黃酒麥曲中產(chǎn)凝乳酶菌株的分離鑒定

李柳，鄭喆，趙笑，曹永強(qiáng)，余志堅(jiān)，陳超，楊貞耐,

（1.北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類(lèi)健康高精尖創(chuàng)新中心，食品添加劑與配料北京高校工程研究中心北京工商大學(xué)，北京 100048；2.東君乳業(yè)（禹城）有限公司，山東禹城 251200）

黃酒麥曲中產(chǎn)凝乳酶菌株的分離鑒定

李柳1，鄭喆1，趙笑1，曹永強(qiáng)2，余志堅(jiān)2，陳超2，楊貞耐1,2

（1.北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類(lèi)健康高精尖創(chuàng)新中心，食品添加劑與配料北京高校工程研究中心北京工商大學(xué)，北京 100048；2.東君乳業(yè)（禹城）有限公司，山東禹城 251200）

本研究利用梯度稀釋法和劃線(xiàn)純化法對(duì)黃酒麥曲中的微生物進(jìn)行初篩，再利用酪蛋白平板法和液態(tài)培養(yǎng)基發(fā)酵法進(jìn)行復(fù)篩，最終得到了兩株產(chǎn)凝乳酶的優(yōu)良細(xì)菌菌株LB-1和LB-2。通過(guò)形態(tài)學(xué)特征觀察、生理生化實(shí)驗(yàn)以及16S rDNA序列分析鑒定，這兩株菌分別確定為甲醇芽孢桿菌(Bacillus methanolicus)和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。根據(jù)凝乳活力曲線(xiàn)發(fā)現(xiàn)，這兩株菌在發(fā)酵24 h時(shí)其發(fā)酵液的凝乳活力最高，分別為269.66±0.78 SU/mL和187.50±1.4 SU/mL，此時(shí)的蛋白水解活力分別為1.476±0.49 U/mL和1.29±1.41 U/mL，凝乳活力與蛋白水解活力比值(C/P)分別為187.50和145.34。通過(guò)凝乳效果評(píng)價(jià)，其發(fā)酵液所形成的凝塊組織結(jié)構(gòu)、質(zhì)構(gòu)參數(shù)和風(fēng)味物質(zhì)均與商品凝乳酶形成的凝塊相當(dāng)，適用于干酪的加工。

黃酒麥曲；凝乳酶；分離；鑒定；凝乳效果評(píng)價(jià)

0 引言

凝乳酶在干酪加工過(guò)程中起凝固作用[1]。最早的來(lái)源是小牛皺胃，但隨著干酪需求量的增加，屠宰大量犢牛已經(jīng)不能滿(mǎn)足人類(lèi)的需求，而且引發(fā)了一些倫理問(wèn)題[2]。目前報(bào)道產(chǎn)凝乳酶的來(lái)源有動(dòng)物源、植物源以及微生物源[3]，由于微生物生長(zhǎng)繁殖迅速、發(fā)酵周期短的特點(diǎn)，已經(jīng)成為凝乳酶生產(chǎn)的主要來(lái)源[4]。

黃酒分為南方黃酒和北方黃酒，南方黃酒有名的是紹興黃酒[5]，北方黃酒典型代表是北宗黃酒.。近年來(lái)科研工作者對(duì)南方黃酒麥曲中的微生物進(jìn)行了鑒定[6]，對(duì)北方黃酒麥曲中的微生物研究很少。

本研究從北宗黃酒麥曲中篩選出了產(chǎn)凝乳酶的菌株，通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化實(shí)驗(yàn)以及16S rDNA分子生物學(xué)進(jìn)行了鑒定[7]，對(duì)其發(fā)酵液形成的凝塊進(jìn)行了質(zhì)構(gòu)和風(fēng)味分析[8]。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

黃酒麥曲，脫脂乳粉，商品凝乳酶。

1.2 培養(yǎng)基的配制

LB固體培養(yǎng)基（均為質(zhì)量濃度）：酵母提取物5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，氯化鈉10 g/L，瓊脂粉15 g/L，蒸餾水1 L，121℃高壓滅菌20 min。LB液體培養(yǎng)基：不添加瓊脂粉即可。YEPD培養(yǎng)基：酵母粉10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉15 g，蒸餾水1 L，pH值為6.0，115℃濕熱滅菌20 min。PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯浸粉15 g/L，葡萄糖3 g/L，瓊脂粉15 g/L，蒸餾水1 L，121℃高壓滅菌20 min。酪蛋白培養(yǎng)基：蛋白胨2.5 g/L，葡萄糖10 g/L，酵母膏1 g/L，干酪素10 g/L，瓊脂粉20 g/L，脫脂牛乳50 g/L，pH 7.0，95 ℃滅菌15 min。

