衡陽(yáng)市女性生殖道無(wú)乳鏈球菌的帶菌狀況及分子特征

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(1．南華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生檢驗(yàn)系，湖南 衡陽(yáng) 421001；2．南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

衡陽(yáng)市女性生殖道無(wú)乳鏈球菌的帶菌狀況及分子特征

柏琴琴1，劉蕓槾1，王秋平2，胡倩1，鄧仲良1，陳麗麗1*

(1．南華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生檢驗(yàn)系，湖南 衡陽(yáng) 421001；2．南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科)

目的了解衡陽(yáng)市女性生殖道無(wú)乳鏈球菌的帶菌狀況及分離株的分子特征。方法收集衡陽(yáng)市3家教學(xué)醫(yī)院的女性生殖道分泌物棉簽拭子樣本，對(duì)其中的無(wú)乳鏈球菌進(jìn)行分離、鑒定和藥敏分析，并對(duì)分離株的耐藥基因、血清型、菌毛島類型進(jìn)行分析。結(jié)果無(wú)乳鏈球菌的檢出率為0.88%(3/339)。1株分離株保存失敗，另外2株分離株HY66和HY9-2均對(duì)四環(huán)素和紅霉素耐藥，并攜帶ermB和tetO耐藥基因。此外，HY9-2對(duì)克林霉素、左氧氟沙星、加替沙星耐藥，還攜帶tetM和tetL耐藥基因。2株分離株的血清型為Ⅲ型，同時(shí)攜帶PI-1和PI-2a菌毛島。結(jié)論衡陽(yáng)市女性生殖道無(wú)乳鏈球菌的帶菌率低。分離株都對(duì)紅霉素和四環(huán)素耐藥，并出現(xiàn)了多重耐藥菌株。為防治無(wú)乳鏈球菌的感染，應(yīng)加強(qiáng)無(wú)乳鏈球菌的流行及耐藥情況監(jiān)測(cè)。

無(wú)乳鏈球菌； 女性生殖道； 耐藥； 分子特征

無(wú)乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)，蘭氏分群為B群，又稱B 群鏈球菌(group B streptococcus， GBS)，是一種常見(jiàn)的條件致病菌，常寄生在人體的泌尿生殖道以及下消化道[1]。無(wú)乳鏈球菌能突破宿主的免疫防御系統(tǒng)，引起侵襲性感染和組織損傷。尤其是血清型為Ⅰa、Ⅱ、Ⅲ和Ⅴ 型的菌株常常引起人類感染[2]。孕婦圍產(chǎn)期感染無(wú)乳鏈球菌可能會(huì)導(dǎo)致流產(chǎn)、早產(chǎn)、胎膜早破及新生兒肺炎等并發(fā)癥，嚴(yán)重者可出現(xiàn)母嬰垂直傳播導(dǎo)致新生兒腦膜炎、敗血癥等，危及新生兒生命[1]。此外，無(wú)乳鏈球菌還能感染非孕婦成年人，尤其是老年人，可引起泌尿生殖道、皮膚軟組織感染和心內(nèi)膜炎等[3-4]。隨著抗生素的大量使用，無(wú)乳鏈球菌的耐藥菌株也不斷出現(xiàn)，部分菌株表現(xiàn)對(duì)青霉素耐藥[5-6]。因此，研究人群中無(wú)乳鏈球菌的帶菌情況，血清型別及藥物的敏感性，對(duì)于防治無(wú)乳鏈球菌的感染具有重要意義。

本文擬收集衡陽(yáng)市3家教學(xué)醫(yī)院女性生殖道分泌物標(biāo)本，分離鑒定無(wú)乳鏈球菌，進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，檢測(cè)耐藥基因，并分析血清型及菌毛島類型，以了解衡陽(yáng)市女性生殖道無(wú)乳鏈球菌的帶菌狀況及分子特征。

