顏未 唐方東 何林鋒 陳建新 忻智煒 孫訓(xùn) 黃志 蒯琳萍

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γ輻射對青海弧菌Q67發(fā)光強(qiáng)度的影響

顏未1唐方東2何林鋒2陳建新2忻智煒2孫訓(xùn)2黃志1蒯琳萍1

1（上海交通大學(xué) 上海 200240） 2（上海市計(jì)量技術(shù)測試研究院 上海 201203）

采用60Co γ射線源對青?；【鶴67輻照，研究了輻射劑量（率）對其發(fā)光強(qiáng)度的影響。實(shí)驗(yàn)表明，在0.05 Gy?min?1、0.1 Gy?min?1、0.2 Gy?min?1三種劑量率下，青?；【鶴67經(jīng)過短時(shí)間的照射后，其發(fā)光強(qiáng)度明顯受到抑制。劑量率()和照射時(shí)間()兩個(gè)變量中，的增加對于青?；【鶴67發(fā)光強(qiáng)度影響更大，并且通過軟件SPSS19.0進(jìn)行回歸擬合分析，發(fā)現(xiàn)青?；【鶴67的相對發(fā)光值(LV)與和的自然對數(shù)值呈現(xiàn)二元線性關(guān)系。最后，以0.2 Gy?min?1的劑量率梯度為對象，測定了輻照后青?；【鶴67光密度(OD600)的變化，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過不同短時(shí)間輻照后相對光密度(OD)也受到抑制，說明輻照引起的青海弧菌Q67菌體的損傷和死亡是其發(fā)光強(qiáng)度抑制的重要原因。研究表明，青?；【鶴67對于γ輻照有較好的敏感性，可以作為一種潛在的評價(jià)γ射線對生命體危害的生物材料。

青?；【鶴67，60Co，輻射劑量，相對發(fā)光值，OD600

隨著我國核電行業(yè)的高速發(fā)展，內(nèi)陸核電建設(shè)的提出，輻射對生態(tài)安全的影響越來越受到國民的關(guān)注，其中對輻射的監(jiān)測和危害評價(jià)是重要環(huán)節(jié)[1?3]。在傳統(tǒng)的監(jiān)測方法中多采用理化方法，比如輻射探測儀，這種方法雖然測量精度高，但是不能直觀地反映出對生命體的影響，因此建立起一套快速、準(zhǔn)確的生物監(jiān)測方法，對于研究輻射對生態(tài)安全的影響十分重要。

發(fā)光細(xì)菌，因?yàn)槠渥陨砟軌虬l(fā)射可見熒光，當(dāng)外界環(huán)境偏離正常時(shí)發(fā)光強(qiáng)度就立刻發(fā)生改變，因此自20世紀(jì)70年代以來，就被廣泛應(yīng)用于生物毒性的測定[4]。常用的發(fā)光細(xì)菌為：明亮發(fā)光桿菌(Photobacteriumphosphoreum T3, spp.)、費(fèi)氏弧菌(Vibrio fischeri)和青海弧菌Q67 (Vibrio Qinghaiensis sp. Q67)。其中，青海弧菌Q67是世界上唯一一種淡水發(fā)光弧菌，它對NaCl濃度要求低，并且比海洋發(fā)光細(xì)菌有更寬的適應(yīng)溫度[4?5]。目前已經(jīng)對重金屬、抗生素、紫外線、農(nóng)藥等的毒性測試做了深入的研究[6?8]。鄭敬民等[9]報(bào)道了細(xì)菌培養(yǎng)液的光密度(OD600)與其中細(xì)菌的量成正相關(guān)，可以作為菌體的生長指標(biāo)。然而，發(fā)光細(xì)菌法應(yīng)用于電離輻射的毒性測試研究很少，并且研究對象都是采用海洋發(fā)光細(xì)菌[10?12]，對于青?；【鶴67在輻射下的毒性研究還沒有涉及。

因此，本文以青?；【鶴67為研究對象，通過采用60Co γ輻射源對其進(jìn)行短時(shí)間的照射，研究不同劑量（率）對青海弧菌Q67發(fā)光強(qiáng)度的影響，并對輻照后的青海弧菌Q67進(jìn)行了轉(zhuǎn)接培養(yǎng)，測定其OD600值的變化，對γ輻射對發(fā)光強(qiáng)度影響的原因進(jìn)行初步探討，為青?；【鶴67應(yīng)用于電離輻照危害的監(jiān)測提供一些前期的數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種