1.3 儀器與設(shè)備

HWS 12恒溫水浴鍋，Axio Image A1顯微鏡，分光光度計(jì)U-3900，HZQ-Q氣浴恒溫?fù)u床，全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)，TexturePro CT V1.8 Build 31質(zhì)構(gòu)儀，GC-MS 7890A-7000。

1.4 方法

1.4.1 產(chǎn)凝乳酶菌株的初篩[9]

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.5 g粉碎好的麥曲加入裝有4.5 mL無(wú)菌生理鹽水的試管中，在振蕩器中混勻，使麥曲均勻的分散在無(wú)菌生理鹽水中，制得的該樣品稀釋度為10-1。然后將樣品依次進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)钡较♂尪葹?0-7，各取100 μL（10-3～10-7）的稀釋液分別涂布于LB，YEPD和PDA三種固體培養(yǎng)基中，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。然后將培養(yǎng)基倒置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，在第2，3，4天時(shí)挑取少量形態(tài)大小不同的菌落接種于相應(yīng)的固體培養(yǎng)基中進(jìn)行分離純化，直至得到單菌株。分離純化后將編好號(hào)的單菌株保存在甘油管中。

1.4.2 產(chǎn)凝乳酶菌株的復(fù)篩[10]

將初篩中得到的單一菌株以三點(diǎn)法接種于酪蛋白固體培養(yǎng)基中，在37℃恒溫培養(yǎng)2 d，觀察不同菌株產(chǎn)凝乳圈和水解圈的情況。取少量產(chǎn)凝乳圈和水解圈的菌株分別接種于LB、YEPD和PDA三種不同液體培養(yǎng)基中，30℃轉(zhuǎn)速為120 r/min振蕩培養(yǎng)24 h后分別測(cè)定菌株發(fā)酵液的凝乳活力和蛋白水解活力。

1.5 產(chǎn)凝乳酶菌株的鑒定

1.5.1 菌體形態(tài)觀察

將分離得到的產(chǎn)凝乳酶菌株分別接種于LB固體培養(yǎng)基上，放在37℃恒溫培養(yǎng)24 h后先通過(guò)肉眼觀察菌落生長(zhǎng)情況，再通過(guò)革蘭氏染色后在顯微鏡下進(jìn)一步觀察菌體形態(tài)。

1.5.2 API試劑盒法對(duì)菌株的生理生化特征分析

用無(wú)菌棉簽將平板培養(yǎng)好的新鮮菌體全部挑取置含有1 mL無(wú)菌生理鹽水的試管中制成濃的細(xì)菌懸液，加兩滴該菌液接種于API 50CHB/E培養(yǎng)基的安甁中，然后分別加入API 50CHB試劑盒各孔內(nèi)，37℃靜置培養(yǎng)24 h和48 h，通過(guò)觀察試劑盒各孔顏色的變化來(lái)確定各反應(yīng)結(jié)果的陰陽(yáng)性，其中紅色代表反應(yīng)結(jié)果陰性，黃色和黑色代表反應(yīng)結(jié)果陽(yáng)性。

1.5.3 基于16S rDNA基因的菌種分子生物學(xué)鑒定

產(chǎn)凝乳酶菌株全基因組DNA的分離純化：將產(chǎn)凝乳酶菌株分別接種于LB液體培養(yǎng)基中，30℃轉(zhuǎn)速為120 r/min振蕩培養(yǎng)12 h后離心，利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒對(duì)其全基因組DNA進(jìn)行提取。并利用提取的DNA作為PCR反應(yīng)的模板，采用細(xì)菌通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3')進(jìn)行PCR擴(kuò)增[11]。

50 μL PCR反應(yīng)體系：25 μL 2×Taq PCR Master?Mix(with loading dye)；2 μL全基因組DNA模板；2 μL 27F(10umol/L)；2 μL 1492R(10 umol/L)；19 μL ddH2O。

PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性0.5 min，55 ℃退火0.5 min，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，72℃末端延伸5 min，擴(kuò)增結(jié)束后將產(chǎn)物放在-20℃冰箱中保存。用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增是否成功，將有特異性條帶的PCR產(chǎn)物送至北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果提交到GenBank中，選取與實(shí)驗(yàn)菌株序列大小相近的已知菌株的相應(yīng)序列進(jìn)行比對(duì)，利用MEGA6.0軟件將實(shí)驗(yàn)菌株與選取的序列相似性較高的菌株序列進(jìn)行分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)[12]。