1 材料與方法

1.1材料與試劑339份女性生殖道棉簽拭子樣本來(lái)源于2014年11月～2015年1月衡陽(yáng)市3家教學(xué)醫(yī)院門診和體檢中心。TSB肉湯和脫纖維綿羊血購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。慶大霉素和萘啶酸為Amresco公司產(chǎn)品。2×Taq PCR Mix購(gòu)自廣州東盛生物科技有限公司。DNA Marker Ⅲ為TIANGEN公司產(chǎn)品。細(xì)菌基因組提取試劑盒為OMEGA公司產(chǎn)品。無(wú)乳鏈球菌參考菌株ATCC 12403，ATCC BAA-611，ATCC 13813和 A909購(gòu)自美國(guó)菌種保存中心，本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2細(xì)菌的分離培養(yǎng)與純化樣本處理參照美國(guó)疾病預(yù)防控制中心制定的無(wú)乳鏈球菌預(yù)防指南(2010版)進(jìn)行[7]。簡(jiǎn)述如下：將樣本接種于含慶大霉素(8 μg/mL)和萘啶酸(15 μg/mL)TSB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)18～24 h。觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)情況，記錄渾濁生長(zhǎng)的樣本。取渾濁生長(zhǎng)管中的液體在含5%脫纖維綿羊血的TSA平板上分區(qū)劃線， 37 ℃培養(yǎng)24 h。觀察血平板上的菌落特征，挑取疑似菌落作革蘭氏染色鏡檢。革蘭陽(yáng)性球菌，鏈狀排列的疑似菌落接種TSB斜面培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h后，放于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3無(wú)乳鏈球菌的鑒定

1.3.1 觸酶試驗(yàn) 在干凈的玻片上滴加1～2 滴無(wú)菌生理鹽水，用接種環(huán)挑取菌落于生理鹽水中抹勻制備濃的菌懸液，然后滴加1～2滴3% 過(guò)氧化氫溶液，靜置1 min內(nèi)產(chǎn)大量氣泡的為陽(yáng)性，不產(chǎn)生氣泡的為陰性。同時(shí)用無(wú)乳鏈球菌參考菌株(ATCC 12403)作陰性對(duì)照，用金黃色葡萄球菌參考菌株(ATCC 25923)作陽(yáng)性對(duì)照。

1.3.2 無(wú)乳鏈球菌16S rRNA種特異性引物快速鑒定 觸酶陰性的菌株用無(wú)乳鏈球菌16S rDNA種特異性引物進(jìn)行PCR鑒定[8]。反應(yīng)體系(25 μL)：2×Taq PCR Mix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，模板1 μL，加ddH2O終體積至25 μL。反應(yīng)參數(shù)為94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物于3%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測(cè)，目的片段大小為220 bp。

1.4藥敏試驗(yàn)藥敏試驗(yàn)采用天地人全自動(dòng)微生物鑒定與藥敏儀(TDR-1002)進(jìn)行，按照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI) 2010版標(biāo)準(zhǔn)判定藥敏試驗(yàn)結(jié)果。

1.5細(xì)菌基因組提取無(wú)乳鏈球菌基因組的提取按照OMEGA細(xì)菌DNA提取試劑盒(D3350-01)說(shuō)明書(shū)操作。提取的細(xì)菌基因組DNA于-20 ℃保存待用。

1.6耐藥基因檢測(cè)以細(xì)菌基因組為模板，表1中引物分別檢測(cè)紅霉素耐藥基因ermA、ermB、ermC、mefA和四環(huán)素耐藥基因tetO、tetK、tetM、tetL[9]。反應(yīng)體系見(jiàn)1.3.2。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30s，72 ℃ 30 s 或90 s(tetK、tetM、tetL 為90 s，其他為30 s)，30 個(gè)循環(huán)； 最后 72 ℃延伸10 min。

