ZAβ3和Aβ16–40親和作用的分子機(jī)理解析

劉夫鋒 范玉波 劉 珍 白 姝,*

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ZAβ3和Aβ16–40親和作用的分子機(jī)理解析

劉夫鋒1,2,3,4范玉波1劉 珍1白 姝1,*

(1天津大學(xué)化工學(xué)院生物工程系，天津 300072；2工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；3代謝控制發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；4天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

淀粉樣多肽(amyloid-β peptide, Aβ)聚集是引起阿爾茲海默癥(Alzheimer's disease，AD)的主要原因。開發(fā)Aβ聚集抑制劑是治療AD的最有效手段之一。利用噬菌體展示技術(shù)篩選出來的ZAβ3蛋白質(zhì)能夠有效抑制Aβ聚集，但ZAβ3和Aβ之間的作用區(qū)域和關(guān)鍵氨基酸殘基尚不清楚。針對此問題，本研究利用分子動力學(xué)模擬、MM-PBSA自由能計(jì)算和分解方法研究了ZAβ3-Aβ16–40復(fù)合物之間的相互作用機(jī)制。結(jié)果表明，ZAβ3的β-股和Aβ16–40之間的親和作用占主導(dǎo)，而ZAβ3的α-螺旋貢獻(xiàn)很小。利用分子力學(xué)-帕松波爾茨曼溶劑可及化表面積方法(MM-PBSA)自由能分解發(fā)現(xiàn)ZAβ3的熱點(diǎn)殘基為E15、I16、V17、Y18、L19、P20、N21和L22，而Aβ16–40的熱點(diǎn)殘基為F19、F20、A21、E22、D23、K28、I31、I32、G33、L34、M35、V36、G38和V40。ZAβ3通過將發(fā)夾型Aβ單體包埋在α-螺旋圍成的疏水性腔體內(nèi)來阻礙Aβ聚集。這種結(jié)合模式為設(shè)計(jì)高效的Aβ蛋白質(zhì)類抑制劑提供了三個(gè)基本要素：高親和性的結(jié)合片段(β-股)、附屬結(jié)構(gòu)(α-螺旋)和通過二硫鍵形成的穩(wěn)定構(gòu)象。高親和性結(jié)合片段能競爭性地與Aβ單體結(jié)合，附屬結(jié)構(gòu)α-螺旋可以阻礙其它Aβ單體靠近，而穩(wěn)定的構(gòu)象是上述兩種要素發(fā)揮作用的基礎(chǔ)，三者協(xié)同作用可以有效地抑制Aβ聚集。

蛋白質(zhì)抑制劑；淀粉質(zhì)蛋白質(zhì)；分子動力學(xué)模擬；自由能分解；親和機(jī)理

1 引言

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一種起病隱匿、進(jìn)行性發(fā)展的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。AD的初期臨床表現(xiàn)為記憶力衰退和認(rèn)知能力下降，隨著病情的發(fā)展病人會出現(xiàn)執(zhí)行功能障礙以及人格和行為改變等全面性癡呆癥狀1。現(xiàn)有研究表明β-淀粉樣蛋白(Amyloid-β protein，Aβ)相互聚集形成的寡聚體和纖維具有毒性，能夠促發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)、軸突損傷、突觸丟失和細(xì)胞凋亡等病理改變，是導(dǎo)致神經(jīng)元變性乃至形成癡呆的重要因素2。早期研究認(rèn)為Aβ聚集形成的淀粉斑或纖維具有神經(jīng)毒性，而越來越多的證據(jù)表明可溶性Aβ寡聚體的神經(jīng)毒性更大3,4。但無論是Aβ寡聚體還是成熟纖維，只要阻止Aβ的聚集就可從根本上消除Aβ所引發(fā)的神經(jīng)毒性。

目前常見的能夠抑制Aβ錯(cuò)誤折疊和聚集的抑制劑主要包括以下四類：小分子5,6、短肽7、納米粒子8和蛋白類抑制劑9。其中，具有較高親和性和生物相容性的蛋白質(zhì)類抑制劑近年來成為Aβ聚集抑制劑的主要來源之一10。一些能夠與Aβ具有較高親和性的蛋白質(zhì)被設(shè)計(jì)和篩選出來。例如，Hoyer等11利用噬菌體展示系統(tǒng)從組合蛋白庫中篩選出來一種來源于金黃色葡萄球菌的蛋白A的Z結(jié)構(gòu)域(ZAβ3)。研究結(jié)果表明，ZAβ3與Aβ1–40單體的中間片段和C端結(jié)合，并且Aβ1–40單體以β發(fā)夾的結(jié)構(gòu)存在于ZAβ3二聚體所圍成的管狀疏水腔內(nèi)。ZAβ3二聚體和Aβ1–40單體之間的親和作用是其抑制Aβ1–40聚集的主要機(jī)理，但ZAβ3抑制Aβ1–40聚集的作用機(jī)制尚不清晰。

本研究擬利用分子動力學(xué)(MD)模擬、分子力學(xué)-帕松波爾茨曼溶劑可及化表面積方法(MM-PBSA)計(jì)算ZAβ3與Aβ16–40之間的結(jié)合自由能，然后利用自由能分解方法將這些結(jié)合自由能分解到每個(gè)氨基酸殘基上，確定ZAβ3親和結(jié)合Aβ16–40的關(guān)鍵作用區(qū)域、關(guān)鍵殘基和作用力類型。上述研究結(jié)果可以為理性設(shè)計(jì)多肽類或蛋白質(zhì)類抑制劑提供切實(shí)可行的理論依據(jù)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 模擬體系