1.6 產(chǎn)凝乳酶菌株發(fā)酵液活力的測(cè)定

1.6.1 凝乳活力的測(cè)定

凝乳活力測(cè)定采用Arima[13]方法，將脫脂乳溶解在濃度為0.01 mol/L的CaCl2溶液中制成10%的脫脂乳溶液，室溫下靜置30 min后各量取5 mL分裝到小試管中，于35℃恒溫水浴箱中保溫5 min，在35℃下取待測(cè)菌液0.5 mL加入到5 mL裝有10%脫脂乳溶液的試管中搖勻后開(kāi)始計(jì)時(shí)，當(dāng)開(kāi)始出現(xiàn)絮狀沉淀時(shí)立即停止計(jì)時(shí)。計(jì)算公式為

式中：MCA為發(fā)酵液凝乳活力(SU/mL)；V1為脫脂牛奶溶液體積（mL）;t為凝乳時(shí)間（s）；V2為所加菌液體積（mL）；n為菌液稀釋倍數(shù)。

1.6.2 蛋白水解活力的測(cè)定[14]

將2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%酪蛋白溶液在35℃中保溫5 min后，加入0.5 mL在35℃預(yù)熱好的產(chǎn)凝乳酶菌株發(fā)酵液，將兩者混勻在35℃中保溫60 min，加入2 mL 8%的三氯乙酸終止反應(yīng)，用濾紙將沉淀過(guò)濾出去測(cè)定濾液在280 nm處的吸光度值A(chǔ)280。量取0.5 mL在35℃預(yù)熱好的產(chǎn)凝乳酶菌株發(fā)酵液直接與8%的三氯乙酸混勻，再加入2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%酪蛋白溶液，過(guò)濾后取濾液作為空白對(duì)照，測(cè)定其在280 nm處的吸光度值A(chǔ)280'。計(jì)算公式為：

式中：PA為發(fā)酵液蛋白水解活力(U/mL)。

1.7 產(chǎn)凝乳酶菌株生長(zhǎng)曲線(xiàn)及其發(fā)酵液的凝乳活力曲線(xiàn)的測(cè)定

1.7.1 生長(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定

取少量產(chǎn)凝乳酶菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，30℃轉(zhuǎn)速為120 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔3 h測(cè)定菌體OD600值，直至菌株生長(zhǎng)到衰亡期，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7.2 凝乳活力曲線(xiàn)的測(cè)定

取少量產(chǎn)凝乳酶菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，30℃轉(zhuǎn)速為120 r/min條件下振蕩12 h，作為活化種子液，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的接種量接種于LB液體培養(yǎng)基中，裝液量為40%(體積分?jǐn)?shù))，在30℃轉(zhuǎn)速為120 r/min下振蕩培養(yǎng)，分別在0，12，24，36，48，60，72，84 h時(shí)，按照1.6.1和1.6.2方法測(cè)定產(chǎn)凝乳酶菌株發(fā)酵液的凝乳活力和蛋白水解活力，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 產(chǎn)凝乳酶菌株發(fā)酵液的凝乳效果評(píng)價(jià)

1.8.1 凝乳效果及質(zhì)構(gòu)分析

在凝乳活力曲線(xiàn)中產(chǎn)凝乳酶菌株的最適發(fā)酵條件下測(cè)定其發(fā)酵液的凝乳活性，將酶活力為3.5×105SU/g的商品凝乳酶稀釋1 000倍作對(duì)照，按照1.6.1的方法分別添加相同量的商品酶與菌株發(fā)酵液的離心上清液測(cè)定其凝乳時(shí)間，并利用TexturePro CT V1.8 Build 31質(zhì)構(gòu)儀對(duì)凝塊進(jìn)行質(zhì)構(gòu)分析，轉(zhuǎn)子直徑20 mm，目標(biāo)距離5.0 mm，觸發(fā)點(diǎn)負(fù)載5.0 g，測(cè)試速度為0.5 mm/s，返回速度為0.5 mm/s，循環(huán)2次。目的是分析比較產(chǎn)凝乳酶菌株發(fā)酵液和商品凝乳酶形成凝塊的硬度、黏性、彈性、內(nèi)聚性、膠著性和咀嚼性。

1.8.2 持水力測(cè)定

按照1.6.1的方法分別添加相同量的商品酶與產(chǎn)凝乳酶菌株發(fā)酵后的離心上清液至裝有5 mL脫脂乳溶液的離心管中，凝乳后進(jìn)行離心操作，在轉(zhuǎn)速為7 000 r/min，溫度為4℃條件下，離心10 min。離心完成后取上清稱(chēng)重，代入公式算得凝塊持水力，即

