頭分子的靶點(diǎn)應(yīng)位于細(xì)胞內(nèi)，如抗有絲分裂或者抑制 DNA 復(fù)制。②彈頭分子的細(xì)胞毒作用必須極高，一般要求 EC50小于 1 nmol/L。研究表明放射標(biāo)記的抗體在癌癥病人腫瘤部位攝取量很低（每克腫瘤組織僅僅集中 0.003% ～ 0.01% 的抗體注射劑量）[3]，所以彈頭分子需在較低濃度下也可發(fā)揮作用。③可以被修飾，允許被連接。天然發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞毒藥物往往沒有可以連接的位點(diǎn)，大多數(shù)需經(jīng)過結(jié)構(gòu)改造，使之成為具有可連接的基團(tuán)且與天然結(jié)構(gòu)生物活性相當(dāng)?shù)难苌铩?/p>

為降低傳統(tǒng)的化療藥物（如甲氨蝶呤、環(huán)磷酰胺、長(zhǎng)春堿類、紫杉烷類）毒副作用，增加它們的靶向性，在設(shè)計(jì)第一代抗體藥物偶聯(lián)物時(shí)，人們?cè)鴩L試將它們偶聯(lián)在抗體上。之后很快發(fā)現(xiàn)，這類 ADC 在臨床使用中無法達(dá)到預(yù)期的抗腫瘤活性，甚至低于化療藥物本身的效能[4]，其主要原因在于 ADC 經(jīng)注射后富集于靶部位的劑量低，加之化療藥物本身細(xì)胞毒性不夠強(qiáng)，治療效果大大減弱。隨之研究人員在植物、海洋生物和微生物等天然來源的化合物中尋找新型高效細(xì)胞毒性化合物，研究發(fā)現(xiàn)某些化合物在體外對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的抑制活性比傳統(tǒng)化療藥物高 100 ～ 1000 倍[5]，IC50值能夠達(dá)到 pmol/L 水平。這些細(xì)胞毒素由于治療安全窗范圍較窄，不能作為藥物單獨(dú)使用，故可以考慮用來做 ADC的彈頭分子發(fā)揮作用。本文將對(duì)目前臨床在研 ADC 彈頭分子的進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 微管蛋白抑制劑

1.1 海兔毒素及奧瑞他汀類

海兔毒素（dolastatin）是從印度洋生物截尾海兔中發(fā)現(xiàn)的一類具有高細(xì)胞毒性的線性多肽類化合物。Pettit 等[6]表征了海兔毒素中多種毒性組分，并且闡明了海兔毒素 10 的作用機(jī)制和結(jié)構(gòu)（圖 2，1），這類細(xì)胞毒藥物能夠顯著抑制微管蛋白的形成和聚合。海兔毒素 10 對(duì)白血病細(xì)胞L1210（IC50= 0.5 nmol/L）等腫瘤細(xì)胞具有普遍殺傷能力，對(duì)細(xì)胞的抑制活性約為長(zhǎng)春堿的 40 倍，根霉素的 2 倍，擬莖點(diǎn)霉毒素 A 的 10 000 余倍[7]，然而海兔毒素 10 在單獨(dú)使用時(shí)存在毒副作用大、藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)差、治療窗口窄等問題限制了其開發(fā)。Miyazaki 等[8]發(fā)現(xiàn) N 端為仲胺的單甲基奧瑞他汀 D（monomethyl auristatin D，MMAD）毒性與海兔毒素 10 相當(dāng)，將這類 N-單甲基取代的海兔毒素衍生物命名為奧瑞他汀類（auristatin），它們可實(shí)現(xiàn)與連接子的有效連接，新一代的高效 ADC 也由此產(chǎn)生[9]。