ZAβ3與Aβ16–40復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(Protein Data Bank，PDB)獲得，它的PDB ID為2OTK11。如圖1(a)所示，該模擬體系含有1個(gè)Aβ16–40和2個(gè)ZAβ3單體。為了便于描述兩個(gè)ZAβ3單體，將與Aβ16–40C端結(jié)合的ZAβ3單體命名為ZAβ31，而將與Aβ16–40N端結(jié)合的ZAβ3單體命名為ZAβ32。其中，Aβ16–40中的L17-D23和A30-V36為β-股結(jié)構(gòu)，分別定義為β1和β2。模擬體系中ZAβ31和ZAβ32形成一個(gè)中心對稱的“Z”型結(jié)構(gòu)域。ZAβ3的單體含有一個(gè)β-股和兩個(gè)α-螺旋。與Aβ16–40的C端和N端β-股結(jié)合的ZAβ3的β股分別定義為Zstrand1和Zstrand2。首先將ZAβ3與Aβ16–40復(fù)合物放入一個(gè)長方形(5.4 nm × 5.6 nm × 4.8 nm)盒子中，然后向該盒子加入水分子，水分子模型為TIP3P。最后加入8個(gè)Na+中和模擬體系。

2.2 分子動力學(xué)模擬

利用NAMD程序進(jìn)行MD模擬12，力場為全原子CHARMM2713。MD模擬過程主要包括能量最小化、平衡和動力學(xué)采樣。模擬體系經(jīng)能量最小化后，首先限制所有蛋白質(zhì)原子的運(yùn)動，僅讓溶劑自由運(yùn)動。這樣可以去除體系中的局部能量較大的蛋白質(zhì)-溶劑分子之間的接觸，保證初始體系的穩(wěn)定。此模擬時(shí)間為10 ps。然后在等溫等壓和等容等溫條件下平衡模擬體系，分別做100 ps。然后將平衡好的模擬體系在等溫等容系綜下模擬20 ns。所有模擬體系的溫度均設(shè)為298 K，并采用Nose-Hoover方法維持恒溫14。粒子的運(yùn)動遵循Langevin方程，在周期性邊界條件下長程作用的庫倫力采用Particle-Mesh-Ewald(PME)算法來計(jì)算15。非鍵相互作用的截?cái)嗑嚯x1.2 nm，并用switch函數(shù)修正來減少計(jì)算誤差。所有氫原子的共價(jià)鍵采用SHAKE算法限制16，其積分步長設(shè)為2 fs。MD模擬過程中應(yīng)用周期性邊界條件。在模擬過程中每40 ps輸出一次坐標(biāo)文件。為了保證模擬結(jié)果的可靠性，進(jìn)行了三次獨(dú)立性重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 (a) ZAβ3與Aβ16–40復(fù)合物模擬前后構(gòu)象疊合圖和(b) Aβ16–40, ZAβ3及其野生型Zwt氨基酸序列

Mutated residues are underlined. The sequences of the secondary structures of α-helix or β-sheet in the ZAβ3:Aβ16–40complex are indicated by purple cylinders or yellow arrows, respectively. color online.

2.3 分析方法

2.3.1 MM-PBSA計(jì)算方法

本研究采用MM-PBSA方法計(jì)算每個(gè)ZAβ3-Aβ16–40復(fù)合物的結(jié)合自由能(Δbind)17,18。根據(jù)式(1)，Δbind為分子間作用能(Δgas)、溶劑化作用能(Δsol)和熵作用項(xiàng)(?)的總和。

括號<…>表明是所有模擬得到的能量項(xiàng)的平均值。代表絕對溫度，為溶質(zhì)熵。gas包含分子間靜電作用項(xiàng)(elec)、范德華作用(vdW)項(xiàng)(vdw)和內(nèi)能項(xiàng)(inter)。由于本研究根據(jù)相同的模擬軌跡進(jìn)行取樣分析，因此內(nèi)能項(xiàng)(inter)為019。因此，本文中的ZAβ3與Aβ16–40復(fù)合物之間的自由能為相對自由能，而不是絕對自由能。故Δgas對結(jié)合自由能的貢獻(xiàn)是Δelec和Δvdw的總和，見式(2)。

溶劑化作用能包含靜電溶劑化能(PB)和非極性溶劑化能(np)，如式(3)所示。

使用CHARMM程序的PBEQ模塊求解線性泊松-玻爾茲曼方程(PB)得到PB。在所有的PB計(jì)算中，溶質(zhì)和溶劑介電常數(shù)分別設(shè)為1和80。Hou等17研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)目標(biāo)蛋白質(zhì)的結(jié)合腔疏水性較強(qiáng)，且目標(biāo)蛋白質(zhì)和配基之間僅存在較弱的靜電相互作用時(shí)，溶質(zhì)介電常數(shù)設(shè)為1是最佳選擇。此外，Wang和Kollman20研究了在溶劑介電常數(shù)為80時(shí)，溶質(zhì)介電常數(shù)分別設(shè)為1和2時(shí)HIV野生型及其突變體二聚體之間的結(jié)合自由能。結(jié)果表明，當(dāng)溶劑介電常數(shù)為80時(shí)，溶質(zhì)介電常數(shù)分別為1和2時(shí)，雖然結(jié)合能的數(shù)值不一樣，但二聚體及其突變體之間的結(jié)合自由能的排列順序一致。當(dāng)溶質(zhì)介電常數(shù)為2時(shí)，其結(jié)合自由能相對于介電常數(shù)為1時(shí)的更負(fù)！由于本研究的ZAβ3-Aβ16–40之間的作用力主要為疏水相互作用，而靜電相互作用作用較弱。此外本研究只是計(jì)算這些殘基的相對結(jié)合自由能而不是絕對結(jié)合自由能。因此，本研究選擇了溶質(zhì)介電常數(shù)為1。離子強(qiáng)度為0。溶劑分子半徑為0.14 nm。np是溶劑空穴作用項(xiàng)和溶質(zhì)-溶劑范德華作用項(xiàng)之和，由式(4)計(jì)算得到：