1.8.3 風(fēng)味物質(zhì)分析

GC-MS法分析對(duì)比產(chǎn)凝乳酶菌株發(fā)酵后的離心上清液和商品凝乳酶所形成的凝塊風(fēng)味。量取9 mL脫脂乳溶液加入到50 mL萃取瓶中，分別加入1 mL的菌株發(fā)酵后的離心上清液和稀釋后的商品凝乳酶，蓋好蓋子后放在40℃恒溫水浴鍋中平衡30 min，將進(jìn)樣針插入萃取瓶中40℃吸附30 min后，拔出進(jìn)樣針插入氣相色譜進(jìn)樣口中，250℃條件下解析5 min。

（1）GC條件程序升溫：初始溫度為40℃，保持3 min，然后以5℃/min升溫到200℃，保持0 min，再以10℃/min升溫到250℃，保持3 min后運(yùn)行3 min。載氣(He)，恒定流速為1.2 mL/min，進(jìn)樣口溫度250 ℃，分流比5∶1。

（2）質(zhì)譜條件電子轟擊離子源，電子能量70 eV，傳輸線(xiàn)溫度280℃，離子源溫度為230℃，四極桿溫度為150℃，質(zhì)量掃描范圍m/z為40～250。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)凝乳酶菌株的篩選

利用梯度稀釋法和劃線(xiàn)分離法從黃酒麥曲中分離純化得到14株不同菌落形態(tài)的純種菌株，將分離純化得到的14株菌株分別以三點(diǎn)法點(diǎn)接于酪蛋白平板上[15]，通過(guò)觀察得到兩個(gè)產(chǎn)生凝乳圈的菌株LB-1和LB-2，其菌體形態(tài)如圖1所示。

圖1 LB-1與LB-2菌株在酪蛋白平板上的菌落形態(tài)

由圖1可以看出，LB-1與LB-2兩株菌均產(chǎn)生較大的凝乳圈以及周?chē)囊恍┧馊?，且LB-1菌株比LB-2菌株的沉淀圈更厚重。將這兩株菌分別接種于LB,YEPD和PDA三種不同的液體培養(yǎng)基中，在30℃120 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，測(cè)定其發(fā)酵液的凝乳活力和蛋白水解活力，結(jié)果如表1所示。

表1 LB-1與LB-2菌株在不同培養(yǎng)基中發(fā)酵的凝乳活力比較菌株

由表1可以看出，兩株菌的發(fā)酵液均在液體LB培養(yǎng)基中凝乳活力相對(duì)較高。其中LB-1菌株發(fā)酵液在液體LB培養(yǎng)基中凝乳活力高達(dá)296.66 SU/mL，且蛋白水解活力較低；LB-2菌株發(fā)酵液在液體LB培養(yǎng)基中凝乳活力為193.65 SU/mL，相對(duì)較高。

2.2 產(chǎn)凝乳酶菌株的鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)特征

將LB-1與LB-2菌株在LB固體平板上培養(yǎng)24 h后觀察其菌落形態(tài)有明顯差異，LB-1菌株呈乳白色、不透明、不光滑、較干燥；LB-2菌株稍顯黃色、有褶皺、表面較濕潤(rùn)。通過(guò)革蘭氏染色確定LB-1菌株與LB-2菌株均為革蘭氏陽(yáng)性反應(yīng)，在顯微鏡下放大倍數(shù)為40倍時(shí)觀察LB-1菌株為長(zhǎng)桿狀，LB-2菌株為短桿狀。菌株形態(tài)及革蘭氏染色照片分別如圖2和圖3所示。

圖2 LB-1菌株菌落形態(tài)及革蘭氏染色照片

圖3 LB-2菌株菌落形態(tài)及革蘭氏染色照片

2.2.2 API試劑盒法分析菌株生理生化特征

LB-1和LB-2菌株的API試劑盒發(fā)酵結(jié)果如表2所示。表2中，+為反應(yīng)結(jié)果為陽(yáng)性；－為反應(yīng)結(jié)果為陰性。

表2 LB-1和LB-2菌株的API生化試劑盒發(fā)酵結(jié)果

將API試劑條發(fā)酵結(jié)果提交到apiweb軟件中進(jìn)行比對(duì)鑒定，結(jié)果顯示LB-2菌株與枯草芽孢桿菌相似度高達(dá)91.6%，可初步斷定其為枯草芽孢桿菌，由于API數(shù)據(jù)庫(kù)所含菌株數(shù)量有限，未能將LB-1菌株準(zhǔn)確鑒定到種，但根據(jù)其主要糖反應(yīng)結(jié)果并參考伯杰式細(xì)菌鑒定手冊(cè)[16]可初步確定其為芽孢桿菌屬，后續(xù)可通過(guò)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步鑒定。

2.2.3 基于16S rDNA序列的分子生物學(xué)鑒定

以LB-1和LB-2菌株全基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物再通過(guò)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，LB-1和LB-2菌株在約1 500 bp處各有一條特異性條帶，如圖4所示。

