林永潔

摘 要：大腸菌群是評(píng)價(jià)食品衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標(biāo)之一。檢測(cè)結(jié)果其定義為：需氧及兼性厭氧、在37℃能分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革蘭氏染色陰性無(wú)芽孢桿菌。本文闡述了兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)版本的大腸菌群檢測(cè)中的檢測(cè)步驟、方法對(duì)比及染色鏡檢技巧。

關(guān)鍵詞：大腸菌群 檢測(cè) 技巧

大腸菌群的測(cè)定，在實(shí)際工作中存在不同檢測(cè)方法。GB/T4289.3-2003、GB4789.3-

2016版都是現(xiàn)行有效的兩個(gè)版本的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。盡管方法各異，但乳糖發(fā)酵卻是這些不同方法中的共同點(diǎn)。

一、大腸菌群檢測(cè)

1、培養(yǎng)基準(zhǔn)備：培養(yǎng)基 GB/T4789.03—2003：乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基，伊紅美蘭瓊脂，乳糖復(fù)發(fā)酵培養(yǎng)基。GB 4789.03—2016：月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯（LST），煌綠膽鹽肉湯（BGLB）。儀器超凈工作臺(tái)、生化培養(yǎng)箱、顯微鏡。

2、實(shí)驗(yàn)原理和方法

2.1檢驗(yàn)步驟

依據(jù)GB/T4789.3—2003（食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群測(cè)定，檢驗(yàn)主要有以下步驟：

（1）接種：以無(wú)菌操作取均勻后檢樣25 mL（g）放于含有 225 mL滅菌生理鹽水的滅菌三角燒瓶中，經(jīng)充分振搖做成1：l0的均勻稀釋樣液。根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求和對(duì)樣品污染情況的判斷，選擇3個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種3管，放置36℃±l℃的生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24±2h。

（2）平板分離：將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別劃線(xiàn)在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，置36℃±l℃的生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24±2h。

（3）染色和證實(shí)：觀察菌落形態(tài)，并做革蘭氏染色鏡檢。革蘭氏染色陰性的無(wú)芽胞桿菌的試管接種乳糖發(fā)酵管，置于36℃±1℃的生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24±2h。

（4）結(jié)果報(bào)告：凡是乳糖管產(chǎn)氣、革蘭氏染色陰性的無(wú)芽胞桿菌，判定該管為大腸菌群陽(yáng)性。根據(jù)大腸菌群陽(yáng)性的管數(shù)，查 MPN檢索表，乘以稀釋倍數(shù)，報(bào)告每100 mL（g）樣品中大腸菌群的MPN值。

2.2測(cè)試步驟

依據(jù)GB 4789.3—2016 （食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群測(cè)定》，測(cè)試主要有以下步驟：（1）接種：以無(wú)菌操作取均勻后檢樣25 mL（g）放入盛有225mL滅菌磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無(wú)菌均質(zhì)杯中，經(jīng)充分振搖做成1：10的均勻稀釋樣液。根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求和對(duì)樣品污染情況的判斷，根據(jù)污染情況判斷，依次制成十倍遞增系列稀釋樣品勻液，選擇3個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種3管LST，放置 36±1℃的生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24±2h。（2）證實(shí)：將產(chǎn)氣的發(fā)酵管挑取一環(huán)菌液接種BGLB管，放置36±l℃的生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48±2h。（3）結(jié)果報(bào)告：根據(jù)大腸菌群陽(yáng)性的管數(shù)，查MPN檢索表，乘以稀釋倍數(shù)，報(bào)告每l mL（g）樣品中大腸菌群的MPN值。在MPN檢索表第一欄陽(yáng)性管數(shù)下面列出的mL（g），系指原樣品（包括液體和固體）的mL（g）數(shù)，并非樣品稀釋后的mL（g）數(shù)，對(duì)固體樣品理應(yīng)注意固體樣品的接種量。

樣品1 g經(jīng)10倍稀釋后，雖加入1 mL 量，但其實(shí)際其中只含有0.1 g樣品，故應(yīng)按0.1 g記，不應(yīng)按 1 mL記。接種第一梯度1g×3的樣量是10倍稀釋液的10mL。

二、2003版與2016版的大腸菌群檢測(cè)新方法對(duì)比

2003版大腸菌群檢驗(yàn)步驟檢驗(yàn)采用三步（即乳糖發(fā)酵試驗(yàn)、分離培養(yǎng)和證實(shí)試驗(yàn)）.在食品檢驗(yàn)上，除個(gè)別情況外，一般來(lái)說(shuō)，如果平板上有較多典型大腸菌群菌落，革蘭氏染色為陰性桿菌，即可做出判定。如平板上典型菌落甚少或均不夠典型，則應(yīng)多挑菌落做證實(shí)試驗(yàn)，以免出現(xiàn)假陰性。只作一步初發(fā)酵，對(duì)某些食品來(lái)說(shuō)，誤差是比較大的。這樣做，會(huì)有相當(dāng)部分的合格樣品被作為不合格樣品處理，應(yīng)予注意。