常數(shù)和分別為2.27 kJ?mol?1?nm?2和3.85 kJ?mol?1。SASA代表溶劑可及表面積。

2.4 自由能分解

每個(gè)殘基的自由能貢獻(xiàn)分解為極性(polar)和非極性作用(nonpolar)，見式(5)。其中每一項(xiàng)繼續(xù)分解為兩個(gè)能量項(xiàng)之和，見式(6)和(7)。在接下來的分析中，polar和nonpolar分別是殘基的靜電和疏水作用貢獻(xiàn)。需要注意的是residue只分解為polar和nonpolar。

每個(gè)殘基的靜電作用能(polar)等于分子間靜電作用能(elec)和靜電溶劑化能(PB)的總和。每個(gè)殘基的靜電作用貢獻(xiàn)由式(8)計(jì)算得到。線性PB方程允許將靜電溶劑化能分解為每個(gè)原子的貢獻(xiàn)。

ZAβ3上每個(gè)殘基的范德華作用能貢獻(xiàn)等于該殘基與Aβ16–40片段之間范德華作用能的一半，對于Aβ16–40片段上每個(gè)殘基的范德華作用能也遵循此原則。每個(gè)殘基的非極性溶劑化作用能與該殘基的溶劑可及表面積的損失成比例，見式(4)。

3 結(jié)果與討論

3.1 結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性

ZAβ3是Hoyer等11利用噬菌體展示篩選得到的一種能夠特異性結(jié)合Aβ16–40單體的蛋白質(zhì)。從圖1(a)可以看出，兩個(gè)ZAβ3單體間通過一個(gè)二硫鍵形成一個(gè)中空的疏水性空腔，ZAβ3單體的β-股與Aβ16–40的β-股相互作用，形成一個(gè)穩(wěn)定的復(fù)合物。本研究以ZAβ3與Aβ16–40復(fù)合物為初始結(jié)構(gòu)，首先利用MD模擬研究了該復(fù)合物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。圖2所示為ZAβ3與Aβ16–40復(fù)合物三次MD模擬軌跡的均方根偏差(RMSD)的平均值隨模擬時(shí)間的變化。三條獨(dú)立MD軌跡的RMSD值隨模擬時(shí)間的變化放在附圖S1(見Supporting Information)中。從圖2可以看出，在模擬初始的1 ns內(nèi)，ZAβ3與Aβ16–40的RMSD值急劇上升到0.15 nm，在接下來的19 ns內(nèi)它們的RMSD值均穩(wěn)定在0.15–0.25 nm之間。這說明該復(fù)合物的結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定。圖1(a)為20 ns MD模擬前后ZAβ3與Aβ16–40復(fù)合物疊合后的三維結(jié)構(gòu)。從圖1(a)可以看出，ZAβ31和ZAβ32的α-螺旋鏈接處由初始的螺旋結(jié)構(gòu)均轉(zhuǎn)換成轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)。此外，Aβ16–40的C末端相比較初始結(jié)構(gòu)變得更加彎曲。除此之外，MD模擬前后ZAβ3與Aβ16–40復(fù)合物的結(jié)構(gòu)基本一致。上述研究結(jié)果均說明ZAβ3與Aβ16–40之間有較強(qiáng)的親和性。

圖2 ZAβ3與Aβ16–40復(fù)合物非氫原子與其初始結(jié)構(gòu)的均方根偏差隨模擬時(shí)間變化

3.2 結(jié)合能自由分解

3.2.1 多肽鏈間結(jié)合自由能分解

為了解析Aβ16–40和ZAβ3復(fù)合物之間的結(jié)合自由能，本文選取了三條20 ns的MD模擬軌跡中的最后5 ns的125幀構(gòu)象進(jìn)行MM-PBSA計(jì)算。Hou等17的研究結(jié)果表明，MD模擬長度和構(gòu)象選取個(gè)數(shù)對MM-PBSA的影響較小。他們的研究結(jié)果表明利用100個(gè)構(gòu)象和600個(gè)構(gòu)象的MM-PBSA的計(jì)算結(jié)果基本一樣?；诖?，本研究也僅從最后5 ns中提取125幀構(gòu)象進(jìn)行結(jié)合自由能計(jì)算，即本研究的MM-PBSA的結(jié)果是基于375幀構(gòu)象的平均值。首先基于三次MD模擬軌跡計(jì)算Aβ16–40與ZAβ3之間的結(jié)合自由能，并將其分解到每一個(gè)氨基酸殘基上，如圖3(a)所示。本研究采用±10.5 kJ?mol?1的標(biāo)準(zhǔn)來識別對自由能貢獻(xiàn)大的殘基19。從圖3(a)可以看出，Aβ16–40與ZAβ3結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸殘基主要為以下14個(gè)：F19、F20、A21、E22、D23、K28、I31、I32、G33、L34、M35、V36、G38和V40。圖3(b)所示為Aβ16–40結(jié)合ZAβ3過程中起關(guān)鍵作用的氨基酸殘基的分布。將其與Aβ17–42五聚體間的作用力分解比較發(fā)現(xiàn)，其中有11個(gè)殘基(F19、F20、A21、D23、K28、I32、L34、M35、V36、G38和V40)在Aβ聚集過程中同樣發(fā)揮重要的作用21。因此，ZAβ3通過封閉Aβ聚集過程中的上述關(guān)鍵氨基酸殘基來穩(wěn)定Aβ單體，這是設(shè)計(jì)Aβ聚集有效抑制劑的必要條件之一。