圖4 LB-1和LB-2菌株的16S rDNA 1.5%瓊脂糖凝膠電泳圖

PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果表明，LB-1菌株的16S rDNA序列長(zhǎng)度為1 428 bp，LB-2菌株的16S rDNA序列長(zhǎng)度為1 445 bp。

2.2.4 基于16S rDNA序列相似性比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析

分別將LB-1和LB-2菌株的16S rDNA基因序列與在GenBank中序列大小相近的已知菌株的序列進(jìn)行比對(duì)后，選取與LB-1和LB-2菌株序列相似性較高的菌株序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果如圖5和圖6所示。由圖5和圖6可以看出，LB-1菌株與Bacillus meth?anolicusPB1(AFEU01000004.1)在同一分支上，LB-2菌株與Bacillus subtilis strain P3(KF758384.1)在同一分支上且它們的置信度支持率分別高達(dá)99%和100%，綜合上述形態(tài)學(xué)和生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果可將LB-1菌株鑒定為甲醇芽孢桿菌(B.methanolicus)，將LB-2菌株鑒定為枯草芽孢桿菌(B.subtilis)。

圖5 以16S rDNA序列為基礎(chǔ)的LB-1菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖6 以16S rDNA序列為基礎(chǔ)的LB-2菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.3 菌株的生長(zhǎng)曲線(xiàn)及其發(fā)酵液的凝乳活力曲線(xiàn)測(cè)定結(jié)果

甲醇芽孢桿菌LB-1的生長(zhǎng)曲線(xiàn)和發(fā)酵液的凝乳活力曲線(xiàn)如圖7所示。由圖7(a)可知，OD600值顯示LB-1菌株在液體培養(yǎng)基中0～6 h生長(zhǎng)速率緩慢，這個(gè)時(shí)期為遲緩期；6～21 h菌株生長(zhǎng)迅速，這一階段為指數(shù)期；21～45 h菌株生長(zhǎng)速率隨時(shí)間延長(zhǎng)基本保持不變，這一階段為穩(wěn)定期；45 h以后菌株生長(zhǎng)速率急速下降，這一階段為衰亡期。由圖7(b)可知，LB-1菌株發(fā)酵液在對(duì)數(shù)期凝乳活力快速增加，在穩(wěn)定期凝乳活力也趨于穩(wěn)定且在穩(wěn)定初期凝乳活力達(dá)到最大值，隨后凝乳活力開(kāi)始下降，可能原因是培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)成分消耗殆盡以及處于衰亡期的菌株生長(zhǎng)速率下降導(dǎo)致其凝乳活力的下降。隨著發(fā)酵時(shí)間的增加蛋白水解活力總體差異不大，特別在發(fā)酵24 h時(shí)，菌株發(fā)酵液的凝乳活力達(dá)到最大值隨后開(kāi)始逐漸下降，但其蛋白水解活力相對(duì)較小，凝乳活力與蛋白水解活力比值(C/P)為最大值。

圖7 LB-1的生長(zhǎng)曲線(xiàn)和發(fā)酵液的凝乳活力曲線(xiàn)

枯草芽孢桿菌LB-2的生長(zhǎng)曲線(xiàn)及其發(fā)酵液的凝乳活力曲線(xiàn)分別如圖8(a)和8(b)所示。由圖8(a)可知，OD600值顯示LB-2菌株在液體培養(yǎng)基中0～6 h生長(zhǎng)速率緩慢，這個(gè)時(shí)期為遲緩期；6～21 h菌株生長(zhǎng)迅速增加，這一階段為指數(shù)期；21～27 h菌株生長(zhǎng)隨時(shí)間增加基本保持不變，這一階段為穩(wěn)定期，與圖7(a)相比，LB-2菌株穩(wěn)定期相對(duì)較短；27 h以后菌株生長(zhǎng)速率急速下降，這一階段為衰亡期。由圖8(b)可知，LB-2菌株發(fā)酵液在0～24 h凝乳活力迅速增加，在24 h達(dá)到最大值后開(kāi)始下降且在發(fā)酵24 h時(shí)LB-2菌株發(fā)酵液的C/P值最大。

圖8 枯草芽孢桿菌LB-2的生長(zhǎng)曲線(xiàn)和凝乳活力曲線(xiàn)

2.4 產(chǎn)凝乳酶菌株發(fā)酵液所形成凝塊的凝乳效果評(píng)價(jià)