青?；【鶴67凍干粉，購買于濱松光子學(xué)商貿(mào)（中國）有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備

發(fā)光細(xì)菌檢測儀（BHP9514，濱松光子學(xué)商貿(mào)（中國）有限公司）；60Co γ射線源（50 TBq，由上海市計(jì)量測試技術(shù)研究院提供）；紫外可見分光光度計(jì)（CARY 1E，由上海市計(jì)量測試技術(shù)研究院提供）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)液的配制

培養(yǎng)液：MgSO42.47 g，MgCO30.79 g，MgBr20.09 g，MgCl20.09 g，CaCO30.03 g，KCl 0.22 g，NaCl 8.29 g，Mg(HCO3)20.50 g，酵母膏5 g，胰胨5 g，甘油3 g，溶于1000 mL超純水中，塞上棉球，用牛皮紙包扎好，經(jīng)121oC高溫高壓滅菌30 min后備用[5]。

1.3.2 相對發(fā)光值的測定

從低溫冰箱中取出青?；【鶴67凍干粉置于室溫環(huán)境放置15 min，之后每支青?；【鶴67凍干粉劑瓶中取0.52 mL的復(fù)蘇液（溶質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8% NaCl溶液）加入，溶解后的菌液置于室溫下10 min，使其完全復(fù)蘇，隨后再加入0.5 mL溶質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.8% NaCl溶液，充分搖勻。

復(fù)蘇好的青海弧菌Q67菌液立即用于輻照測試，用移液槍取菌液到發(fā)光細(xì)菌檢測儀配套的試管中，每個(gè)試管25 μL，并且加入2 mL溶質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.8% NaCl溶液振蕩搖勻。

將配制好的測試試管立即置于發(fā)光細(xì)菌檢測儀中測定并記錄每支試管中青?；【鶴67的原始發(fā)光強(qiáng)度，剔除發(fā)光強(qiáng)度相對偏差大于5%的試管。隨后將測試試管分為對照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組受到γ輻射源照射，對照組置于相同環(huán)境下不接受照射。對照組和每個(gè)實(shí)驗(yàn)組均設(shè)置三個(gè)平行樣。

經(jīng)過照射后的實(shí)驗(yàn)組與對照組一起置于發(fā)光細(xì)菌檢測儀中測定青?；【鶴67的發(fā)光強(qiáng)度，照射結(jié)束時(shí)刻為時(shí)間坐標(biāo)原點(diǎn)，由于操作處理需要時(shí)間，所以發(fā)光強(qiáng)度的測量從輻照后的5 min處開始，此后每5 min監(jiān)測一次數(shù)據(jù)，連續(xù)記錄1 h。實(shí)驗(yàn)結(jié)果最終以相對發(fā)光值(LV)表示，其計(jì)算如下[13]：

式中：irra為實(shí)驗(yàn)組輻照后青?；【鶴67的發(fā)光強(qiáng)度平均值；cont為對照組在相同時(shí)刻青?；【鶴67發(fā)光強(qiáng)度平均值。

1.3.3 OD600的測定

同§1.3.1，取完全復(fù)蘇的青海弧菌Q67菌液25μL加入測試試管中，加入2 mL 溶質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.8% NaCl溶液振蕩搖勻，并立即置于發(fā)光細(xì)菌檢測儀中讀取每支試管的原始發(fā)光強(qiáng)度，剔除發(fā)光強(qiáng)度相對偏差大于5%的試管。

隨后將實(shí)驗(yàn)組放于60Co源接受輻照，而對照組置于相同環(huán)境下不接受照射。對照組和每個(gè)實(shí)驗(yàn)組均設(shè)置三個(gè)平行樣。

輻照結(jié)束后，從每支測試試管中立即取50 μL菌液加入到10 mL的離心管中，并加入5 mL培養(yǎng)液，置于生化培養(yǎng)箱22 oC恒溫培養(yǎng)。經(jīng)過20 h培養(yǎng)后，采用紫外可見分光光度計(jì)測定OD600值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以O(shè)D600的相對光密度(OD)表示：

式中：OD600,irra為實(shí)驗(yàn)組經(jīng)過輻照后培養(yǎng)20 h測得的OD600平均值；OD600,cont為對照組培養(yǎng)20 h測得的OD600平均值。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

