宦海琳，白建勇，閆俊書(shū)，周維仁，徐小明，顧洪如

日糧添加地衣芽孢桿菌對(duì)仔豬發(fā)酵床墊料理化性質(zhì)及微生物群落的影響

宦海琳，白建勇，閆俊書(shū)，周維仁，徐小明，顧洪如*

（江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，南京 210014）

試驗(yàn)旨在研究發(fā)酵床飼養(yǎng)模式下，豬日糧中添加地衣芽孢桿菌對(duì)發(fā)酵床的理化性質(zhì)和微生物群落的影響。分別飼喂基礎(chǔ)飼糧（對(duì)照組）、基礎(chǔ)飼糧+桿菌肽鋅+硫酸黏桿菌素（抗生素組）和基礎(chǔ)日糧+地衣芽孢桿菌（益生菌組）的試驗(yàn)日糧。結(jié)果表明：飼糧中添加地衣芽孢桿菌能顯著提高發(fā)酵床墊料蛋白酶活性（p＜0.05），對(duì)墊料脲酶活性和銨態(tài)氮含量無(wú)顯著影響（P＞0.05）；試驗(yàn)第15 d時(shí)，抗生素組的墊料放線(xiàn)菌數(shù)量顯著低于對(duì)照組（p＜0.05）；第35 d時(shí)，益生菌組的芽孢桿菌數(shù)量顯著高于其他組（p＜0.05）；第49 d時(shí)，益生菌組的芽孢桿菌數(shù)量顯著高于抗生素組（p＜0.05），抗生素組的葡萄球菌數(shù)量比對(duì)照組顯著降低（p＜0.05）；益生菌組、抗生素組的大腸桿菌低于對(duì)照組，抗生素組的細(xì)菌總數(shù)、芽孢桿菌數(shù)量低于對(duì)照組，但差異均不顯著（P＞0.05），飼糧抗生素一定程度上減少了墊料益生菌，但能有效減少墊料病原菌；各處理組間，墊料微生物DGGE的香農(nóng)-威納指數(shù)、均勻度均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。飼用地衣芽孢桿菌顯著增加墊料中芽孢桿菌分布數(shù)量，提高墊料中墊料蛋白酶活，沒(méi)有顯著影響墊料細(xì)菌多樣性指數(shù)，一定程度上提高糞便原位降解效率。

地衣芽孢桿菌；墊料；理化性質(zhì)；微生物群落

隨著規(guī)模集約化養(yǎng)豬的發(fā)展，豬糞尿帶來(lái)的環(huán)境污染問(wèn)題日益突出。微生物發(fā)酵床養(yǎng)豬技術(shù)利用微生物的分解能力，降解、消化生豬養(yǎng)殖過(guò)程中產(chǎn)生的糞尿排泄物，實(shí)現(xiàn)豬糞尿就地減量化，緩解規(guī)模養(yǎng)豬場(chǎng)的環(huán)境污染問(wèn)題，是一種生態(tài)養(yǎng)殖的新模式。但由于生豬養(yǎng)殖中飼添和治療過(guò)量使用抗生素，影響發(fā)酵床墊料微生物的生長(zhǎng)繁殖，降低微生物對(duì)糞便的分解能力，發(fā)酵產(chǎn)熱量減少[1]，制約了發(fā)酵床技術(shù)的推廣。

芽孢桿菌作為益生菌，具有酶系豐富、抑菌和抗逆性強(qiáng)等優(yōu)良特性，在飼料生產(chǎn)、糞便處理和環(huán)境污染治理等方面得到廣泛應(yīng)用[2-3]。在飼糧中添加芽孢桿菌制劑能改善動(dòng)物腸道，提高消化吸收功能，抑制有害菌的增殖，提高機(jī)體免疫力[4-5]，是最具潛力的抗生素替代品。目前飼用芽孢桿菌的研究主要集中于傳統(tǒng)水沖圈養(yǎng)殖，而在發(fā)酵床飼養(yǎng)條件下，研究飼用芽孢桿菌對(duì)發(fā)酵床墊料的影響卻罕見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)酵床具有豐富的微生物多樣性[6]，微生物區(qū)系與發(fā)酵菌劑、糞便微生物以及墊料基質(zhì)的理化性質(zhì)等因素緊密相關(guān)[7-8]。研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵床墊料和豬糞便中含有的細(xì)菌種類(lèi)基本相同，但含量差異較大，腸道細(xì)菌與墊料環(huán)境之間具有雙向的適應(yīng)性和選擇性[9]。已有的研究結(jié)果表明，絕大部分飼用芽孢桿菌不能在畜禽腸道定植，屬于腸道中的“過(guò)路菌”，通過(guò)糞便排出動(dòng)物體外[10]。芽孢桿菌作為添加到墊料中的發(fā)酵床菌劑，已在發(fā)酵床中應(yīng)用[11]，隨著糞便排出的飼用芽孢桿菌對(duì)墊料微生物的影響尚未有研究。本研究以發(fā)酵床飼養(yǎng)模式為基礎(chǔ)，研究飼糧中添加芽孢桿菌，對(duì)發(fā)酵床的理化性質(zhì)和微生物群落的影響，為飼用芽孢桿菌在發(fā)酵床養(yǎng)殖模式中的應(yīng)用提供參考，為墊料中糞便原位轉(zhuǎn)化效率的提高建立理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 基礎(chǔ)飼糧與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