2.4.1 凝乳效果及質(zhì)構(gòu)分析結(jié)果

對(duì)比甲醇芽孢桿菌LB-1和枯草芽孢桿菌LB-2與稀釋后的商品凝乳酶形成的凝塊如圖9所示。

圖9 LB-1與LB-2菌株發(fā)酵液的凝乳效果

其中LB-1菌株發(fā)酵后的離心上清液凝乳時(shí)間為98 s，即凝乳活力為244.89 SU/mL，LB-2菌株發(fā)酵后的離心上清液凝乳時(shí)間為113 s，即凝乳活力為212.39 SU/mL，酶活力為3.5×105SU/g的商品凝乳酶稀釋1 000倍后凝乳時(shí)間為96 s，即凝乳活力為250 SU/mL。LB-1與LB-2菌株發(fā)酵液的凝乳活力與商品凝乳酶很接近。

為了進(jìn)一步比較甲醇芽孢桿菌LB-1與枯草芽孢桿菌LB-2發(fā)酵后的離心上清液與商品凝乳酶形成凝塊的硬度、黏性、彈性、內(nèi)聚性、膠著性、咀嚼性，分別對(duì)其進(jìn)行了質(zhì)構(gòu)分析[17]，所形成凝塊的質(zhì)構(gòu)分析結(jié)果如表3所示。硬度是第一次壓縮時(shí)的最大峰值，正的力值和面積越大說(shuō)明凝塊越硬，其中商品凝乳酶所形成的凝塊硬度最大為（309.25±0.05）g，LB-1菌株發(fā)酵液所形成的凝塊硬度居中為（287.85±0.17）g，LB-2菌株發(fā)酵液所形成的凝塊硬度最小為（246.35±0.13）g，但三者差異不顯著(P＞0.05)，所測(cè)硬度指標(biāo)以第一次硬度為主，因?yàn)榈诙嗡鶞y(cè)硬度可能會(huì)受到第一次測(cè)量的影響[18]。黏性是第一次圧縮曲線(xiàn)到達(dá)零點(diǎn)到第二次圧縮曲線(xiàn)開(kāi)始之間的曲線(xiàn)的負(fù)面積，LB-2菌株發(fā)酵液所形成的凝塊黏性最大,數(shù)值為（0.055±0.13）mJ。黏性越大的樣品活塞上提時(shí)粘在探頭上的越多，一般較稠的凝塊黏性越大，膠著性也主要是描述半固態(tài)測(cè)試樣品的黏性特征。彈性是變形樣品在去除壓力后恢復(fù)到變形前的高度比率，LB-2菌株發(fā)酵液所形成的凝塊硬度最低其彈性最大。而內(nèi)聚性越大，說(shuō)明樣品對(duì)活塞下壓時(shí)抵抗力越大[19]，也說(shuō)明凝塊爽滑性、細(xì)膩度越差，酒曲菌株發(fā)酵液形成的凝塊內(nèi)聚性分別為0.44±0.06和0.49±0.03，小于對(duì)照組0.565±0.26，所以酒曲菌株發(fā)酵液形成的凝塊其細(xì)膩度優(yōu)于對(duì)照組。

表3 LB-1與LB-2菌株發(fā)酵液所形成凝塊的質(zhì)構(gòu)分析各指標(biāo)結(jié)果

通過(guò)整體比較分析，LB-1與LB-2菌株發(fā)酵液所形成的凝塊質(zhì)構(gòu)特性與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異(P＞0.05)。

2.4.2 持水力分析結(jié)果

為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)甲醇芽孢桿菌LB-1與枯草芽孢桿菌LB-2在干酪制作中的應(yīng)用潛力，考察其發(fā)酵后的離心上清液所形成的凝塊阻止水滲出的能力，分別測(cè)定了菌株發(fā)酵后的離心上清液和商品凝乳酶所形成凝塊的持水力，結(jié)果如表4所示。

表4 LB-1與LB-2菌株發(fā)酵液所形成凝塊的持水力測(cè)定結(jié)果

持水力描述的是由分子構(gòu)成的機(jī)體通過(guò)物理方式截留大量的水而阻止水滲出的能力。持水力越大說(shuō)明機(jī)體內(nèi)固定住的水分越多，凝乳質(zhì)量越好。由表4可得，酒曲菌株發(fā)酵液與商品凝乳酶所形成凝塊的持水力數(shù)值均較高，且主體間效應(yīng)檢驗(yàn)結(jié)果表明三者差異不顯著(P＞0.05)。綜合凝塊的質(zhì)構(gòu)特性和持水性能進(jìn)行分析，酒曲菌株發(fā)酵液所形成凝塊的細(xì)膩度、爽滑性?xún)?yōu)良，持水力高，可用于干酪的生產(chǎn)。