2.1 γ輻照對相對發(fā)光值的影響

經(jīng)過60Co源照射后，9個(gè)劑量（率）梯度下青?；【鶴67的相對發(fā)光值隨輻照后時(shí)間的變化曲線如圖1所示。

在0.05 Gy?min?1劑量率下，當(dāng)照射時(shí)間為2 min（累積劑量0.1 Gy）時(shí)，青?；【鶴67的相對發(fā)光值在輻照后的30 min內(nèi)大于1，30 min后出現(xiàn)下降，但下降幅度很小。當(dāng)照射時(shí)間增加到10 min和20min時(shí)，青?；【鶴67的發(fā)光強(qiáng)度開始受到抑制，即相對發(fā)光值小于1，見于圖1(a)。

圖1(b)和(c)中，劑量率分別為0.1 Gy?min?1和0.2 Gy?min?1，可以看出，輻照后的青海弧菌Q67，發(fā)光強(qiáng)度立即受到明顯抑制，說明這些劑量梯度下的γ照射對青海弧菌Q67產(chǎn)生了急性的毒性和損傷。并且觀察到，相對發(fā)光值隨輻照后時(shí)間的增加不斷下降，但是下降速率先快后慢，在0.1 Gy?min?1、0.2 Gy?min?1的兩種劑量率下，相對發(fā)光值下降較快的時(shí)間段依次為輻照后的15 min和20 min。

圖1 輻照后青?；【鶴67相對發(fā)光值隨時(shí)間變化 (a?c) 分別在特定劑量率下照射不同時(shí)間，劑量率依次為0.05 Gy?min?1、0.1 Gy?min?1、0.2 Gy?min?1，(d) 不同劑量率下照射累積劑量1 Gy

Fig.1 Effects onLVof Q67 with time after irradiation. (a?c) Irradiation with different time at certain does rate: (a) 0.05 Gy?min-1, (b) 0.1 Gy?min-1, (c) 0.2 Gy?min-1, (d) Irradiation with different dose rates at total dose of 1 Gy

參照我國水質(zhì)檢測的發(fā)光細(xì)菌國家標(biāo)準(zhǔn)方法(GB/T15441-1995)和ISO國際標(biāo)準(zhǔn)，對于急性毒性的檢測一般采用引入毒性物質(zhì)15 min后的相對發(fā)光值來作為衡量值[13?14]。并且結(jié)合圖1中各實(shí)驗(yàn)組下相對發(fā)光值隨輻照后時(shí)間的變化曲線，可以看出，在15 min時(shí)能夠明顯區(qū)分不同的照射條件。所以以青?；【鶴67在照射后15 min的相對發(fā)光值作為研究對象，進(jìn)一步討論分析γ射線劑量率和照射時(shí)間兩個(gè)變量對于青?；【鶴67相對發(fā)光值的影響。

2.1.1 同一劑量率下不同照射時(shí)間對相對發(fā)光值的影響

表1為不同劑量梯度下，青?；【鶴67在輻照5 min和15 min后的相對發(fā)光值。由表1可知，在劑量率相同時(shí)，青?；【鶴67的相對發(fā)光值隨著照射時(shí)間（即累積劑量）的增加而下降，其下降速率不斷變慢。0.05 Gy?min?1劑量率照射下，當(dāng)照射時(shí)間由2 min增加到10 min再增加到20 min時(shí)，輻照后15 min（下同），青?；【鶴67的相對發(fā)光值分別下降了0.08和0.04；0.1Gy?min?1劑量率照射下，照射時(shí)間由2 min增加到5 min、10 min時(shí)，青?；【鶴67的相對發(fā)光值分別下降0.09、0.06；0.2Gy?min?1劑量率照射下，照射時(shí)間由1 min增加到5min、10 min時(shí)，青?；【鶴67的相對發(fā)光值下降了0.14和0.05。為了更加直觀地分析，采用SPSS19.0進(jìn)行回歸分析，發(fā)現(xiàn)同一劑量率下，在受到照射后的15 min，青?；【鶴67的LV與照射時(shí)間()滿足對數(shù)關(guān)系，其變化曲線如圖2(a?c)。

表1 輻照后青?；【鶴67相對發(fā)光值

圖2 照射時(shí)間(a?c)、劑量率(d)對青?；【鶴67相對發(fā)光值影響曲線 (a?c) 劑量率分別為0.05 Gy?min?1、0.1 Gy?min?1、0.2 Gy?min?1，(d) 累積劑量為1 Gy