從圖1(a)可以看出，ZAβ31與Aβ16–40的C端相鄰，因此其與Aβ16–40的主要作用部位集中在Aβ的C端β-股(G29-V36)。MM-PBSA自由能計(jì)算結(jié)果表明，Aβ16–40與ZAβ31的總結(jié)合自由能為?180.28 kJ?mol?1，其中β2區(qū)的貢獻(xiàn)為?128.70 kJ?mol?1，而β1區(qū)(L17-G25)與ZAβ31的結(jié)合自由能僅為3.89 kJ?mol?1，表明ZAβ31與β2區(qū)之間有較強(qiáng)的親和作用，而與β1區(qū)的作用很弱。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，Aβ16–40的β2區(qū)與ZAβ31的關(guān)鍵氨基酸殘基主要為I31、I32、G33、L34、M35、V36、G38和V40(圖3)。此外，Aβ16–40的D23和K28這兩個(gè)帶電關(guān)鍵氨基酸殘基與ZAβ31間的結(jié)合自由能均較大，主要由于這兩個(gè)殘基含有較長的帶電側(cè)鏈。

圖3 ZAβ3-Aβ16–40復(fù)合物中Aβ16–40中各殘基結(jié)合自由能貢獻(xiàn)(a)及其關(guān)鍵殘基分布(b)

ZAβ32與Aβ16–40的N端接近，其與Aβ16–40之間的總結(jié)合自由能是?254.31 kJ?mol?1，其中Aβ16–40的β1區(qū)結(jié)合自由能貢獻(xiàn)為?230.94 kJ?mol?1，β2區(qū)貢獻(xiàn)僅為?30.94 kJ?mol?1。因此，ZAβ32主要與Aβ16–40的β1區(qū)有較強(qiáng)的親和作用力，而與Aβ16–40的β2區(qū)作用力很弱。早期的研究證明，E22和D23是形成Aβ聚集體的關(guān)鍵氨基酸殘基22。由于這兩個(gè)氨基酸含有帶電側(cè)鏈，且靜電作用隨構(gòu)象以及空間距離的變化較大，從而使這些氨基酸貢獻(xiàn)的結(jié)合自由能的計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差較大。例如，D23與ZAβ32的結(jié)合自由能最大達(dá)到(?103.37 ± 66.11) kJ?mol?1，E22則貢獻(xiàn)了(?39.52 ± 26.29) kJ?mol?1。說明ZAβ32與這兩個(gè)帶電關(guān)鍵氨基酸殘基的強(qiáng)烈作用對抑制Aβ聚集起到非常重要的作用。

綜上所述，ZAβ31主要作用于Aβ16–40的β2區(qū)，尤其與β2區(qū)的關(guān)鍵氨基酸殘基I31、I32、G33、L34、M35、V36、G38和V40作用更強(qiáng)烈；ZAβ32主要作用于Aβ16–40的β1區(qū)，其關(guān)鍵氨基酸殘基為F19、F20、A21、E22、D23、K28和G29。此外，ZAβ31和ZAβ32都與Aβ16–40的帶電氨基酸D23和K28有較強(qiáng)的作用。主要原因是這兩個(gè)氨基酸的側(cè)鏈帶有負(fù)電荷，而靜電相互作用是長程作用力。ZAβ3通過封閉Aβ的關(guān)鍵氨基酸殘基和關(guān)鍵肽段來抑制Aβ聚集形成纖維狀結(jié)構(gòu)，同時(shí)這些關(guān)鍵氨基酸殘基和關(guān)鍵肽段與前期Aβ17–42五聚體復(fù)合物單體間結(jié)合自由能解析所得到的結(jié)果一致21。另外值得注意的是，抑制Aβ聚集需要ZAβ3二聚體共同作用，缺少任何一條都很難達(dá)到這樣的效果。此外，ZAβ3和Aβ之間的作用力主要分為以下兩種：一是封閉β區(qū)段的關(guān)鍵氨基酸殘基，從而阻斷Aβ單體間的結(jié)合；二是封閉Aβ的關(guān)鍵氨基酸殘基D23和K28，使其不能形成鏈間鹽橋。因此可以得出兩條多肽鏈所組成的穩(wěn)定空間結(jié)構(gòu)對抑制Aβ聚集也起到非常重要的作用，這種結(jié)構(gòu)為抑制Aβ間相互作用提供了非常有利的環(huán)境。

為了進(jìn)一步研究ZAβ3的關(guān)鍵氨基酸殘基，將ZAβ3與Aβ16–40的結(jié)合自由能分解到ZAβ31和ZAβ32的氨基酸殘基上，如表1所示。為了使該表格簡潔易讀，本表格中僅列出了自由能絕對值大于10.5 kJ?mol?1的殘基。ZAβ3中每個(gè)殘基對Aβ16–40的結(jié)合自由能列入Supporting Information中的表S1。從表1和表S1可以看出，ZAβ3對Aβ16–40的結(jié)合作用主要集中在ZAβ3N端的E15–L22肽段(即Zstrand1和Zstrand2)，即ZAβ3與Aβ16–40相互作用的關(guān)鍵殘基為E15、I16、V17、Y18、L19和P20，這些研究結(jié)果與Wang等23的研究結(jié)果一致。從圖1(a)可以看出，ZAβ3的Zstrand2和Zstrand1分別與 Aβ16–40的疏水核心區(qū)β1和β2結(jié)合并形成反平行的β-折疊結(jié)構(gòu)。相對于β-折疊結(jié)構(gòu)的E15?Y18，殘基L19?L22是轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，構(gòu)象變化較大，因此與Aβ16–40的某些殘基同樣有較強(qiáng)的結(jié)合作用力。此外，ZAβ32的P38?S41靠近Aβ16–40的轉(zhuǎn)角區(qū)域，因此該區(qū)域所含的氨基酸殘基P38和S41也與Aβ16–40之間有較強(qiáng)的親和作用。此外，處于α-螺旋結(jié)構(gòu)中的L45也是關(guān)鍵氨基酸殘基。進(jìn)一步從氨基酸殘基的理化性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，除E15之外，其它殘基均為疏水性氨基酸，因此Zstrand1和Zstrand2與它們相連的四個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)形成一個(gè)疏水性空腔。通過兩個(gè)Zstrand與Aβ16–40的兩個(gè)β股發(fā)生相互作用，阻礙Aβ單體之間的結(jié)合。因此，ZAβ3的β股和無規(guī)卷曲區(qū)域P38–S41是其與Aβ單體結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域。雖然α-螺旋與Aβ單體的結(jié)合作用很小，但其圍成的中心對稱空間結(jié)構(gòu)對穩(wěn)定Aβ單體以及阻礙另一條單體的靠近具有很重要的意義。