2.4.3 風(fēng)味物質(zhì)分析結(jié)果

通過(guò)GC-MS分析甲醇芽孢桿菌LB-1與枯草芽孢桿菌LB-2發(fā)酵后的離心上清液和商品凝乳酶所形成凝塊的風(fēng)味物質(zhì)[20]如圖10所示。

圖10 LB-1與LB-2菌株發(fā)酵后的離心上清液所形成凝塊的風(fēng)味物質(zhì)

根據(jù)圖中LB-1與LB-2菌株發(fā)酵后的離心上清液和商品凝乳酶所形成凝塊的出峰圖譜進(jìn)行解析，商品凝乳酶形成的凝塊中的主要風(fēng)味物質(zhì)為辛醛、壬醛、癸醛和庚醛，LB-1菌株發(fā)酵液的凝塊中主要風(fēng)味物質(zhì)為辛醛、壬醛、癸醛和庚醛，LB-2菌株發(fā)酵液的凝塊中主要風(fēng)味物質(zhì)為辛醛、壬醛、癸醛和十三烷，三種凝塊中均不含異味，且主要風(fēng)味物質(zhì)均為醛類(lèi)。醛類(lèi)物質(zhì)的閾值一般較低，對(duì)食品整體風(fēng)味的貢獻(xiàn)較大[21],壬醛普遍存在于干酪中，具有脂肪味和水果的香味。而LB-2菌株發(fā)酵液凝塊中的十三烷為烴類(lèi)化合物，主要來(lái)源是牛乳本身，并不是在干酪成熟過(guò)程中產(chǎn)生的，因此其在所有干酪中的存在較為普遍，但一般由于烴類(lèi)化合物的芳香閾值較高，這些化合物對(duì)干酪風(fēng)味的貢獻(xiàn)較小[22]。后期利用LB-1與LB-2菌株所產(chǎn)的凝乳酶制作干酪，其產(chǎn)品的風(fēng)味得到了保障。

3 結(jié)果與討論

（1）同樣作為凝乳酶的生產(chǎn)者，微生物與動(dòng)植物相比有體積小，繁殖快，生長(zhǎng)周期短，發(fā)酵產(chǎn)物易提取等優(yōu)勢(shì)[23]，因此研究微生物用于生產(chǎn)凝乳酶具有很好的發(fā)展前景[24]。Bensmail等利用農(nóng)副產(chǎn)品作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)通過(guò)固態(tài)發(fā)酵法優(yōu)化了黑曲霉生產(chǎn)的細(xì)胞外蛋白酶凝乳活性的最佳條件[25]，張衛(wèi)兵等對(duì)解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)凝乳酶條件進(jìn)行了優(yōu)化并對(duì)其分離提純做了詳細(xì)研究[26]，均指出其微生物產(chǎn)凝乳酶穩(wěn)定，具有大規(guī)模生產(chǎn)凝乳酶的潛力。

（2）本研究對(duì)黃酒麥曲中的微生物進(jìn)行分離鑒定，最終篩選出了兩株產(chǎn)凝乳酶的細(xì)菌，分別是甲醇芽孢桿菌(B.methanolicus)和枯草芽孢桿菌(B.subtilis)，與同來(lái)源于酒曲中的真菌相比具有發(fā)酵易于控制，產(chǎn)物易于提取分離等優(yōu)勢(shì)，而且根據(jù)其凝乳活性曲線(xiàn)，LB-1與LB-2菌株均在發(fā)酵24 h時(shí)其發(fā)酵液凝乳活力達(dá)到最大值（269.66±0.78）SU/mL和（187.50±1.4）SU/mL，此時(shí)的蛋白水解活力分別為（1.476±0.49）U/mL和（1.29±1.41）U/mL，凝乳活力與蛋白水解活力比值分別為187.50和145.34。目前已報(bào)道的產(chǎn)凝乳酶細(xì)菌菌株中解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)在發(fā)酵72 h時(shí)其發(fā)酵液凝乳活力達(dá)到最大值，此時(shí)C/P為85.45[27]，地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)在最佳發(fā)酵條件下發(fā)酵10 h發(fā)酵液的凝乳活力最大僅為24.7 SU/mL[28]。從黃酒麥曲中篩選出的LB-1和LB-2菌株與其相比，不僅發(fā)酵周期短而且C/P高。此外，LB-1和LB-2菌株發(fā)酵液形成的凝塊與商品凝乳酶形成的凝塊相比其彈性、硬度、黏性、內(nèi)聚性等均無(wú)明顯差異，所含風(fēng)味物質(zhì)也基本相同，且無(wú)異味存在。