基礎(chǔ)飼糧參照NRC（1998）豬的營(yíng)養(yǎng)需要配制。本試驗(yàn)分為如下3組：對(duì)照組（Control treatment，CT）飼喂基礎(chǔ)飼糧；抗生素組（Antibiotic treatment，ABT）在基礎(chǔ)飼糧中添加40 mg·kg-1桿菌肽鋅和20 mg·kg-1硫酸黏桿菌素；益生菌組（Probiotics treatment，PBT）在基礎(chǔ)飼糧中添加300 mg·kg-1地衣芽孢桿菌。

將108頭35日齡，體重13 kg左右的蘇鐘豬，隨機(jī)分成3組，每組3重復(fù)，每重復(fù)12頭，自由采食及飲水。試驗(yàn)于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院六合基地發(fā)酵床豬場(chǎng)進(jìn)行。每組飼養(yǎng)欄的發(fā)酵面積35 m2，深60 cm。發(fā)酵床所用墊料主要為稻殼、木屑（分別占50%左右），墊料已使用6個(gè)月飼養(yǎng)1批豬。發(fā)酵床的日常維護(hù)主要包括墊料的淺層翻扒，將糞便集中的區(qū)域人工分散在發(fā)酵床面10 cm下[6]。

1.2 樣品的采集與制備

在正試期第15、35、49 d，每欄（重復(fù)）豬舍按照Z(yǔ)字形選取5個(gè)采樣點(diǎn)，于發(fā)酵床床面0～20 cm切面采集墊料樣本，5個(gè)點(diǎn)充分混勻，再采用四分法取500 g，放入冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室，取100 g左右用于微生物平板培養(yǎng)，其余部分存放于-70℃冰箱。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 墊料理化性質(zhì)

墊料中蛋白酶的測(cè)定采用滴定法[12]，墊料中脲酶的測(cè)定采用比色法[12]，墊料銨態(tài)氮的測(cè)定采用氯化鉀浸提-靛酚藍(lán)比色法。

1.3.2 墊料主要菌群數(shù)量

總細(xì)菌用營(yíng)養(yǎng)瓊脂（NA）培養(yǎng)基37℃恒溫培養(yǎng)24 h；芽孢桿菌的稀釋液在80℃水浴10 min后用營(yíng)養(yǎng)瓊脂（NA）培養(yǎng)基37℃恒溫培養(yǎng)24 h；放線(xiàn)菌用高氏一號(hào)培養(yǎng)基28℃恒溫培養(yǎng)7 d；真菌用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)5 d；金黃色葡萄球菌、大腸桿菌分別用甘露醇氯化鈉瓊脂（MSA）、伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基（EMB）37℃恒溫培養(yǎng)48 h。每個(gè)樣品做3個(gè)平行，同時(shí)測(cè)定每個(gè)樣品的水分。微生物數(shù)量用每克墊料（干重）中微生物菌落數(shù)的對(duì)數(shù)lg（CFU·g-1干重）表示。

1.3.3 墊料微生物區(qū)系

1.3.3.1 墊料樣品的預(yù)處理

發(fā)酵床墊料樣品的預(yù)處理參考宦海琳等[8]的方法。稱(chēng)取5 g解凍樣品，用50 mL磷酸鹽緩沖液浸提15 min，單層紗布過(guò)濾，取濾液經(jīng) 10 000 r·min-1離心10 min，棄上清，留沉淀備用。

1.3.3.2 墊料微生物總DNA的提取

將前處理的樣品轉(zhuǎn)移至已滅菌的含鋯珠的Screw-capped管中混勻，加入1 mL TNI 50和150 μL酸性酚（水飽和酚），Bead-beader勻漿（2000 r·min-1，3 min），冰上冷卻，加入 150 μL 氯仿/異戊醇，10 000 r·min-1離心5 min。上清液加入150 μL氯仿/異戊醇和150 μL TE 飽和酚，10 000 r·min-1離心 1 min。上清液加入 300 μL 氯仿/異戊醇，10 000 r·min-1離心 1 min收集上層水相，加醋酸鈉和異丙醇沉淀，沉淀物用70%的冰乙醇，風(fēng)干沉淀，加無(wú)菌TE緩沖液溶解。

1.3.3.3 細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)PCR擴(kuò)增

用帶有GC夾的細(xì)菌通用引物341F-GC（5′CGCCC GCCGC GCGCG GCGGG CGGGG CGGGG GCACG GGGGG CCTAC GGGAG GCAGC AG）和 517R（5′ATTAC CGCGG CTGCT GG）[13]。PCR 反應(yīng)體系為：Premix Taq（含緩沖液、dNTP、MgCl2、Taq DNA 聚合酶，購(gòu)于 TaKaRa 公司）25 μL，DNA 模板 2 μL，上下游引物 3 μL，無(wú)菌雙蒸水 19 μL，BSA（牛血清白蛋白）1 μL。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性 5 min，94℃變性 40 s，56℃退火1 min，72℃延伸40 s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃保存。