表1 ZAβ3-Aβ16–40復(fù)合物中ZAβ3中各氨基酸殘基結(jié)合自由能的貢獻(xiàn)(kJ?mol?1)

The residues with small free energy ranging from ?10.5 to 10.5 kJ?mol?1are not included.

3.2.2 主鏈和側(cè)鏈的結(jié)合自由能

為了進(jìn)一步研究ZAβ3與Aβ16–40復(fù)合物多肽鏈間氨基酸殘基主鏈和側(cè)鏈對結(jié)合自由能的貢獻(xiàn)，將每一個(gè)氨基酸殘基對結(jié)合自由能的貢獻(xiàn)進(jìn)一步分解到每個(gè)氨基酸的主鏈和側(cè)鏈上。圖4為Aβ16–40的每個(gè)殘基的主鏈和側(cè)鏈對ZAβ3的結(jié)合自由能的貢獻(xiàn)。從圖4(a)可以看出，Aβ16–40與ZAβ31的總結(jié)合自由能為?193.43 kJ?mol?1，其中主鏈的貢獻(xiàn)為?140.17 kJ?mol?1，約占73%，這說明Aβ16–40主要通過主鏈與ZAβ31結(jié)合，尤其是β2區(qū)的氨基酸殘基I32、G33、L34、V36、G37、G38和V40。而Aβ16–40與ZAβ32的總結(jié)合自由能為?236.30 kJ?mol?1，主鏈和側(cè)鏈的貢獻(xiàn)分別為?90.18和?146.08 kJ?mol?1。即Aβ16–40與ZAβ32之間的作用中，側(cè)鏈的貢獻(xiàn)稍大一些，主要是因?yàn)閹щ姎埢鵈22和D23的側(cè)鏈貢獻(xiàn)比較大，如圖4(b)所示。而主鏈貢獻(xiàn)較大的關(guān)鍵殘基為F19、F20、A21和D23?？傊贏β16–40與ZAβ3結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸殘基中，除了帶電氨基酸殘基E22、D23和K28外，其余關(guān)鍵氨基酸殘基在多肽鏈結(jié)合過程中均是主鏈起主要作用。

表2為ZAβ3的每個(gè)殘基的主鏈和側(cè)鏈對Aβ16–40的每個(gè)殘基的結(jié)合自由能貢獻(xiàn)。與表1類似，表2僅列出了自由能絕對值大于10.5 kJ?mol?1的殘基。ZAβ3中每個(gè)殘基的主鏈和側(cè)鏈對Aβ16–40的結(jié)合自由能列入附件的表S2中。從表2和S2可以看出，ZAβ31對Aβ16–40結(jié)合自由能的貢獻(xiàn)主要集中在β-股(即E15–L22)。該關(guān)鍵區(qū)段殘基的主鏈和側(cè)鏈對相鄰多肽鏈結(jié)合自由能均有利于它們之間的結(jié)合。ZAβ31與Aβ16–40的結(jié)合自由能為?217.63 kJ?mol?1，主鏈和側(cè)鏈的貢獻(xiàn)分別為?129.92和?87.76 kJ?mol?1，分別約占60%和40%，而β-股的氨基酸殘基的主鏈和側(cè)鏈對Aβ16–40的結(jié)合自由能分別占到整個(gè)蛋白質(zhì)的主鏈和側(cè)鏈貢獻(xiàn)的87%和90%，這說明ZAβ31的β-股是與Aβ16–40結(jié)合的主要區(qū)段。其它殘基對Aβ16–40的結(jié)合作用很小。通過將這些關(guān)鍵氨基酸的結(jié)合能分解到殘基的主鏈和側(cè)鏈上，從表2可以看出，除了殘基Y18外，其它氨基酸的主鏈貢獻(xiàn)大于側(cè)鏈。例如，Y18的主鏈僅貢獻(xiàn)?38.39 kJ?mol?1，而其側(cè)鏈與Aβ16–40的結(jié)合能卻高達(dá)?46.10 kJ?mol?1。ZAβ32每個(gè)殘基的主鏈和側(cè)鏈對Aβ16–40的每個(gè)殘基的結(jié)合自由能貢獻(xiàn)與ZAβ31的結(jié)果類似。除了殘基E15之外，β股的氨基酸殘基的主鏈和側(cè)鏈與Aβ16–40的結(jié)合能的貢獻(xiàn)均為負(fù)。除了殘基Y18、P38和L45之外，氨基酸主鏈的貢獻(xiàn)均要大于側(cè)鏈。尤其是殘基P38和L45，它們與Aβ16–40之間的作用力主要由側(cè)鏈提供。

圖4 ZAβ3-Aβ16–40復(fù)合物中Aβ16–40氨基酸殘基主鏈和側(cè)鏈對(a) ZAβ31和(b) ZAβ32結(jié)合自由能分解

表2 ZAβ3-Aβ16–40復(fù)合物中ZAβ31和ZAβ32氨基酸殘基的主鏈和側(cè)鏈對Aβ16–40結(jié)合自由能分解(kJ?mol?1)

The residues with small free energy ranging from ?10.5 to 10.5 kJ?mol?1are not included.