枯草芽孢桿菌(B.subtilis)近些年報(bào)道產(chǎn)凝乳酶的文章較多[29]，而關(guān)于甲醇芽孢桿菌(B.Methanolicus)鮮有報(bào)道。曾有研究表明[30]它的最適生長(zhǎng)溫度為55℃，是典型的嗜熱菌株，且能以甲醇為原料合成自身所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并能形成內(nèi)生孢子。在釀造黃酒過(guò)程中，發(fā)酵環(huán)節(jié)由于原料的植物細(xì)胞壁及細(xì)胞間質(zhì)的果膠中含有甲醇酯，在曲霉的作用下放出甲氧基而生成甲醇，醇類(lèi)是黃酒的主要風(fēng)味來(lái)源之一[31],因此在黃酒中甲醇的存在促進(jìn)了以甲醇為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的甲醇芽孢桿菌(B.methanolicus)的生長(zhǎng)。曾有文獻(xiàn)報(bào)道，甲醇芽孢桿菌(B.methanolicus)可用于生產(chǎn)氨基酸[32]，但對(duì)其用于產(chǎn)凝乳酶在此之前尚未見(jiàn)報(bào)道，因此研究甲醇芽孢桿菌(B.methanolicus)用于生產(chǎn)凝乳酶，豐富了凝乳酶產(chǎn)生菌的資源庫(kù)。在后續(xù)試驗(yàn)中可對(duì)其培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)一步優(yōu)化，以提高其發(fā)酵液的凝乳活力，降低蛋白水解活力。

（3）本研究利用梯度稀釋法和劃線(xiàn)純化法初篩，酪蛋白平板法和液態(tài)培養(yǎng)基發(fā)酵法復(fù)篩后，分離篩選出了兩株產(chǎn)凝乳酶的優(yōu)良細(xì)菌菌株，通過(guò)形態(tài)觀察，鏡檢，生理生化實(shí)驗(yàn)并結(jié)合分子生物學(xué)，最終將這兩株菌分別鑒定為甲醇芽孢桿菌(B.methanolicus)LB-1和枯草芽孢桿菌(B.subtilis)LB-2。生長(zhǎng)曲線(xiàn)和凝乳活性曲線(xiàn)的研究結(jié)果表明，LB-1菌株生長(zhǎng)穩(wěn)定期較長(zhǎng)，且在菌株生長(zhǎng)穩(wěn)定初期其發(fā)酵液凝乳活力達(dá)到最大值（269.66±0.78）SU/mL，此時(shí)的蛋白水解活力為（1.476±0.49）U/mL，其C/P為187.50；LB-2菌株生長(zhǎng)穩(wěn)定期較短，也在其穩(wěn)定期時(shí)其發(fā)酵液的凝乳活力達(dá)到最大值（187.50±1.4）SU/mL，此時(shí)的蛋白水解活力為（1.29±1.41）U/mL，其C/P為145.34。兩株菌的發(fā)酵液形成的凝塊與商品凝乳酶形成的凝塊相比其質(zhì)地和風(fēng)味均無(wú)明顯差異，且無(wú)異味存在，可以作為發(fā)酵生產(chǎn)適于干酪加工的凝乳酶的候選菌株。

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Isolation and identification of rennet-producing strains from wheat Qu of Chi?nese rice wine

LI Liu1,ZHENG Zhe1,ZHAO Xiao1,CAO Yongqiang2,YU Zhijian2,CHEN Chao2,YANG Zhennai1,2
(1.Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health，Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients，Beijing Technology&Business University（BTBU），Beijing 100048，China；2.Dongjun Dairy（Yucheng）Co.，Ltd，Yucheng 251200,China）

In this study,the microbes in the rice wine“wheat Qu”were screened by gradient dilution method and scribing method,fol?lowed by casein plate method and liquid culture medium fermentation.Two excellent bacterial strains of LB-1 and LB-2 producing rennet were obtained,which were further identified as Bacillus methanolicus and Bacillus subtilis by morphological observation,physiological and bio?chemical experiments and 16S rDNA sequence analysis.According to the enzyme activity curve,the highest milk clotting activity of the en?zymes from the two strains were 269.66±0.78 SU/mL and 187.50±1.4 SU/mL at 24 h fermentation,while the proteolytic activity were 1.476±0.49 U/mL and 1.29±1.41 U/mL,respectively.The ratio of milk clotting activity and proteolytic activity(C/P)were 187.50 and 145.34,respectively.Through the curd effect evaluation,the organization structure,texture parameters and flavor substances of the clots formed by the fermentation broth of the strains LB-1 and LB-2 had comparable milk-clotting effect with that of a commercial rennet,and they were suitable for cheese processing.

rice wine wheat Qu;rennet;isolation;identification;curd effect evaluation

Q93-331

A

1001-2230（2017）11-0004-07

2017-06-15

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31601488）。

李柳（1993-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槿槠飞锛夹g(shù)。

楊貞耐