1.7莢膜多糖合成相關(guān)基因檢測(cè)參照Imperi M等[10]報(bào)道的多重PCR方法檢測(cè)無(wú)乳鏈球菌的莢膜多糖合成相關(guān)基因，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果可以確定菌株的血清型。引物見(jiàn)表1。反應(yīng)體系(25 μL)：DNA模板 1 μL，2×Taq PCR Mix 12.5 μL，引物cpsI-Ia-6-7-F和cpsI-7-9-F為1 μL ，其余引物0.5 μL，加ddH2O終體積至25 μL。反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性60 s，54 ℃退火60 s，72 ℃延伸2 min，15個(gè)循環(huán)；然后，94 ℃變性60 s，56 ℃退火60 s，72 ℃延伸2 min，25個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳鑒定。以參考菌株ATCC12403，ATCCBAA-611,ATCC 13813和A909為對(duì)照。

1.8菌毛骨架蛋白基因檢測(cè)參照Margarit I等[11]報(bào)道的方法檢測(cè)無(wú)乳鏈球菌的菌毛島PI-1、PI-2a或PI-2b的骨架蛋白BP-1、BP-2a和BP-2b的編碼基因spb1、spb2a和spb2b，由此判斷菌毛島類型。引物序列見(jiàn)表1，反應(yīng)體系同1.3.2，反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃ 5 min，94 ℃ 45 s，54 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s to 120 s(spb2a和spb2b為120 s)反應(yīng)35個(gè)循環(huán)， 72 ℃延伸10 min。

表1 本文所用引物

2 結(jié) 果

2.1無(wú)乳球菌的分離鑒定339份樣本中分離到了3株無(wú)乳鏈球菌，分離率為0.88%。3株分離株分別命名為HY66、HY9-2和HY68，其中HY68保存失敗。分離株在綿羊血平板上的菌落呈圓形、隆起、半透明、光滑、濕潤(rùn)、邊緣整齊，呈α溶血。革蘭染色陽(yáng)性，鏈狀排列。用無(wú)乳鏈球菌16S rRNA種特異性引物進(jìn)一步鑒定，3株分離株均擴(kuò)增出了大小為220 bp的目的條帶(圖1)。

圖1 無(wú)乳鏈球菌16S rRNA種特異性引物檢測(cè)M：marker；泳道1、2、4、6分別為HY66、HY9-2、HY68和ATCC 12403；泳道3、5為陰性檢測(cè)結(jié)果；泳道7為陰性對(duì)照

2.2耐藥性分析藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示：HY66對(duì)四環(huán)素和紅霉素耐藥；HY9-2為多重耐藥菌，對(duì)林可霉素類藥物克林霉素、四環(huán)素類藥物四環(huán)素、喹諾酮類藥物左氧氟沙星和加替沙星及大環(huán)內(nèi)酯類藥物紅霉素耐藥(表2)。菌株HY66檢出了紅霉素耐藥基因ermB和四環(huán)素耐藥基因tetO。菌株HY9-2檢出了紅霉素耐藥基因ermB，四環(huán)素耐藥基因tetO、tetM和tetL(圖2)。

表2藥敏試驗(yàn)結(jié)果

抗生素測(cè)試結(jié)果HY66HY9-2青霉素SS萬(wàn)古霉素SS氨芐西林SS頭孢吡肟SS頭孢曲松SS利奈唑胺SS美羅培南SS克林霉素SR四環(huán)素RR左氧氟沙星SR加替沙星SR紅霉素RR

S：敏感，R：耐藥

圖2 耐藥基因檢測(cè)A：ermB基因檢測(cè)，泳道1～3分別 為HY66、 HY9-2和陰性對(duì)照；B：tetM基因檢測(cè)，泳道1～3分別為HY66、HY9-2和陰性對(duì)照；C：tetL基因檢測(cè)，泳道1～3分別為HY66、HY9-2和陰性對(duì)照；D：tetO基因檢測(cè)，泳道1～3分別為HY66、HY9-2和陰性對(duì)照

2.3莢膜多糖合成相關(guān)基因檢測(cè)采用多重PCR方法，對(duì)分離株和參考菌株ATCC12403，ATCC BAA-611，ATCC13813和A909的莢膜多糖合成相關(guān)基因進(jìn)行鑒定，結(jié)果如圖3所示，2株分離株的帶型與參考株ATCC12403(Ⅲ型)一致，均為Ⅲ型(圖3)。