1.3.3.4 DGGE分析

DGGE分析采用Bio-Rad電泳系統(tǒng)，聚丙烯酰胺凝膠濃度為8%，變性梯度為42%～60%[14]，200 V電壓預(yù)電泳10 min，然后在60 V固定電壓下電泳16 h，電泳結(jié)束后用銀染法染色。在60℃，1×TAE，60 V條件下電泳16 h，DGGE凝膠經(jīng)GS-800型掃描儀（Bio-Rad，美國(guó)）掃描輸入計(jì)算機(jī)，采用凝膠分析軟件Molecular Analysis 1.61（Bio-Rad，美國(guó)）進(jìn)行分析。用Shannon-Wiener多樣性指數(shù)（H′），均勻度指數(shù)（E′）指標(biāo)來(lái)比較各個(gè)樣品的細(xì)菌多樣性，計(jì)算公式如下：

式中：Pi由公式Pi=ni/H計(jì)算得來(lái)（ni為密度曲線(xiàn)上某一條帶的峰高；H為所有峰高之和）；E′=H/lnS（S為樣品中總的條帶數(shù)）。

采用UPGMA分析比較不同墊料細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的相似性。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用Excel 2003對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行初步統(tǒng)計(jì)，用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANO VA），并用Duncan法進(jìn)行多重比較，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 地衣芽孢桿菌對(duì)發(fā)酵床墊料蛋白酶、脲酶活性和銨態(tài)氮含量的影響

地衣芽孢桿菌對(duì)發(fā)酵床墊料理化性質(zhì)的影響如表1所示。試驗(yàn)第15 d時(shí)，益生菌組墊料蛋白酶比對(duì)照組、抗生素組均顯著提高（p＜0.05）；第35 d時(shí)，益生菌組墊料蛋白酶比對(duì)照組顯著提高（p＜0.05）；整個(gè)養(yǎng)殖期，益生菌組墊料蛋白酶均高于其他組。試驗(yàn)第35、49 d時(shí)，益生菌組墊料脲酶活性分別比對(duì)照組提高 15.27%、20.99%，但均未達(dá)到顯著差異（P＞0.05）。整個(gè)試驗(yàn)期各組銨態(tài)氮含量隨著養(yǎng)殖時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，各組間的銨態(tài)氮含量沒(méi)有明顯差異（P＞0.05）。

2.2 地衣芽孢桿菌對(duì)發(fā)酵床墊料微生物數(shù)量的影響

地衣芽孢桿菌對(duì)發(fā)酵床墊料微生物數(shù)量的影響如表2所示。發(fā)酵床墊料微生物主要由細(xì)菌組成，細(xì)菌分布數(shù)量在 9.1×108～2.0×109CFU·g-1之間，真菌分布數(shù)量在 1.3×106～3.7×106CFU·g-1之間，放線(xiàn)菌分布數(shù)量在 1.9×106～2.0×107CFU·g-1之間；在細(xì)菌組成中，芽孢桿菌的分布數(shù)量要大于金黃色葡萄球菌、大腸桿菌，三種細(xì)菌的分布數(shù)量分別為1.4×107～5.0×107CFU·g-1、4.2×105～1.6×106CFU·g-1、3.0×105～6.5×106CFU·g-1。

表1 益生菌對(duì)發(fā)酵床墊料蛋白酶、脲酶活性和銨態(tài)氮含量的影響Table 1 Effects of probiotics on the activity of proteinase，urease and the content of ammonium in fermentation-bed litters

表2 益生菌對(duì)發(fā)酵床墊料主要菌群數(shù)量的影響Table 2 Effects of probiotics on the number of main microbial flora in fermentation-bed litters

試驗(yàn)第15 d時(shí)，抗生素組發(fā)酵床墊料放線(xiàn)菌數(shù)量顯著低于對(duì)照組（p＜0.05）；試驗(yàn)第35 d時(shí)，益生菌組的芽孢桿菌數(shù)量顯著高于對(duì)照組和抗生素組（p＜0.05）；試驗(yàn)第49 d時(shí)，益生菌組的芽孢桿菌數(shù)量顯著高于抗生素組（p＜0.05），抗生素組的金黃色葡萄球菌數(shù)量均比對(duì)照組顯著降低（p＜0.05）。養(yǎng)殖期間，益生菌組、抗生素組的大腸菌群低于對(duì)照組，抗生素組的細(xì)菌總數(shù)低于對(duì)照組，益生菌組的細(xì)菌總數(shù)均高于其他組，但差異均不顯著（P＞0.05）。整個(gè)試驗(yàn)期，各處理組的真菌總數(shù)沒(méi)有顯著差異。