3.2.3 不同類型的結(jié)合自由能

為了進(jìn)一步深入分析ZAβ3和Aβ16–40之間的作用力類型，將每一個(gè)氨基酸殘基的結(jié)合自由能分解成三種類型的結(jié)合自由能：靜電作用能(elec)、范德華作用能(vdW)和溶劑化非極性作用能(sas)，并基于此來判斷ZAβ3與Aβ16–40之間的作用力類型。圖5所示為Aβ16–40氨基酸殘基對ZAβ31和ZAβ32的結(jié)合自由能分解。從圖5(a)可以看出，Aβ16–40-ZAβ3復(fù)合物中大多數(shù)氨基酸殘基的范德華作用和溶劑化非極性作用都有利于多肽鏈之間的結(jié)合。其中，L34的范德華作用力貢獻(xiàn)最大，約為?13.48 kJ?mol?1。除了殘基F19、A21、D23和A30之外，Aβ16–40的其它殘基與ZAβ3之間的靜電作用均有利于Aβ16–40和ZAβ3之間的相互作用，且D23、K28、I32、L34、V36和G38的絕對值大于10.5 kJ?mol?1。在Aβ16–40與ZAβ32的結(jié)合自由能分解也有類似的結(jié)果，如圖5(b)所示。從圖5(b)可以看出，殘基F19、A21、E22和D23的靜電相互作用要大于vdW和sas的貢獻(xiàn)。尤其是對于兩個(gè)帶電殘基E22和D23，它們貢獻(xiàn)的靜電相互作用分別為?38.39和?56.81 kJ?mol?1。與這兩個(gè)帶電殘基相反，殘基K28的靜電相互作用為21.56 kJ?mol?1，表明K28不利于Aβ16–40與ZAβ32的結(jié)合。

表3和表S3所示為ZAβ31和ZAβ32對Aβ16–40氨基酸殘基的結(jié)合自由能分解。從表S3可以看出，在ZAβ3與Aβ16–40的結(jié)合過程中，β股所含的大多數(shù)氨基酸殘基與Aβ之間的靜電作用、范德華作用和溶劑化非極性作用都有利于復(fù)合物多肽鏈之間的結(jié)合。首先分析Aβ16–40氨基酸殘基對ZAβ31的自由能分解結(jié)果。相對于靜電和范德華作用，雖然多肽間的溶劑化非極性作用均有利于Aβ-ZAβ之間的相互作用，但其貢獻(xiàn)較小(表S3)。ZAβ31的β股包含的殘基V17、Y18、L19、P20、N21和L22與Aβ之間的靜電作用有利于復(fù)合物的結(jié)合，且其絕對值均大于10.5 kJ?mol?1。而ZAβ32只有殘基V17、L19和P20的靜電作用的絕對值大于10.5 kJ?mol?1。范德華作用的情況與靜電作用類似，但其貢獻(xiàn)稍低于靜電相互作用。例如，ZAβ31和ZAβ32只有三個(gè)疏水性殘基I16、Y18和L19的范德華作用的絕對值大于10.5 kJ?mol?1(表3)。

3.3 ZAβ3親和結(jié)合Aβ16–40模式

ZAβ3的結(jié)構(gòu)框架來源于金黃色葡萄球菌的蛋白A的Z結(jié)構(gòu)域，其含有58個(gè)氨基酸殘基(圖1(b))，然后利用噬菌體展示技術(shù)，選擇螺旋1和2區(qū)域內(nèi)的9、10、11、13、14、17、18、24、25、27、28、31和34位氨基酸進(jìn)行了隨機(jī)突變，并經(jīng)過反復(fù)篩選最終獲得與Aβ有較高親和性的ZAβ。從圖1可以看出兩個(gè)ZAβ3的多肽鏈組成了完美的腔體結(jié)構(gòu)-Z結(jié)構(gòu)域(圖6a)。每條多肽鏈由兩個(gè)α-螺旋和一個(gè)β股組成，MM-PBSA分解結(jié)果確定ZAβ3主要通過β股上的氨基酸殘基E15、I16、V17、Y18、L19、P20、N21和L22和Aβ16?40發(fā)生作用。其中，ZAβ31與Aβ16–40的β2區(qū)的關(guān)鍵氨基酸殘基I32、L34和V36以及帶電氨基酸殘基D23、K28結(jié)合，而ZAβ32卻與Aβ16–40β1區(qū)的關(guān)鍵氨基酸殘基F19、F20和A21以及帶電氨基酸殘基E22和D23結(jié)合(圖6(a))。基于上述MM-PBSA自由能計(jì)算和分解結(jié)果，構(gòu)建了ZAβ3的結(jié)合模式圖(圖6(b))。雖然ZAβ3的α-螺旋結(jié)構(gòu)與Aβ16–40的結(jié)合作用很小，但其四個(gè)α-螺旋形成中心對稱的“Z”結(jié)構(gòu)域可以將Aβ16–40單體結(jié)合在該腔體內(nèi)，并利用空間位阻效應(yīng)阻礙了其它Aβ16–40單體的靠近。在ZAβ3的Zstrand的親和吸附和“Z”結(jié)構(gòu)域的狹窄腔體內(nèi)，Aβ16–40單體以β-折疊的形式存在，它的兩個(gè)β股與ZAβ3的Zstrand形成反平行的β-折疊結(jié)構(gòu)。ZAβ3競爭性和選擇性地與Aβ16–40單體結(jié)合，從而有效地抑制了Aβ纖維狀聚集體的形成。ZAβ3的這種結(jié)構(gòu)模式已用于多種淀粉質(zhì)蛋白質(zhì)如Aβ4224，hIAPP25和α-突觸核蛋白26的抑制劑開發(fā)中。