2016版大腸菌群檢測(cè)新方法與國(guó)際接軌，檢驗(yàn)新技術(shù)進(jìn)入國(guó)標(biāo)行列，它釆用了LST一BGLB進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。接種LST肉湯初發(fā)酵培養(yǎng)，如產(chǎn)酸、產(chǎn)氣將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種于BGLB肉湯培養(yǎng)，根據(jù)其陽(yáng)性管數(shù)查閱MPN檢索表即可得到檢測(cè)結(jié)果。2003版大腸菌群檢測(cè)方法為經(jīng)典方法，類(lèi)似實(shí)驗(yàn)中仲裁法；2016版方法簡(jiǎn)便易行便于初學(xué)者（企業(yè)出廠檢驗(yàn)人員）操作。類(lèi)似實(shí)驗(yàn)中的快速測(cè)定，省時(shí)省力可提高速度與效率。在實(shí)際工作的檢測(cè)中比對(duì)，兩種方法并存結(jié)果不存在明顯差異。

三、大腸菌群實(shí)驗(yàn)技巧

革蘭氏染色鏡檢依據(jù)GB/T4789.3—2003標(biāo)準(zhǔn)。

典型菌落挑選→革蘭氏染色鏡檢

3.1菌落挑選：在EMB平板上挑選典型菌落進(jìn)行鏡檢

大腸桿菌菌落呈黑紫色有光澤或無(wú)光澤時(shí)，檢出率最高；紅色、粉紅色菌落檢出率較低。

挑取菌落數(shù)與大腸桿菌的檢出率密切相關(guān)。

3.2革蘭氏染色鏡檢

實(shí)際操作步驟技巧關(guān)鍵點(diǎn)在脫色。

（1）涂片：均勻而薄。

（2）固定：火焰固定時(shí)溫度適宜，把涂片在酒精燈火焰上方、左右或以旋轉(zhuǎn)方式快速通過(guò)，將涂片觸碰手握拳頭時(shí)虎口處，以不熾熱為度，過(guò)熱則鏡檢時(shí)菌體變形，不利于觀察及判定。

（3）初染：滴加結(jié)晶染液1分鐘完成，傾斜用細(xì)水流沖洗待干。

（4）媒染：滴加碘液媒染，水洗。

（5）脫色：掌握脫色度是染色成敗的關(guān)鍵，G-菌細(xì)胞壁含有較多被乙醇溶解的類(lèi)脂質(zhì)，而且肽聚糖質(zhì)較薄，交聯(lián)度低，用95%的乙醇脫色溶解了類(lèi)脂質(zhì)增加細(xì)胞通透性，使被染的結(jié)晶紫和碘復(fù)合物易于滲出，結(jié)果G-菌脫去初染的紫色，復(fù)染上蕃花花紅的顏色，所以菌體呈紅色。在實(shí)際操作中薄而均勻的涂片上滴加95%的乙醇約20至30秒，流出液體無(wú)色時(shí)終止脫色，否則脫色過(guò)度會(huì)造成G+誤判為G-菌。

（6）沙黃復(fù)染液（番紅花紅）復(fù)染。

（7）沖洗：玻片傾斜，用穩(wěn)定的細(xì)流沖洗。

（8）涂片宜挑取培養(yǎng)18～24h菌落，老齡化的G-菌呈G+菌，工作中注意避免出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性。

（9）鏡檢用10 ×100 油鏡進(jìn)行鏡檢，香柏油與載玻片的折射率相近，滴加香柏油會(huì)使通透性增加，在鏡檢中可觀察到清晰的物象。在載玻片所要觀察部位滴上一滴香柏油，換上油鏡，小心調(diào)節(jié)粗準(zhǔn)焦螺旋，使油鏡慢慢下降或慢慢上升載合物臺(tái)，從側(cè)面觀察油鏡下端與標(biāo)本之間的距離，當(dāng)油鏡下端開(kāi)始觸及油滴時(shí)即可停止。從目鏡觀察，用手調(diào)節(jié)粗準(zhǔn)焦螺旋，即可觀察到清晰的標(biāo)本物像。

參考文獻(xiàn)

[1]中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.3-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)》.

[2]《食品微生物檢測(cè)工作指南》中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社 2012年.