郭 盼 ，呂久安 ，張克軍 ，張 凱 ，彭效明 ，晁建平

（1．北京石油化工學(xué)院，北京 102600； 2．北京紅惠新醫(yī)藥科技有限公司，北京 102600）

高效液相色譜法測定替格瑞洛含量

郭 盼1，呂久安2，張克軍2，張 凱1，彭效明1，晁建平1

（1．北京石油化工學(xué)院，北京 102600； 2．北京紅惠新醫(yī)藥科技有限公司，北京 102600）

目的建立測定替格瑞洛含量的高效液相色譜法。方法色譜柱為Agilent ZORBAX SB－C18柱(250mm×4．6mm，5 m)，以乙腈－水（50∶50）為流動相，檢測波長為254 nm，柱溫為35℃，流速為1．0m L／min。結(jié)果主峰與前后雜質(zhì)峰分離度為2．95和5．29；進(jìn)樣精密度的 RSD為0．07%；當(dāng)色譜條件有微小變化時，主峰與前后雜質(zhì)峰分離度大于1．5；質(zhì)量濃度線性范圍為0．03005～0．45075 g／L，線性回歸方程為 Y＝17202X－29．492，R2＝0．9989；重復(fù)性試驗的 RSD為 0．10%；中間精密度試驗的 RSD為 0．21%；回收率范圍為98．32% ～100．86%，RSD＝0．95%。結(jié)論該測定方法操作簡單，準(zhǔn)確性、重復(fù)性好，可用于控制替格瑞洛原料藥的含量。

高效液相色譜法；替格瑞洛；原料藥；含量測定

急性冠脈綜合征（acute coronary syndrome，ACS）是由于粥樣硬化的冠狀動脈內(nèi)斑塊破裂引發(fā)血栓形成的臨床綜合征，近年來已成為我國主要的致死疾病之一[1]。其治療刻不容緩，其中抗血小板治療尤為重要[2]。替格瑞洛是阿斯利康公司推出的首個環(huán)戊基三唑嘧啶類藥物，為口服可逆性P2Y12受體拮抗藥，可阻斷二磷酸腺苷（ADP）引導(dǎo)的血小板聚集[3－4]。與噻吩并吡啶類藥物（如氯吡格雷）在血小板的生命周期中與P2Y12的不可逆結(jié)合不同，替格瑞洛與受體結(jié)合可逆，表現(xiàn)為起效和抗血小板聚集作用消失的迅速性[5]。動物實驗顯示，與噻吩并吡啶類藥物不同，替格瑞洛抗血栓形成的作用與引發(fā)出血的作用是分離的；它無需代謝活化即可迅速吸收，顯示強(qiáng)而持久的抗血小板聚集作用，同時維持劑量服藥間隔也長于氯吡格雷。停藥后，抗血小板凝聚作用隨血藥濃度降低而快速下降。此外，由于替格瑞洛是選擇性P2Y12受體抑制劑，可拮抗ADP－介導(dǎo)血小板的活化和聚集，從而可預(yù)防血栓[6]。替格瑞洛主要由CYP3A4代謝成為主要活性產(chǎn)物AR－C124910 XX，其活性代謝產(chǎn)物是弱的P－糖蛋白底物和抑制劑?；钚源x產(chǎn)物的全身暴露量為替格瑞洛的30% ～40%[7]。替格瑞洛主要通過肝臟代謝，給予放射標(biāo)記的替格瑞洛，尿中替格瑞洛及其代謝產(chǎn)物均低于1%；替格瑞洛及其代謝產(chǎn)物主要的排泄途徑可能是膽汁排泌兩者的半衰期分別為7 h和9 h[8]。年齡、性別、種族及腎功受損、輕度肝損害對藥動學(xué)參數(shù)的影響不大[9]。

上市銷售的替格瑞洛（Ticagrelor，又名替卡格雷）的商品名稱是倍林達(dá)（替格瑞洛片），英文商品名稱是BRILINTA（Ticagrelor Tablet），化學(xué)名稱是（1S，2S，3R，5S）－3－（7－（（1R，2S）－2－（3，4－二氟苯基）環(huán)丙氨基）－5－丙硫基－3H－[1，2，3]三唑[4，5－d]嘧啶－3－基）－5－（2－羥乙氧基）環(huán)戊烷－1，2－二醇[10]。為研究原料藥替格瑞洛的含量測定方法，本研究中曾嘗試使用滴定法[11－12]對替格瑞洛進(jìn)行含量測定，未發(fā)現(xiàn)明顯的滴定終點。后又嘗試使用紫外分光光度法[13]測定含量，但準(zhǔn)確率較低。最后選用高效液相色譜（HPLC）法測定其含量。目前，已有一些廠家在進(jìn)行該藥的仿制研發(fā)工作，但該藥的質(zhì)量控制研究報道還很少，在目前藥物研發(fā)領(lǐng)域?qū)λ幬镆恢滦栽u價日益要求嚴(yán)格和迫切的今天，本研究旨在為替格瑞洛原料藥的開發(fā)提供幫助。