圖5 ZAβ3-Aβ16–40復(fù)合物中Aβ16–40氨基酸殘基對(a) ZAβ31和(b) ZAβ32的結(jié)合自由能分解

The van der Waals (vdW), the nonpalor (sas) , the electrostatic (elec) contributions, are displayed separately for every residue of Aβ16–40. color online

表3 ZAβ3-Aβ16–40復(fù)合物中ZAβ31和ZAβ32氨基酸殘基對Aβ16–40的結(jié)合自由能分解(kJ?mol?1)

The residues with small free energy ranging from ?10.5 to 10.5 kJ?mol?1are not included. elec, electrostatic contribution; vdW, van der Waals contribution; sas, nonpalor solvation contribution.

基于上述研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)對Aβ具有最佳抑制效果的蛋白質(zhì)類(包括短肽)抑制劑通常需要具有如下三個(gè)要素：一是具有與Aβ強(qiáng)烈結(jié)合的多肽片段，從而使蛋白質(zhì)類抑制劑能夠通過這些片段競爭性地與Aβ單體結(jié)合，起到阻止Aβ分子相互聚集的目的，這是蛋白質(zhì)類抑制劑具有較強(qiáng)抑制效果的必要因素；此外，若要達(dá)到選擇性結(jié)合Aβ的目的，最好結(jié)合片段也是β-股結(jié)構(gòu)；二是空間結(jié)構(gòu)較大的附屬結(jié)構(gòu)，這部分的選擇范圍比較廣，ZAβ3的附屬結(jié)構(gòu)為α-螺旋，也可以是親水性強(qiáng)且空間結(jié)構(gòu)較大的有機(jī)分子，它主要是利用空間位阻效應(yīng)，阻止另一條Aβ單體的靠近，從而切斷了Aβ單體間結(jié)合的通道，有效地抑制了Aβ寡聚體或者淀粉樣纖維的形成；三是穩(wěn)定構(gòu)象，例如ZAβ3分子之間形成一個(gè)二硫鍵來穩(wěn)定其“Z”型構(gòu)象?；谝陨辖Y(jié)論可以提煉出Aβ有效蛋白質(zhì)類抑制劑的設(shè)計(jì)三原則：核心結(jié)合片段、空間結(jié)構(gòu)較大的附屬結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定構(gòu)象。利用這種作用模式已開發(fā)出多種蛋白質(zhì)抑制劑如HI1827、β-wrapin28和β-wrapin AS1029。其中，β-Wrapin AS10蛋白質(zhì)抑制劑能夠同時(shí)結(jié)合Aβ、α-突觸核蛋白和hIAPP，并抑制它們的聚集沉淀和細(xì)胞毒性。

上述原則同樣適用于多肽類抑制劑的設(shè)計(jì)。一般情況下，Aβ短肽抑制劑的設(shè)計(jì)思路是僅考慮第一要素，即選擇和設(shè)計(jì)與Aβ單體具有較高親和作用的短肽，而忽略了另外兩個(gè)因素。所以目前大多數(shù)的短肽抑制劑主要為Aβ核心片段及其突變體，如KLVFF30、VVIA31、LPFFD32和LVFFARK8。分析這些短肽抑制劑會發(fā)現(xiàn)，它們均含有β-股結(jié)構(gòu)且與Aβ的β股有較強(qiáng)的親和作用力，因此這些短肽與Aβ單體之間的親和作用力能夠破壞Aβ單體之間的疏水和靜電作用(包含氫鍵)，從而抑制Aβ聚集。但由于這些短肽固有的疏水性較強(qiáng)等理化性質(zhì)，從而使這些多肽抑制劑非常易于自聚，且有的聚集體的毒性遠(yuǎn)大于Aβ聚集體的。例如，基于Aβ結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)獲得的短肽抑制劑LVFFARK就存在此缺點(diǎn)8。雖然短肽抑制劑LVFFARK抑制Aβ42聚集的能力很強(qiáng)且抑制Aβ42聚集的效果隨抑制劑濃度的增加而增加，但當(dāng)LVFFARK和Aβ42濃度比大于1 : 1后LVFFARK濃度的增加反而降低了多肽類抑制劑的抑制效果。主要原因就是LVFFARK非常易于自聚，從而在高濃度下大大降低了其抑制Aβ42聚集的效果。為了克服此缺點(diǎn)，將LVFFARK偶聯(lián)到納米粒子上獲得納米抑制劑，最后獲得高效的短肽修改的納米抑制劑8。發(fā)現(xiàn)該納米抑制劑既能有效抑制Aβ，同時(shí)抑制了LVFFARK的自聚及其毒性。借鑒ZAβ3作用模式，后期可以將傳統(tǒng)的多肽抑制劑偶聯(lián)到空間體積較大的附屬結(jié)構(gòu)(如結(jié)構(gòu)較大的親水性有機(jī)分子或含有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的α-螺旋結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)等)或納米粒子上。利用這些抑制劑的親和部位封閉Aβ的關(guān)鍵氨基酸殘基競爭性地與Aβ單體結(jié)合，另一方面利用附屬結(jié)構(gòu)的空間位阻效應(yīng)阻礙另一條單體的靠近，從而達(dá)到抑制Aβ聚集的雙重效果。

圖6 (a) ZAβ3-Aβ16–40之間的作用力解析和(b) ZAβ3的簡單結(jié)合模式

The hot spots of Aβ16–40are shown in VDW model. Atoms of these hot spots are colored red for oxygen, white for hydrogen, and green for carbon. The hot spots are displayed by licorice model, and hydrophobic residues I16, V17, Y18, L19, P20 and L22 are colored in white. Hydrophilic residue N21 and negative residues E15 are colored in green and red, respectively. color online.