2.1.2 相同累積劑量下不同劑量率對相對發(fā)光值的影響

在9組劑量梯度實(shí)驗(yàn)組中，0.05 Gy?min?1劑量率照射20 min，0.1 Gy?min?1劑量率照射10 min，0.2Gy?min?1劑量率照射5 min，青?；【鶴67受到的累計(jì)劑量為1 Gy。由圖2(d)可以看出，隨著劑量率的增加，青?；【鶴67的相對發(fā)光值下降迅速，在劑量率為0.05 Gy?min?1，照射后15 min青?；【鶴67的相對發(fā)光值為0.89，當(dāng)劑量率增加到0.1Gy?min?1、0.2 Gy?min?1時(shí)，相對發(fā)光值分別下降0.31和0.35，下降到0.58和0.23。

2.1.3 相對發(fā)光值與劑量率和接受照射時(shí)間的關(guān)系

通過前面的分析，可以看出在受到γ射線輻照后，青海弧菌Q67的相對發(fā)光值與劑量率、照射時(shí)間均滿足對數(shù)關(guān)系，并且受到劑量率的影響更大，為了更加深入地分析三者之間的相互關(guān)系，以青海弧菌Q67在照射后15 min的相對發(fā)光值為研究對象，采用SPSS19.0進(jìn)行回歸擬合分析，發(fā)現(xiàn)青?；【鶴67的LV與受到照射的γ射線、的自然對數(shù)呈二元線性關(guān)系。擬合函數(shù)關(guān)系式為：

從擬合函數(shù)關(guān)系式(3)中可以看出，變量劑量率前系數(shù)的絕對值遠(yuǎn)大于前系數(shù)的絕對值，在數(shù)值上反映出劑量率對于青?；【鶴67相對發(fā)光值的減弱影響更大，也就從數(shù)值上直觀地表明劑量率的增加對青?；【鶴67造成的毒性影響更大。

2.2 γ輻照對相對發(fā)光值影響的原因分析

青?；【鶴67發(fā)出熒光是自身生理代謝的結(jié)果，通過合成熒光酶，催化還原型的黃素單核苷酸(FMNH2)和長鏈脂肪醛（RCHO，至少含8個(gè)C），并在O2的參與下發(fā)生氧化還原反應(yīng)而放出光子[4]。因此，首先菌量影響著發(fā)光強(qiáng)度（菌量可由菌液光密度OD600表示），其次當(dāng)環(huán)境中毒性物質(zhì)不利于發(fā)光的代謝過程（比如損傷熒光酶活性），發(fā)光強(qiáng)度也會(huì)抑制。

當(dāng)青?；【鶴67受到γ照射時(shí)，γ光子與菌體細(xì)胞的作用主要為間接作用。γ光子首先與細(xì)菌體內(nèi)的水分子作用，使水分子電離或者激發(fā)，然后經(jīng)過一定的化學(xué)反應(yīng)生成一些活性很強(qiáng)的自由基和過氧化物，這些自由基和過氧化物作用于菌體的生物大分子[15]，從而影響菌體的生長活性和代謝過程。

經(jīng)過0.2 Gy?min?1的劑量率短時(shí)間照射后，22oC恒溫培養(yǎng)20 h，青海弧菌Q67的OD變化如圖3所示。從圖3可以看出，輻照1min、5 min和10 min后的青?；【鶴67的OD分別為0.83、0.66和0.53。通過擬合，發(fā)現(xiàn)在同一劑量率下，OD與滿足對數(shù)關(guān)系。

圖3 0.2 Gy?min?1劑量率，不同輻照時(shí)間對青?；【鶴67的相對光密度值影響

結(jié)合圖2(c)和圖3可以看出，在0.2 Gy?min?1劑量率下照射后，青?；【鶴67的LV和OD都下降，并且與滿足對數(shù)關(guān)系，說明γ光子作用產(chǎn)生的自由基和過氧化物引起了菌體細(xì)胞的死亡，活菌體數(shù)目的減少是青?；【鶴67發(fā)光強(qiáng)度下降的重要原因。