圖 2 海兔毒素類細(xì)胞毒藥物和 MMAE、MMAF 類抗體藥物偶聯(lián)物

目前，ADC 研發(fā)常用的彈頭分子為奧瑞他汀類化合物MMAE 和 MMAF（圖 2，2 和 3）。與 MMAD 相比，MMAE 的 C 端為 2-氨基-1-苯基丙基-1-醇，IC50值為10-11～ 10-9mol/L。由 Seattle Genetics 公司研發(fā)的治療霍奇金淋巴瘤和系統(tǒng)型間變性大細(xì)胞淋巴瘤的 Adcetris（SGN-35）在 2011 年已被 FDA 批準(zhǔn)上市，該藥為抗CD30 人鼠嵌合抗體，采用纈氨酸-瓜氨酸（Val-Cit）酶解型連接子與 MMAE 連接，通過還原抗體鏈間 4 對(duì)二硫鍵，連接 MMAE 個(gè)數(shù)為 0、2、4、6、8 不等。研究發(fā)現(xiàn)，平均藥物/抗體偶聯(lián)比以 4 為最佳，該 ADC（圖 2，4）在細(xì)胞中可以完全釋放出細(xì)胞毒藥物 MMAE[10]。II 期臨床試驗(yàn)報(bào)道，102 例患者以 1.8 mg/kg 給藥三周，霍奇金淋巴瘤病人總緩解率為 75%（34% 全響應(yīng)，40% 部分響應(yīng)），系統(tǒng)型間變性大細(xì)胞淋巴瘤病人總緩解率為 87%（53% 全響應(yīng)），治療效果顯著[11]。目前，至少 4 項(xiàng)作為一線用藥的 III期臨床試驗(yàn)仍在進(jìn)行，以期進(jìn)一步擴(kuò)大其適應(yīng)證范圍。MMAF 的 C 端為苯丙氨酸，體外細(xì)胞毒性比 MMAE 弱100 倍[12]，主要由于本身羧基的離子化，使得 MMAF 的膜通透性較差，阻礙了它擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞。以 MMAF 為彈頭分子的 ADC（圖 2，5）通常使用不可裂解型連接子馬來酰亞胺基己酸（MC），在細(xì)胞內(nèi)最終降解為帶有半胱氨酸（Cys）殘基的 MC-MMAF 形式，仍能夠保持很好的活性。目前，臨床在研 ADC 約 70 多個(gè)，以 MMAE 和 MMAF作為彈頭分子的 ADC 占有主導(dǎo)地位（表 1）。

1.2 美登素及美登素類衍生物

美登素（maytansine）是 Kupchan 等[13]于 1972 年在非洲灌木叢美登木中提取分離出來的。美登素（圖 3，6）對(duì)人口腔表皮樣癌細(xì)胞 KB 的 ED50為 10-4～ 10-5μg/ml，效果可達(dá)長(zhǎng)春花堿的 100 ～ 1000 倍，具有良好的穩(wěn)定性和溶解性。由于天然的美登素結(jié)構(gòu)中沒有連接基團(tuán)，經(jīng)研究者對(duì)美登素的構(gòu)效關(guān)系深入探究之后，C3 位可被改造為末端有巰基的新型酯類連接位點(diǎn)[14]。DM1 和 DM4（圖 3，7 和8）正是對(duì) C3 位修飾后的一類美登素衍生物，此類化合物是由發(fā)酵得來的安絲菌素還原成美登醇，C3 位與連有二硫鍵的酸縮合，最終還原成末端巰基得到。