2.3 地衣芽孢桿菌對(duì)發(fā)酵床墊料微生物區(qū)系的影響

將PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DGGE分離，得到不同墊料樣品的細(xì)菌DGGE圖譜（圖1）。由圖1可知，DGGE圖譜中電泳條帶數(shù)目、強(qiáng)度和遷移率均存在一定程度的差異，顯示生物發(fā)酵床中的細(xì)菌種群的多樣性，同時(shí)也表明飼喂不同日糧影響了發(fā)酵床系統(tǒng)的細(xì)菌豐富度，從而使墊料微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性發(fā)生變化。由圖1還看出，不同墊料間具有許多共同的條帶，說(shuō)明這些發(fā)酵床墊料存在一些共有的細(xì)菌類(lèi)型，而且某些公共條帶的強(qiáng)度上也不相同，表明同一微生物物種在不同墊料樣品的豐度上也存在一定的差異。

為了進(jìn)一步揭示墊料間細(xì)菌DNA片段的差異，采用UPGMA對(duì)墊料樣品的DDGE指紋圖譜作相似性聚類(lèi)分析，其結(jié)果見(jiàn)圖2。對(duì)照組與益生菌組在66%的相似性水平上聚為一類(lèi)。一般不同條帶相似度高于60%的兩個(gè)群體就具有較好的相似性[15]?？股亟M與對(duì)照組的相似性低，僅為53%。根據(jù)電泳圖譜中每個(gè)條帶的信息，對(duì)各樣品中的細(xì)菌多樣性指數(shù)（H′），豐富度（E）等指標(biāo)進(jìn)行了綜合分析，結(jié)果如表3所示。墊料樣品各組間發(fā)酵床墊料細(xì)菌多樣性指數(shù)（H′），豐富度（E）均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

3 討論

圖1 發(fā)酵床墊料DGGE圖譜Figure 1 DGGE profile in fermentation-bed litters

圖2 發(fā)酵床墊料細(xì)菌群落聚類(lèi)分析進(jìn)化樹(shù)Figure 2 Clustering phylogenetic analysis in fermentation-bed liters

表3 益生菌對(duì)發(fā)酵床墊料DGGE圖譜條帶數(shù)和多樣性指數(shù)的影響Table 3 Effects of probiotics on the evenness and Shannon index of DGGE profiles in fermentation-bed litters

發(fā)酵床墊料的酶活性高低是評(píng)價(jià)墊料運(yùn)行和微生物活性的有效指標(biāo)[16]。蛋白酶參與糞便中含氮化合物的分解，將墊料中的蛋白質(zhì)分解為小肽、氨基酸等小分子物質(zhì)。脲酶能夠?qū)⒛蛩胤纸鉃榘?、二氧化碳和水。墊料中蛋白酶和脲酶是由微生物合成，二者與墊料氮素轉(zhuǎn)換密切相關(guān)[17]。本研究顯示，飼糧中添加益生菌顯著提高墊料蛋白酶活性，脲酶與對(duì)照組相比有提高趨勢(shì)，表明益生菌在飼糧中的添加能夠在一定程度上提高墊料對(duì)糞便的原位降解效率。張慶寧等[18]在發(fā)酵床中分離的優(yōu)勢(shì)芽孢桿菌能夠分泌過(guò)氧化氫酶、脲酶、蛋白酶等酶類(lèi)，利用豬糞迅速生長(zhǎng)。尹紅梅等[19]在室內(nèi)模擬條件下，將微生物制劑接種到鋸木屑-稻殼墊料中，發(fā)現(xiàn)接種組比未接種組蛋白酶、脲酶活性都顯著提高，試驗(yàn)進(jìn)行49 d時(shí)益生菌組的蛋白酶高于對(duì)照組，但無(wú)顯著差異，增幅小于15 d和35 d時(shí)。究其原因可能與試驗(yàn)后期糞便量增多有關(guān)，飼喂芽孢桿菌與墊料中添加芽孢桿菌聯(lián)合使用，能更高效地提高糞便的原位降解效率。銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮、氨態(tài)氮是墊料中無(wú)機(jī)氮的主要存在形式[20]，銨態(tài)氮能夠進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為NH3，所以通常用銨態(tài)氮含量來(lái)反映墊料中NH3的生成狀況。脲酶能夠?qū)⒛蛩胤纸獬砂?，增加墊料銨態(tài)氮含量[16]，土壤中的脲酶活性與銨態(tài)氮含量表現(xiàn)出一定的正相關(guān)[21]。發(fā)酵良好的墊料中存在一定的孔隙，在有氧條件下硝化細(xì)菌能夠?qū)@態(tài)氮轉(zhuǎn)化為亞硝態(tài)氮或硝態(tài)氮[22]，墊料中的細(xì)菌能以銨態(tài)氮和硝態(tài)氮為氮源直接將無(wú)機(jī)氮轉(zhuǎn)化為菌體蛋白[23]。益生菌組墊料銨態(tài)氮含量的增加可能與脲酶活性的增強(qiáng)直接相關(guān)。