同時(shí)從表1可知，經(jīng)過0.2 Gy?min?1劑量率照射1 min、5 min和10 min后，立即測得的相對發(fā)光值為0.50、0.42和0.38?？梢钥闯靓幂椛鋵Πl(fā)光強(qiáng)度的抑制率更大，這可能是由于γ光子所生成一些活性很強(qiáng)的自由基和過氧化物，對部分菌體細(xì)胞，只是使得發(fā)光酶失活、對發(fā)光的代謝過程產(chǎn)生一定的損傷，從而也導(dǎo)致了發(fā)光強(qiáng)度的減弱。關(guān)于射線對熒光酶及發(fā)光代謝過程的損傷研究還待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證和探究。

3 結(jié)語

通過測定青?；【鶴67在60Co射線源輻照下的相對發(fā)光值，可以看出青?；【?7在經(jīng)過劑量率為0.05 Gy?min?1、0.1 Gy?min?1、0.2 Gy?min?1的γ射線短時(shí)間照射后，其發(fā)光強(qiáng)度立刻受到抑制（除了0.05 Gy?min?1的劑量率照射2 min）。說明這個(gè)劑量（率）范圍內(nèi)的γ射線對青?；【鶴67產(chǎn)生急性的毒性。在累積劑量為0.5Gy（0.05 Gy?min?1劑量率下照射10 min），測得照射后15 min青?；【南鄬Πl(fā)光值為0.93，可以看出，相比其他微生物，青?；【鶴67對γ射線有較好的敏感性，并且由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，在一定劑量（率）范圍內(nèi)，青海弧菌Q67的相對發(fā)光值隨照射劑量率、照射時(shí)間滿足較好的函數(shù)關(guān)系，因此青?；【鶴67能夠潛在作為一種監(jiān)測與評價(jià)γ射線毒性的生物材料。

本文還只是初步地探究了一定劑量（率）范圍γ輻照對青?；【鶴67發(fā)光強(qiáng)度的影響，并且對毒性分析薄弱，因此對于青?；【鶴67能夠應(yīng)用到輻射監(jiān)測中，還需要作進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)測試，拓寬劑量范圍，以建立起系統(tǒng)完備的青?；【鶴67的相對發(fā)光值隨劑量率和照射時(shí)間的關(guān)系，并且考慮到細(xì)菌本身個(gè)體的差異性，還需要考慮實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性。

致謝 得到上海市計(jì)量測試技術(shù)研究院劉剛、聞艷麗、李妍、羅超等諸多老師大力支持和幫助，在此深表感謝！

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Effect of gamma ray radiation on the luminous intensity of Vibrio Qinghaiensis sp. Q67

YAN Wei1TANG Fangdong2HE Linfeng2CHEN Jianxin2XIN Zhiwei2SUN Xun2HUANG Zhi1KUAI Linping1

1(Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China)2(Shanghai Institute of Measurement and Testing Technology, Shanghai 201203, China)

The suppression of bacterial luminescence by poisonous substance has being previously reported, such as heavy metals, pesticides, however, rarely radiation.This study aims to investigate the toxicity of the bioluminescent bacteria, Vibrio Qinghaiensis sp. Q67, to γ-ray radiation and the possibility of using bacteria as a biological radiation dosemeter.In this paper, the effects of γ-ray radiation on luminous intensity of Vibrio Qinghaiensis sp. Q67 are studied using60Co γ radiation source with various dose rate () and irradiation time ().Experimental results show that the relative luminous values (LV) of Vibrio Qinghaiensis sp. Q67 decrease with the increase of dose rate () and irradiation time () for acute radiation, and linear bivariate associations is found betweenLVand the logarithm value ofand.Vibrio Qinghaiensis sp. Q67 is sensitive to acute γ-ray radiation, which could be used to monitor γ-ray radiation.

Vibrio Qinghaiensis sp. Q67,60Co, Radiation dose, Relative luminous value, OD600

YAN Wei, male, born in 1991, graduated from University of South China in 2013, master student, focusing on nuclear and technology

KUAI Linping, E-mail: lkuai@stju.edu.cn

2017-06-25,

2017-08-22

TL75

10.11889/j.0253-3219.2017.hjs.40.120502

顏未，男，1991年出生，2013年畢業(yè)于南華大學(xué)，現(xiàn)為碩士研究生，主要從事核能科學(xué)研究

蒯琳萍，E-mail: lkuai@stju.edu.cn

2017-06-25，

2017-08-22

Supported by National Natural Science Foundation of China (No.11575114)

國家自然科學(xué)基金(No.11575114)資助