2.4菌毛骨架蛋白基因檢測(cè)2株分離株都缺乏spb2b基因，均有1型和2a型菌毛島骨架蛋白基因spb1和spb2a(圖4)。

3 討 論

無(wú)乳鏈球菌在女性生殖道中的定植率較高。Meta分析顯示全球不同國(guó)家孕婦生殖道中無(wú)乳鏈球菌的定植率平均達(dá)17.9% ，非洲地區(qū)最高為22.4%，亞洲地區(qū)最低為11.1%[12]。國(guó)內(nèi)學(xué)者張傳飛等[5]和錢香等[6]報(bào)道育齡女性生殖道無(wú)乳鏈球菌感染率達(dá)3.79%～5.9%。本研究從339份女性生殖道分泌物棉簽拭子樣本中，檢出3份無(wú)乳鏈球菌陽(yáng)性標(biāo)本，檢出率為 0.88%，明顯低于國(guó)內(nèi)其他學(xué)者的報(bào)道。可能與下列因素有關(guān)：①樣本數(shù)量相對(duì)較少，調(diào)查的時(shí)間跨度短。國(guó)內(nèi)學(xué)者多采取回顧性分析的方法，樣本數(shù)量較多，調(diào)查的時(shí)間跨度較長(zhǎng)。例如錢香等[6]回顧性分析了2004～2011年間臨床送檢的11484份標(biāo)本，共分離到471株無(wú)乳鏈球菌，分離率為4.1%。②樣本的采集部位不同，對(duì)分離結(jié)果有影響。Quinlan等[13]報(bào)道18.5%的GBS陽(yáng)性患者陰道分泌檢測(cè)結(jié)果為陰性，但直腸分泌物標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。本研究的標(biāo)本均為陰道分泌物棉簽拭子標(biāo)本，故檢出率可能偏低。此外，本次調(diào)查中，高校職工和企業(yè)員工的健康體檢樣本占43.3%。這部分人群大多接受較高層次的教育，衛(wèi)生意識(shí)和生活環(huán)境良好，無(wú)乳鏈球菌的帶菌率可能相對(duì)較低。

圖3 多重PCR檢測(cè)莢膜多糖合成相關(guān)基因1：A909(Ⅰa);2：ATCC 13813(Ⅱ);3：ATCC BAA-611(Ⅴ);4：ATCC 12403(Ⅲ);5～7：HY66、HY9-2和陰性對(duì)照

圖4 菌毛骨架蛋白基因檢測(cè)A：菌毛島PI-1骨架蛋白BP-1編碼基因spb1檢測(cè)，泳道1～5分別為A909、ATCCBAA-611、HY66、HY9-2和陰性對(duì)照；B：菌毛島PI-2a和PI-2b的骨架蛋白BP-2a、BP-2b的編碼基因spb2a和spb2b的檢測(cè)，泳道1～5分別為ATCC12403、ATCCBAA-611、HY66、HY9-2和陰性對(duì)照，泳道7～10分別為A909、ATCCBAA-611、HY66和HY9-2，泳道11～12為陰性對(duì)照

近年來(lái)，無(wú)乳鏈球菌對(duì)四環(huán)素、紅霉素、克林霉素及左氧氟沙星的耐藥率較高，其中對(duì)四環(huán)素的耐藥率可達(dá)80%以上，紅霉素的耐藥率可達(dá)50%以上[5-6]。本研究中，2株分離株均對(duì)紅霉素和四環(huán)素耐藥，其中分離株HY9-2為多重耐藥菌株，對(duì)克林霉素、四環(huán)素、左氧氟沙星、加替沙星和紅霉素均耐藥。Lee和Lai報(bào)道紅霉素耐藥基因ermB的檢出率最高[14]。本研究2株分離株均檢測(cè)到ermB基因，未檢測(cè)到 ermA、ermC、mefA基因，這與Lee和Lai的報(bào)道一致。四環(huán)素耐藥基因中，tetM檢出率最高，tetL和tetO的檢出率低，少數(shù)四環(huán)素耐藥菌株中同時(shí)存在多種耐藥基因[15]。本研究分離株HY-9-2同時(shí)攜帶tetO、tetM和tetL基因。