表 1 批準(zhǔn)上市和臨床在研的奧瑞他汀類 ADC

圖 3 美登素類細(xì)胞毒藥物和 DM1、DM4 類抗體藥物偶聯(lián)物

以美登素類作為彈頭分子的 ADC 一般采用與抗體賴氨酸殘基偶聯(lián)的方式，DM1 型 ADC（圖 3，9）通常使用不可裂解型雙功能連接子 SMCC（N-succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate），在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)溶酶體降解為 Lys-SMCC-DM1 形式。DM4 型 ADC（圖3，10）一般使用可裂解型連接子為 SPDB（N-succinimidyl 4-(2-pyridyldithio) butyrate） 或 SPP（ N-succinimidyl 4-(2-pyridyldithio) pentanoate），在細(xì)胞內(nèi)首先分解為L(zhǎng)ys-SPDB/SPP-DM4，再經(jīng)內(nèi)源性谷胱甘肽還原，二硫鍵斷裂成 SH-DM4，直接發(fā)揮作用或部分甲基化發(fā)揮更強(qiáng)的抗腫瘤作用。Kadcyla（T-DM1）即曲妥珠單抗-SMCC-DM1，在 2013 年批準(zhǔn)治療轉(zhuǎn)移性晚期乳腺癌，對(duì)于 HER-2 陽性晚期乳腺癌病人使用 T-DM1 組較曲妥珠單抗與紫杉烷組毒副作用顯著降低，針對(duì)病人無進(jìn)展生存時(shí)間和總生存時(shí)間均優(yōu)于拉帕替尼與卡培他濱聯(lián)合用藥組[15]。另外，該藥用于晚期胃癌、非小細(xì)胞肺癌等疾病的治療也進(jìn)入臨床研究中。以美登素類細(xì)胞毒藥物為彈頭分子進(jìn)入臨床評(píng)價(jià)的ADC 如表 2 所示。

表 2 臨床在研和已上市美登素類抗體藥物偶聯(lián)物

圖 4 卡奇霉素類和卡奇霉素類抗體藥物偶聯(lián)物

2 DNA 損傷劑

2.1 卡奇霉素類

卡奇霉素（calicheamicin）（圖 4，11）是一類作用于DNA 的抗腫瘤抗生素，1986 年從棘孢小單孢菌中得到的發(fā)酵產(chǎn)物[16]，屬于典型的烯二炔類化合物，結(jié)構(gòu)中含有一個(gè) 1,5-二炔-3-烯母核，一個(gè)全取代的苯，四個(gè)糖苷和一個(gè)特殊的三硫鍵?？ㄆ婷顾赝ㄟ^低聚糖片段與 DNA 結(jié)合，嵌入 DNA 雙螺旋小溝的 5'-TCCT-3' 和 5'-TTTT-3' 位點(diǎn)，烯二炔結(jié)構(gòu)通過 Bergman 環(huán)化發(fā)生電子重排，關(guān)環(huán)成苯環(huán)雙自由基，奪取 DNA 鏈上的 H 原子，導(dǎo)致 DNA 鏈斷裂。其中，研究發(fā)現(xiàn)卡奇霉素 γ1I對(duì)體內(nèi)多種腫瘤有著極好的效能，使用劑量最低達(dá)到 0.15 μg/kg[17]?；诳ㄆ婷顾?γ1I良好的抗腫瘤特性，設(shè)計(jì)了一種卡奇霉素衍生物 N-乙酰基-γ-卡奇霉素，天然的三硫鍵結(jié)構(gòu)改造為二硫鍵，可實(shí)現(xiàn)與腙鍵型或酰胺型的連接子的連接[18]。FDA 批準(zhǔn)上市的第一個(gè)ADC 藥物 Mylotarg 就是通過腙鍵型連接子將抗 CD33的吉妥珠單抗與 N-乙?；?γ-卡奇霉素-DMH 偶聯(lián)（圖 4，12a），2009 年被批準(zhǔn)治療急性髓系白血病。臨床使用中，該藥在 9 mg/m2的劑量下，大約有 30% 的患者得到完全緩解，但隨后發(fā)現(xiàn)它存在連接子不穩(wěn)定，抗體 FAB 段與血清抗體易發(fā)生交換等問題，在治療過程中部分病人出現(xiàn)致命性肝損傷，迫使其于 2010 年撤市。

目前值得關(guān)注的是 CMC-544（圖 4，12b），現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)其在體外有特異性好、穩(wěn)定性強(qiáng)及活性高等優(yōu)點(diǎn)，在重癥聯(lián)合免疫缺陷小鼠多種淋巴瘤模型中，該 ADC 可以持續(xù)抑制腫瘤生長(zhǎng)近 100 d[19]，針對(duì)于急性淋巴細(xì)胞白血病的治療已進(jìn)入 III 期臨床[20]。PF-006647263（圖 4，12c）是以 ephrin A4 為靶點(diǎn)，在化學(xué)、生產(chǎn)和控制方面均進(jìn)行了合理優(yōu)化，得到平均 DAR 為 4 且沒有裸抗體存在的 ADC[21]，I 期臨床用于三陰型乳腺癌的治療。