微生物區(qū)系及其優(yōu)勢(shì)微生物在墊料發(fā)酵和使用過(guò)程中起著非常重要的作用[24]。發(fā)酵床基質(zhì)墊料中不同微生物分布數(shù)量與墊料的理化性質(zhì)、微生物間的相互作用、腸道微生物等多種因素密切相關(guān)[25-26]。腸道微生物又與飼糧變化有關(guān)[4-5]。本試驗(yàn)研究了飼糧對(duì)發(fā)酵床基質(zhì)墊料微生物種群結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在墊料微生物組成中，細(xì)菌是優(yōu)勢(shì)種群，對(duì)豬糞的降解、病原菌的抑制等起主導(dǎo)作用，真菌和放線(xiàn)菌的分布數(shù)量與細(xì)菌相比，低2～3個(gè)數(shù)量級(jí)，基質(zhì)墊料中細(xì)菌數(shù)量隨使用時(shí)間呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，放線(xiàn)菌數(shù)量基本呈逐漸減少趨勢(shì)，研究結(jié)果與鄭雪芳等[27]一致。已有研究表明芽孢桿菌屬細(xì)菌是墊料細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌，對(duì)豬生物發(fā)酵床墊料中有機(jī)質(zhì)的降解發(fā)揮重要作用[28-29]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，墊料中芽孢桿菌分布數(shù)量高于大腸桿菌、金黃色葡萄球菌，為細(xì)菌中的優(yōu)勢(shì)菌群。飼糧中添加地衣芽孢桿菌，提高了仔豬消化道芽孢桿菌數(shù)量[30]，芽孢桿菌隨糞便排泄到發(fā)酵床墊料中，顯著增加墊料中芽孢桿菌的分布。芽抱桿菌耐高溫和耐酸堿，易適應(yīng)發(fā)酵床的墊料環(huán)境。發(fā)酵床墊料微生物的活動(dòng)類(lèi)似于好氧堆肥，而在好氧堆肥過(guò)程中，厚壁菌門(mén)中的芽孢桿菌屬細(xì)菌能迅速定植，快速降解堆料中的有機(jī)物，在堆肥過(guò)程中始終占優(yōu)勢(shì)[31]。飼糧芽孢桿菌組的墊料細(xì)菌總數(shù)有上升趨勢(shì)，大腸桿菌有減少趨勢(shì)，究其原因可能是隨著墊料發(fā)酵，所形成的有益微生物種群能有效抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)。飼糧抗生素組的放線(xiàn)菌、金黃色葡萄球菌分布數(shù)量顯著低于對(duì)照組，細(xì)菌總數(shù)、大腸桿菌、芽孢桿菌有下降趨勢(shì)，表明飼糧抗生素對(duì)墊料益生菌有不利影響，但其在一定程度上能有效減少大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等病原菌的數(shù)量。

在養(yǎng)殖過(guò)程中，發(fā)酵床墊料微生物區(qū)系及多樣性呈動(dòng)態(tài)變化。仔豬保育期各年限、各厚度和各層次的墊料細(xì)菌DGGE圖譜中條帶豐富度明顯高于育成期墊料，而隨著使用年限增加，豬生物發(fā)酵床墊料中的微生物群落的多樣性有降低的趨勢(shì)[32]。本試驗(yàn)在仔豬飼糧中添加芽孢桿菌、抗生素，墊料細(xì)菌DGGE的多樣性指數(shù)（H）、均勻度（E）均無(wú)顯著差異，究其原因可能是與保育期豬糞尿數(shù)量有關(guān)。隨著豬育肥期糞便量的增加，墊料細(xì)菌多樣性是否受飼糧影響，還需進(jìn)一步研究。

4 小結(jié)

（1）在發(fā)酵床飼養(yǎng)條件下，飼用芽孢桿菌顯著增加墊料中芽孢桿菌分布數(shù)量，提高墊料中墊料蛋白酶活，一定程度上提高糞便原位降解效率。

（2）飼糧抗生素一定程度上減少了墊料益生菌，但能有效減少墊料病原菌。

（3）在仔豬飼糧中添加芽孢桿菌、抗生素，墊料細(xì)菌DGGE的多樣性指數(shù)、均勻度均無(wú)顯著差異。

[1]何 鑫,任正平,陸冬梅,等.抗生素對(duì)蘇淮豬發(fā)酵床養(yǎng)殖環(huán)境的影響[J].家畜生態(tài)學(xué)報(bào),2009,30（4）：44-47.HE Xin,REN Zheng-ping,LU Dong-mei,et al.Effect of antibiotics on production environment of Suhuai pigs based on ferment bed culture system[J].Journal of Domestic Animal Ecology,2009,30（4）：44-47.

[2]徐慶賢,官雪芳,林碧芬,等.幾株豬糞堆肥發(fā)酵菌對(duì)堆肥發(fā)酵的促進(jìn)作用[J].生態(tài)與農(nóng)村環(huán)境學(xué)報(bào),2013,29（2）：253-259.XU Qing-xian,GUAN Xue-fang,LIN Bi-fen,et al.Effects of strains of Zymogen on composting of pig manure[J].Journal of Ecology and Rural Environment,2013,29（2）：253-259.