根據(jù)莢膜多糖的化學(xué)組成、結(jié)構(gòu)和血清學(xué)特性，無(wú)乳鏈球菌分為十個(gè)血清型即Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ～Ⅸ[8]。引起人類感染的主要為血清型為Ⅰa、Ⅱ、Ⅲ和 Ⅴ型[2]，我國(guó)流行的型別主要是Ⅲ型[2,15]。本研究通過(guò)多重PCR鑒定莢膜多糖合成酶基因結(jié)果顯示，2株分離株均為Ⅲ型，這與國(guó)內(nèi)其他學(xué)者報(bào)道一致。

菌毛是無(wú)乳鏈球菌重要的毒力因子，在細(xì)菌的粘附、侵襲和生物被膜的形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用，并且還是一種良好的抗原，是制備疫苗的候選[11]。無(wú)乳鏈球菌有三種菌毛島即：菌毛島-1(pilus islands-1，PI-1)、菌毛島2a(pilus islands-2a，PI-2a)和菌毛島-2b(pilus islands-2bPI-2b)[11]。無(wú)乳鏈球菌人源分離菌株至少含有一種菌毛島，大多數(shù)菌株攜帶PI-2a，同時(shí)攜帶PI-1和PI-2a菌株可達(dá)40%以上[11]。本研究中2株分離株不含PI-2b，同時(shí)攜帶PI-1和PI-2a。

綜上所述，本研究分離的無(wú)乳鏈球菌均對(duì)四環(huán)素和紅霉素耐藥，血清型為Ⅲ型，同時(shí)攜帶PI-1和PI-2a菌毛島。多重耐藥菌株的檢出提示無(wú)乳鏈球菌對(duì)抗生素的耐藥情況有加劇的趨勢(shì)，臨床應(yīng)加強(qiáng)對(duì)無(wú)乳鏈球菌的流行及耐藥情況監(jiān)測(cè)。

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PresenceandmolecularcharacterizationofStreptococcusagalactiaeingenitaltractspecimensofwomeninHengyang

BAI Qinqin,LIU Yunman,WANG Qiuping,et al

(DepartmentofSanitaryInspection，SchoolofPublicHealth，UniversityofSouthChina，Hengyang421001，Hunan，China)

ObjectiveTo investigate the prevalence rate and molecular characterization of Streptococcus agalactiae in genital tract swabs of women in Hengyang city.MethodsThe genital tract swabs of women which were collected from 3 teaching hospitals in Hengyang,were used to screen for S. agalactiae colonization. Then,isolates were detected for antimicrobial susceptibility,and their serotypes,pilus island types and genes encoding resistance were studied.ResultsAmong 339 genital tract swabs,3(0.88%) were positive for S. agalactiae. Except for one isolate that was failed for storage,the other two isolates HY66 and HY9-2 was both resistant to erythromycin and tetracycline,and carried the ermB gene with tetO gene. The isolate HY9-2 was also resistant to climdamycin,levofloxacin and gatifloxacin,and carried another two tetracycline resistance gene:tetM and tetL. The 2 isolates belong to serotype Ⅲ,their pilus island type consisted in the concomitant presence of PI-1 and PI-2a.ConclusionThe prevalence rate of S. agalactiae in genital tract swabs of women in Hengyang is low. The 2 isolate was resistant to erythromycin and tetracycline,and a multi-drug resistance isolates was obtained. The monitoring of prevalence of S. agalactiae and drug resistance should be strengthened for the prevention of S. agalactiae infection in Hengyang.

S. agalactiae; women genital tract; antimicrobial susceptibility; molecular characterization

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.05.008

2017-02-06；

2017-08-28

南華大學(xué)博士啟動(dòng)基金項(xiàng)目(2013XQD21)；衡陽(yáng)市科技局項(xiàng)目(2015KS11).

*通訊作者，E-mail： chlili720612@163.com.

R378.12

A

蔣湘蓮)