4 結(jié)論

基于全原子MD模擬軌跡，利用MM-PBSA自由能計(jì)算和分解方法計(jì)算了多肽抑制劑ZAβ3和Aβ16–40復(fù)合物之間的結(jié)合自由能計(jì)算并將其分解到每個(gè)氨基酸殘基上，得出了結(jié)合蛋白質(zhì)ZAβ3穩(wěn)定并抑制Aβ聚集的分子機(jī)理。結(jié)論如下：

(1) Aβ16–40與ZAβ3作用的關(guān)鍵氨基酸殘基是F19、F20、A21、E22、D23、K28、I31、I32、G33、L34、M35、V36、G38和V40。這些殘基也在Aβ自聚過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。因此，抑制劑ZAβ3正是通過封閉Aβ的關(guān)鍵氨基酸殘基來抑制Aβ聚集。

(2) 模擬體系中兩個(gè)ZAβ3分別對應(yīng)的β股Zstrand1和Zstrand2分別與Aβ16–40的C端和N端結(jié)合。β-股是ZAβ3與Aβ16–40作用的結(jié)合位點(diǎn)。其中ZAβ31的β-股Zstrand1與Aβ16–40的C端關(guān)鍵氨基酸殘基I31、I32、G33、L34、M35、V36、G38和V40以及帶電氨基酸殘基D23和K28的結(jié)合作用力比較強(qiáng)；ZAβ32的β-股Zstrand2與Aβ16–40的N端關(guān)鍵氨基酸殘基F19、F20、A21以及帶電氨基酸殘基E22、D23和K28的結(jié)合作用力強(qiáng)。通過兩個(gè)肽鏈的共同作用，很好地封閉了Aβ單體間結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸殘基，競爭性和選擇性地與Aβ單體的結(jié)合，抑制Aβ聚集。

(3) ZAβ3的螺旋結(jié)構(gòu)與Aβ16–40的結(jié)合自由能很小。這說明α-螺旋結(jié)構(gòu)在ZAβ3與Aβ16–40結(jié)合的過程中并不是直接作用，而是通過空間位阻作用阻礙另一條Aβ單體的靠近，從而切斷Aβ單體間聚集的通道，達(dá)到抑制Aβ的聚集。

(4) 基于上述研究結(jié)果獲得了ZAβ3二聚體與Aβ16–40的結(jié)合模式：高親和性的結(jié)合片段(β-股)，附屬結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定的構(gòu)象。其中，高親和性結(jié)合片段能夠競爭性地與Aβ單體結(jié)合，附屬結(jié)構(gòu)可以阻礙其它Aβ單體靠近和聚集。這兩個(gè)要素均要建立在有穩(wěn)定的構(gòu)象基礎(chǔ)上，因此三者協(xié)同作用才可以有效地抑制Aβ聚集。

致 謝：本論文所有作者特別感謝來自天津科技大學(xué)海洋與環(huán)境學(xué)院的李麗老師對本文中圖片的加工和語言的潤色。

Supporting Information:available free of chargethe internet at http://www.whxb.pku.edu.cn.

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Molecular Mechanism Underlying Affinity Interactions between ZAβ3and the Aβ16–40Monomer

LIU Fu-Feng1,2,3,4FAN Yu-Bo1LIU Zhen1BAI Shu1,*

(1;2;3;4)

Alzheimer’s disease (AD) is mainly caused by the aggregation of amyloid-β (Aβ) protein. Development of inhibitors to prevent Aβ aggregation is the most efficient method to devise a cure for AD. Aβ aggregation has been found to be inhibited by the affibody protein ZAβ3, selectedphage display. However, the molecular basis of affinity interactions between Aβ and ZAβ3, the interaction region, and important residues of Aβ and ZAβ3remain unclear. Herein, molecular dynamics simulations and free energy calculation and decomposition using the molecular mechanics-Poisson-Boltzmann surface area method (MM-PBSA) were coupled to investigate the molecular mechanism underlying interactions between Aβ and ZAβ3. Interactions between the β-strand of ZAβ3and Aβ16–40were found to contribute greatly to their binding free energy, while that between the α-helix of ZAβ3and ZAβ3has a smaller contribution. Based on the free energy decomposition, hotspot residues of ZAβ3are E15, I16, V17, Y18, L19, P20, N21, and L22 and those of Aβ16–40include F19, F20, A21, E22, D23, K28, I31, I32, G33, L34, M35, V36, G38, and V40. ZAβ3stabilizes the β-sheet by burying the two mostly nonpolar faces of the Aβ hairpin within a large hydrophobic tunnel-like cavity formed by the α-helix. The identified binding motif can be used as a starting point for rational design of protein inhibitors with high affinity for Aβ to prevent Aβ aggregation. The three key characteristics of efficient protein inhibitors are the presence of a high-affinity site (β-strand), a large accessory structure (α-helix), and a stable conformation owing to disulfide bonds. The high-affinity site can competitively bind to the Aβ monomer, and the large accessory structure can block other Aβ monomers; both these elements require a stable conformationdisulfide bonds. These three characteristics of a protein inhibitor can be employed together to suppress Aβ aggregation.

Protein inhibitor; Amyloid-β protein; Molecular dynamics simulation; Free energy decomposition; Molecular mechanism

January 26, 2017;

April 19, 2017;

April 27, 2017.

. Email: sbai@tju.edu.cn; Tel: +86-22-27404981.

10.3866/PKU.WHXB201704274

O641

The project was supported by the National Natural Science Foundation of China (21576199).

國家自然科學(xué)基金(21576199)資助項(xiàng)目