[3]李卓佳,林 亮,楊鶯鶯,等.芽孢桿菌制劑對(duì)蝦池環(huán)境微生物群落的影響[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2007,26（3）：1183-1189.LI Zhuo-jia,LIN Liang,YANG Ying-ying,et al.Influence of Bacillus on the microbial communities in shrimp ponds[J].Journal of Agro-Environment Science,2007,26（3）：1183-1189.

[4]齊 博,武書(shū)庚,王 晶,等.枯草芽孢桿菌對(duì)肉仔雞生長(zhǎng)性能、腸道形態(tài)和菌群數(shù)量的影響[J].動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào),2016,28（6）：1748-1756.QI Bo,WU Shu-geng,WANG Jing,et al.Effects of Bacillus subtilis on growth performance,intestinal morphology and bacterial enumeration of broilers[J].Chinese Journal of Animal Nutrition,2016,28（6）：1748-1756.

[5]蔣佳璇,王淑京,任志鴻,等.豬源益生芽孢桿菌的分離鑒定與生物學(xué)特性分析[J].動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào),2016,28（11）：3542-3548.JIANG Jia-xuan,WANG Shu-jing,REN Zhi-hong,et al.Isolation,identification and biologic characterization of Bacillus spp from swine[J].Chinese Journal of Animal Nutrition,2016,28（11）：3542-3548.

[6]劉 波,鄭雪芳,朱昌雄,等.脂肪酸生物標(biāo)記法研究零排放豬舍基質(zhì)墊層微生物群落多樣性[J].生態(tài)學(xué)報(bào),2008,28（11）：5488-8497.LIU Bo,ZHENG Xue-fang,ZHU Chang-xiong,et al.The diversity of PLFAs biomarkers for the microbial community in the stroma cushion of non-pollution pigsty[J].Acta Ecologica Sinica,2008,28（11）：5488-8497.

[7]畢泗偉,吳祖芳,虞耀土.16S rDNA基因文庫(kù)技術(shù)分析發(fā)酵床細(xì)菌群落的多樣性[J].寧波大學(xué)學(xué)報(bào),2013,26（1）：18-22.BI Si-wei,WU Zu-fang,YU Yao-tu,et al.The bacteria diversity of fermentation bed in pig-farming by 16S rDNA gene clone library analysis[J].Journal of Ningbo University,2013,26（1）：18-22.

[8]宦海琳,閆俊書(shū),周維仁,等.不同墊料組成對(duì)豬用發(fā)酵床細(xì)菌群落的影響[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2014,33（9）：1843-1848.HUAN Hai-lin,YAN Jun-shu,ZHOU Wei-ren,et al.Effects of different bedding litters on bacterial community in pig biobed[J].Journal of Agro-Environment Science,2014,33（9）：1843-1848.

[9]周學(xué)利,吳銳銳,李小金,等.發(fā)酵床養(yǎng)豬模式中豬腸道與墊料間的菌群相關(guān)性分析[J].家畜生態(tài)學(xué)報(bào),2014,35（2）：70-75.ZHOU Xue-li,WU Rui-rui,LI Xiao-jin,et al.Correlation analysis of bacteria from pig intestine and padding in the breeding pattern of fermentation bed[J].Journal of Domestic Animal Ecology,2014,35（2）：70-75.

[10]張新熊,彭 鋒,毛光平,等.飼用芽孢桿菌研究與應(yīng)用進(jìn)展[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào),2013,19（5）：891-897.ZHANG Xin-xiong,PENG Feng,MAO Guang-ping,et al.Advance in research and application of Bacillus probiotis[J].Chin J Appl Environ Biol,2013,19（5）;891-897.

[11]張 霞,楊 杰,李 健,等.豬發(fā)酵床不同原料墊料重金屬元素累積特性研究[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2013,32（1）：166-171.ZHANG Xia,YANG Jie,LI Jian,et al.Accumulated characteristics of heavy metals in different pig bio-bed materials[J].Journal of Agro-Environment Science,2013,32（1）：166-171.

[12]關(guān)松蔭.土壤酶及其研究方法[M].北京：農(nóng)業(yè)出版社,1980.GUAN Song-yin.Soil enzyme and its research method[M].Beijing：A-gricultural Press,1980.

[13]Veneklaas E J,Stevens J,Cawthray G R,et al.Chickpea and white lupin rhizosphere carboxylates vary with soil properties and enhance phosphorus uptake[J].Plant and Soil,2003,248：187-197.

[14]劉紹雄,王明月,王 娟,等.基于PCR-DGGE技術(shù)的劍湖濕地湖濱帶土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性分析[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2013,32（7）：1405-1412.LIU Shao-xiong,WANG Ming-yue,WANG Juan,et al.Analyzing soil microbial community structure diversity from Jianhu wetland lakeside zone using PCR-DGGE technique[J].Journal of Agro-Environment Science,2013,32（7）：1405-1412.

[15]趙云麗,李 剛,修偉明,等.非抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因棉花對(duì)土壤細(xì)菌群落多樣性的影響[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2015,34（4）：716-721.ZHAO Yun-li,LI Gang,XIU Wei-ming,et al.Effects of insect non-resistant transgenic cottons on bacterial community diversity in soil[J].Journal of Agro-Environment Science,2015,34（4）：716-721.