2.2 倍癌霉素類

倍癌霉素 A（圖 5，13）和倍癌霉素 SA（圖 5，14）是 19 世紀(jì) 70 年代從鏈霉菌屬 zelensis 細(xì)菌培養(yǎng)物中分離得到[22]，該類化合物能夠嵌入 DNA 小溝中 A-T 結(jié)構(gòu)域豐富的位置，經(jīng)腺嘌呤的 N3 位進(jìn)攻其環(huán)丙基基團(tuán)，造成DNA 烷基化，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，具有抗菌、抗腫瘤功能。MDX-1203（圖 5，15）使用的倍癌霉素類似物 MED-2460是將 CBI 結(jié)構(gòu)單元（圖 5，16）苯酚改造為甲基哌嗪甲酸酯前藥形式，環(huán)丙基開環(huán)替換成氯甲基，吡咯上的 N 連接氨基取代吲哚。該 ADC 靶向于 CD70 抗原，DAR 為1.25，在腎細(xì)胞癌 786-O 裸鼠模型中，以 38 mg/kg 劑量給藥兩次后腫瘤可完全消退，I 期臨床試驗(yàn)用于治療腎上皮細(xì)胞癌和非霍奇金淋巴瘤，藥物安全性高，病人以 8 mg/kg的劑量耐受性良好[23]。SYD985（圖 5，17）選用的彈頭分子 是 倍 癌 霉 素 咪 唑 并 [1,2-α]吡 啶 系 列 衍 生 物seco-DUBA[24]，通過還原曲妥珠單抗鏈間二硫鍵偶聯(lián)，經(jīng)疏水作用層析分離后使得每個(gè)抗體平均連接 2.8 個(gè)seco-DUBA[25]，該 ADC 也已進(jìn)入 I 期臨床，治療多種非特異性實(shí)體瘤，主要是以 HER2 過表達(dá)的實(shí)體瘤為主。

圖 5 CBI 單元、倍癌霉素類和倍癌霉素類抗體藥物偶聯(lián)物

2.3 安曲霉素類衍生物 PBD

19 世紀(jì) 60 年代，從鏈霉菌屬 Streptomyces refuineus var. thermotolerans 中發(fā)酵提取分離得到安曲霉素[26]（圖 6，18），并發(fā)現(xiàn)了一類具有抗菌、抗腫瘤的結(jié)構(gòu)類似物 PBD（pyrrolobenzodiazepine，吡咯并苯并二氮雜?）家族分子，研究共發(fā)現(xiàn)了 13 種不同 PBD 天然單體類型，它們均是由吡咯環(huán) A、二氮雜? B 和芳環(huán) C 組成，通過 N10/C11 亞胺功能團(tuán)與 DNA 小溝鳥嘌呤的 C2 位氨基作用而發(fā)揮生物學(xué)功能。隨后，有人進(jìn)一步探究發(fā)現(xiàn) PBD 二聚體較 PBD與 DNA 作用面積更大，可與鳥嘌呤形成兩個(gè)共價(jià)鍵，增加了序列的選擇性[27]，且二聚體對(duì)于多種腫瘤細(xì)胞系（如乳腺癌細(xì)胞 MCF-7、卵巢癌細(xì)胞 A2780 等）的活性達(dá)到pmol/L 級(jí)別，如 DSB-120（圖 6，19）是由兩分子 DC-81（圖 6，20）通過丙二醚鍵相連，以 GATC 序列為中心橫跨了 6 個(gè)堿基對(duì)與 DNA 交聯(lián)，相對(duì)于 DC-81 單體體外活性增加了 600 倍。自 2013 年以來，PBD 二聚體這種高效作用于 DNA 的特性逐漸作為新型 ADC 彈頭分子被使用，地位僅次于海兔毒素類和美登素類。Seattle Genetics 公司研發(fā)的一系列以 PBD 為彈頭分子的 ADC 都是以酶裂解性纈氨酸-丙氨酸（VA）為連接子，通過工程化半胱氨酸的偶聯(lián)技術(shù)得到平均 DAR 為 1.9。目前有 5 個(gè)靶點(diǎn)的ADC（圖 6，21）：SGN-CD33A、SGN-CD70A、SGN-CD19B、SGN-CD123A、SGN-352A 分別治療急性髓系白血?。↖II期）[28]、腎上皮細(xì)胞癌（II 期）[29]、非霍奇金淋巴瘤（I 期）、急性髓系白血?。↖ 期）和多發(fā)性骨髓瘤（I 期）。