[16]Tiquia S M.Evolution of extracellular enzyme activities during manure composting[J].Journal of Applied Microbiology,2002,92：764-775.

[17]孫 彥.發(fā)酵床養(yǎng)鴨對(duì)墊料衛(wèi)生狀況及肉鴨腸道微生物多樣性的影響[D].雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué),2014.SUN Yan.The effects of number and diversity of intestinal flora in ducks and the hygiene of the padding by breeding duck on the fermentation bed[D].Ya′an：Sichuan Agricultural Uniersity,2014.

[18]張慶寧,胡 明,朱榮生,等.生態(tài)養(yǎng)豬模式中發(fā)酵床優(yōu)勢(shì)菌群的微生物學(xué)性質(zhì)及其應(yīng)用研究[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué),2009（4）：99-105.ZHANG Qing-ning,HU Ming,ZHU Rong-sheng,et al.Microbial properties and application of superior bacteria in deep-litter ecosystem for piggery[J].Shandong Agriculture Science,2009（4）：99-105.

[19]尹紅梅,賀月林,張德元,等.發(fā)酵床微生物接種試驗(yàn)研究[J].家畜生態(tài)學(xué)報(bào),2010,31（6）：49-54.YIN Hong-mei,HE Yue-lin,ZHANG De-yuan,et al.Study on inoculation of biology bed with microbes[J].Journal of Domestic Animal Ecology,2010,31（6）：49-54.

[20]Smith K A,Mctaggart I P,Taurata H.Emission of NO2and NO associated with nitrogen fertilization in intensive agriculture and the potential for mitigation[J].Soil Use Management,1997,13：296-304.

[21]王 芳,張玉龍,肖質(zhì)秋,等.滲灌不同灌水控制上下限組合對(duì)保護(hù)地土壤脲酶活性的影響[J].土壤通報(bào),2012,42（6）：1393-1398.WANG Fang,ZHANG Yu-long,XIAO Zhi-qiu,et al.Effects of different combinations of upper and lower limits of subsurface irrigation on urease activity in protected field[J].Chinese Journal of Soil Science,2012,42（6）：1393-1398.

[22]焦洪超,欒炳志,宋志剛,等.發(fā)酵床養(yǎng)豬墊料基礎(chǔ)參數(shù)變化規(guī)律研究[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào),2013,33（10）：1610-1615.JIAO Hong-chao,LUAN Bing-zhi,SONG Zhi-gang,et al.Study on the basic parameters of litters in fermenting bed system of pig production[J].Chinese Journal of Veterinary Science,2013,33（10）：1610-1615.

[23]朱 玉.用于發(fā)酵床養(yǎng)殖的細(xì)菌分離鑒定及應(yīng)用效果研究[D].雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué),2011.ZHU Yu.Isolation and identification of bacterial strains and their application in deep litter system[D].Ya′an：Sichuan Agricultural University,2011.

[24]李慶康,吳 雷,劉海琴,等.我國(guó)集約化畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)糞便處理利用現(xiàn)狀及展望[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境保護(hù),2000,19（4）：251-254.LI Qing-kang,WU Lei,LIU Hai-qin,et al.Status and prospect of treatment and utilization of manure on intensive livestock and poultry farms[J].Agro-environmental Protection,2000,19（4）：251-254.

[25]朱紅,常志州,王世梅,等.基于畜禽廢棄物管理的發(fā)酵床技術(shù)研究：發(fā)酵床剖面特征研究[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2007,26（2）：754-758.ZHU Hong,CHANG Zhi-zhou,WANG Shi-mei,et al.Deep litter system for management of livestock profile characteristics of litter in deep-litter system[J].Journal of Agro-Environment Science,2007,26（2）：754-758.

[26]劉 波,李兆龍,唐建陽(yáng),等.微生物發(fā)酵床大欄養(yǎng)殖豬群管理的研究[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2014,29（11）：1051-1057.LIU Bo,LI Zhao-long,TANG Jian-yang,et al.Breeding management for large population of pigs in large scale piggery of microbial fermentation bed[J].Fujian Journal of Agricultural Sciences,2014,29（11）：1051-1057.

[27]鄭雪芳,劉 波,朱育菁,等.養(yǎng)豬發(fā)酵床墊料微生物及其豬細(xì)菌性病原群落動(dòng)態(tài)的研究[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2016,33：425-432.ZHENG Xue-fang,LIU Bo,ZHU Yu-jing,et al.Community dynamic of bacteria,fungi,actinomycetes and pig bacterial pathogens in the stroma cushion of pig-on-litter system[J].Journal of Agro-Environment Science,2016,33：425-432.

[28]趙國(guó)華,方雅恒,陳 貴.生物發(fā)酵床養(yǎng)豬墊料中營(yíng)養(yǎng)成分和微生物群落研究[J].安微農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,43（8）：98-99.ZHAO Guo-hua,FANG Ya-heng,CHEN Gui.Study on the nutritional components and microbial community in beddings of pig raising by bio-fermentation bed[J].Journal of Anhui Agricultural Sciences,2015,43（8）：98-99.

[29]張學(xué)峰,周賢文,陳 群,等.不同深度墊料對(duì)養(yǎng)豬土著微生物發(fā)酵床穩(wěn)定期微生物菌群的影響[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào),2013,33（9）：1458-1462.ZHANG Xue-feng,ZHOU Xian-wen,CHEN Qun,et al.The influence of padding of different depth in native microorganism fermintation bed of pigs on microbial flora during steady period.[J].Chinese Journal of Veterinary Science,2013,33（9）：1458-1462.

[30]徐小明,白建勇,宦海琳,等.地衣芽孢桿菌對(duì)發(fā)酵床飼養(yǎng)仔豬生長(zhǎng)性能、消化酶及腸道主要菌群數(shù)量的影響[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī),2015,42（4）：923-928.XU Xiao-ming,BAI Jian-yong,HUAN Hai-lin,et al.Effect of Bacillus licheniformis on growth performance,digestive enzymes and the number of intestinal main microbial flora in piglets raised in fermentation bed[J].China Animal Husbandary Veterinary Medicine,2015,42（4）：923-928.

[31]Yi J,Wu H Y,Wu J,et al.Molecular phylogenetic diversity of Bacillus community and its temporal spatial distribution during the swine manure of composting[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2012,93（1）：411-421.

[32]王 迪.豬用生物發(fā)酵床墊料中微生物群落多樣性變化及芽孢桿菌分離與鑒定[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2012.WANG Di.The Change of microbial community diversity in deep-litter system and the isolation and identification of Bacillus[D].Wuhan：Huazhong Agricultural University,2012.

Effects of diet with Bacillus licheniformis on physicochemical properties and microbial community in litters of piglet biobed

HUAN Hai-lin,BAI Jian-yong,YAN Jun-shu,ZHOU Wei-ren,XU Xiao-ming,GU Hong-ru*
（The Institute of Animal Science,Jiangsu Academy of Agricultural Sciences,Nanjing 210014,China）

To investigate the effects of Bacillus licheniformis on the physicochemical properties and microbial community in litters of piglet biobed,weaned piglets were fed in three groups.The first group was fed a basal diet plus B.licheniformis（probiotics treatment,PBT）,the second group was fed a basal diet plus bacitracin zinc and sulfate prime enemy（antibiotic treatment,ABT）,and the last group was fed a basal diet only（control treatment,CT）.The results showed that the activity of proteinase in PBT was significantly improved（p＜0.05）,while no significant difference in urease activity or ammonium concentration was observed among the three treatments（P＞0.05）.On day 15,the total number of cells of Actinomyces in ABT was significantly increased（p＜0.05）.On day 35,the number of Bacillus in PBT was significantly increased（p＜0.05）.On day 49,the number of Bacillus in PBT was significantly higher than that in ABT（p＜0.05），and the number of Staphylococci in ABT was significantly lower than that in CT（p＜0.05）.The numbers of Escherichia coli in ABT and PBT were lower than that in CT.The total numbers of bacterial and Bacillus in PBT were lower than that in CT,although these differences were not significant（P＞0.05）.The results indicated that dietary antibiotics might inhibit the growth of pathogenic microorganisms,while the probiotic bacteria population might also be affected.No significant difference（P＞0.05）was observed in the DGGE Shannon-Wiener index or the evenness between the three treatments.In general,the addition of B.licheniformis significantly increased the population of Bacillus.The protease activity in the litters of piglet biobed and the degradation efficiency of the manure were improved,while no significant change was observed in the bacterial community diversity.

Bacillus licheniformis;biobed litters;physicochemical properties;microbial community

X172

A

1672-2043（2017）10-2114-07

10.11654/jaes.2017-0490

宦海琳，白建勇，閆俊書(shū)，等.日糧添加地衣芽孢桿菌對(duì)仔豬發(fā)酵床墊料理化性質(zhì)及微生物群落的影響[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2017,36（10）：2114-2120.

HUAN Hai-lin,BAI Jian-yong,YAN Jun-shu,et al.Effects of diet with Bacillus licheniformis on physicochemical properties and microbial community in litters of piglet biobed[J].Journal of Agro-Environment Science,2017,36（10）：2114-2120.

2017-04-05 錄用日期：2017-06-01

宦海琳（1981—），女，江蘇揚(yáng)州人，碩士，副研究員，研究方向?yàn)樾竽廖⑸飳W(xué)。E-mail：huanhl@126.com

*通信作者：顧洪如 E-mail：guhongru@163.com

江蘇省農(nóng)業(yè)自主創(chuàng)新資金項(xiàng)目[CX13（5040）]；江蘇省農(nóng)業(yè)三新工程項(xiàng)目（SXGC[2016]331）

Project supported：Jiangsu Agriculture Science and Technology Innovation Fund[CX（13）5040]；Jiangsu agriculture Province New Project Fund（SXGC[2016]331）