2.4 喜樹堿類衍生物 SN-38

喜樹堿（圖 7，22）通過作用于 DNA 拓?fù)洚悩?gòu)酶 ? 抑制 DNA 的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡，具有強(qiáng)體外抗腫瘤活性。然而，喜樹堿水溶性差，內(nèi)酯環(huán)易開環(huán)，從而降低了生物利用度，限制其臨床應(yīng)用。設(shè)計(jì)帶有哌嗪環(huán)前藥的喜樹堿類衍生物伊立替康（圖 7，23），它在體內(nèi)以關(guān)閉的內(nèi)酯和開環(huán)的羧酸鹽兩種形式存在，代謝產(chǎn)物 SN-38（圖 7，24）為主要的抗腫瘤成分。SN-38 的 C20 位羥基除了能夠降低內(nèi)酯環(huán)在體內(nèi)降解速率外，還可以與連接子相連用于 ADC 的開發(fā)。Labetuzumab-SN-38（IMMU-130，圖 7，25a）為抗 CD66-CL2（賴氨酸-苯丙氨酸）-SN-38，臨床前研究顯示其可顯著延長(zhǎng)直腸癌和胰腺癌小鼠生存率，目前 II 期臨床治療復(fù)發(fā)/難治型結(jié)腸癌。IMMU-132（圖7，25b，抗 Trop-2-SN-38）是通過 CL2A（賴氨酸，Lys）型連接子連接人源化單抗 hRS7 和 SN-38，由于 Trop-2 抗原能夠廣泛表達(dá)在腫瘤滋養(yǎng)層細(xì)胞表面[30]，因此 IMMU-132在大腸癌、食管癌、三陰性乳腺癌、小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌患者中均取得了部分響應(yīng)。

圖 6 安曲霉素、PBD 類和 PBD 類抗體藥物偶聯(lián)物

圖 7 喜樹堿類和 SN-38 類抗體藥物偶聯(lián)物

3 結(jié)語

ADC 解決了細(xì)胞毒藥物選擇性差的問題，使得某些細(xì)胞毒性過強(qiáng)的藥物有了用武之地，同時(shí)也為腫瘤的靶向治療提供了更多的選擇和手段。尋找合適的新型 ADC 彈頭分子，從細(xì)胞毒藥物的發(fā)現(xiàn)及其作用機(jī)制的探究，再到結(jié)構(gòu)改造和構(gòu)效關(guān)系研究，這一過程具有巨大挑戰(zhàn)性。而且，采用何種連接技術(shù)以及相應(yīng)的連接子也是解決這些問題的關(guān)鍵，抗體除了半胱氨酸和賴氨酸偶聯(lián)的方法外，為降低產(chǎn)品的異質(zhì)性問題，引入非天然氨基酸、工程化半胱氨酸和定點(diǎn)突變等技術(shù)均有報(bào)道[31-32]；連接子的優(yōu)化著重在于增加水溶性和穩(wěn)定性，如能夠被 β-葡萄糖醛酸水解的葡萄糖醛酸型連接子[33]，降低細(xì)胞毒藥物脫靶的雙功能二硫橋連接子[34]等將為理想 ADC 的設(shè)計(jì)提供有效策略。總之，隨著新技術(shù)和新策略的不斷涌現(xiàn)，ADC 在腫瘤甚至其他疾病治療中的應(yīng)用將會(huì)蓬勃發(fā)展。

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2017-09-04