1 儀器與試藥

1．1 儀器

1200型高效液相色譜儀（美國Agilent公司），TB－215D型十萬分之一電子分析天平（美國Denver公司）。

1．2 試藥

乙腈（Honeywell，色譜純），水（屈臣氏，蒸餾水），其他試劑均為分析純。相關(guān)試藥均由北京紅惠新醫(yī)藥科技有限公司提供，詳見圖1和表1。

圖1 各類替格瑞洛結(jié)構(gòu)圖

表1 替格瑞洛方法驗證相關(guān)樣品及來源

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB－C18柱（250 mm×4．6mm，5 μm）；檢測波長：254 nm；柱溫：35℃；流動相：乙腈－水（50 ∶50）；流速：1．0 m L ／min；進(jìn)樣量：10 μL；稀釋劑：50%乙腈；洗脫模式：等度洗脫[14]。

2．2 溶液制備

專屬性溶液：取替格瑞洛雜質(zhì)A和雜質(zhì)B約1mg，另稱取替格瑞洛樣品30mg，精密稱定，置100m L容量瓶中，加50%乙腈稀釋至刻度，搖勻，即得。

對照品溶液：稱取替格瑞洛工作對照品30 mg，精密稱定，置100mL容量瓶中，加50%乙腈稀釋至刻度，搖勻，即得。

樣品溶液：稱取替格瑞洛樣品30mg，精密稱定，置100m L容量瓶中，加50%乙腈稀釋至刻度，搖勻，即得。

空白溶液：水－乙腈 ＝1∶1（V／V）。

2．3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗：替格瑞洛雜質(zhì)A和雜質(zhì)B為替格瑞洛中與主峰分離度最小的雜質(zhì)，屬于液相較難區(qū)分的雜質(zhì)。本方法的目的是通過優(yōu)化方法使主峰與雜質(zhì)A和雜質(zhì)B達(dá)到理想的分離效果[3]。為此，取專屬性溶液進(jìn)樣，通過改變色譜條件試驗，使替格瑞洛雜質(zhì)A、替格瑞洛雜質(zhì)B與替格瑞洛達(dá)到基線分離（圖2）。替格瑞洛樣品方法的研究及驗證參照《中國藥典》規(guī)定的既定流程進(jìn)行[15]。

進(jìn)樣精密度考察：取對照品溶液，按擬訂色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5針，記錄主峰峰面積。結(jié)果5次測定的峰面積分別為 5104．90，5107．61，5114．43， 5106．55，5109．60，平均 5108．62，RSD 為 0．07% ，小于 2．00%，表明儀器精密度良好。

專屬性考察：取專屬性溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣。結(jié)果主峰與雜質(zhì) A和雜質(zhì) B分離度分別為2．95和5．29，表明方法專屬性良好。

耐用性考察：微調(diào)流速、柱溫、流動相配比及更換色譜柱的色譜條件，考察色譜條件改變對分離度的影響。當(dāng)色譜條件有微小變化時，主峰與前后雜質(zhì)峰分離度大于1．5，均符合系統(tǒng)適用性要求，耐用性良好（表2）。

線性關(guān)系考察：稱取樣品30．05mg，精密稱定，置50mL容量瓶中，加50%乙腈稀釋至刻度，搖勻即得樣品溶液。精密量取對照品貯備液 0．5，1．5，2．5，5．0，7．5 mL，分別置10mL容量瓶中，加50%乙腈稀釋至刻度，搖勻，即得1－5號線性溶液。精密量取各質(zhì)量濃度線性溶液10μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，測定峰面積，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 Y＝17202X－29．492，R2＝0．9989（n＝5）。結(jié)果表明，替格瑞洛質(zhì)量濃度在 0．03005～0．45075 g／L范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

圖2 系統(tǒng)適用性試驗高效液相色譜圖

表2 耐用性試驗結(jié)果

檢測限與定量限確定：取1號線性溶液，經(jīng)逐級稀釋，配制成系列質(zhì)量濃度的溶液，精密量取10μL分別進(jìn)樣，當(dāng)峰高（S）約為基線噪音（N）的3倍時的進(jìn)樣量定為檢測限，S／N≈10時的進(jìn)樣量定為定量限，結(jié)果分別 0．3005 ng 和 1．2000 ng。

重復(fù)性試驗：取替格瑞洛樣品6份，按樣品測定方法操作，計算含量。結(jié)果相對百分含量均值為98．78%，RSD為0．10%(n＝6)，小于5%，表明方法重復(fù)性良好。

中間精密度試驗：換另一操作人員，取替格瑞洛樣品6份，按樣品測定方法操作，計算含量。結(jié)果相對百分含量均值為 98．72% ， RSD 為 0．21%(n＝6)，小于5%，表明方法中間精密度良好。

回收率試驗：稱取替格瑞洛樣品60．32mg，精密稱定，置20m L容量瓶中，加50%乙腈稀釋至刻度，搖勻，即得供試品貯備液。稱取替格瑞洛對照品60．22mg，精密稱定，置20m L容量瓶中，加50%乙腈稀釋至刻度，搖勻，即得對照品貯備液。精密量取供試品貯備液1m L，置20 m L容量瓶中，加50%乙腈稀釋至刻度，搖勻，平行配置3組，作為50%點的溶液。精密量取供試品貯備液3份，各 1 mL，分別置 3個 20 m L容量瓶中，向3個容量瓶中精密移取3份各0．6 mL對照品貯備液，加50%乙腈稀釋至刻度，搖勻，作為80%點的溶液。分別精密量取供試品貯備液3份各1m L，對照品貯備液3份各1m L，分別置3組20mL容量瓶中，加50%乙腈稀釋至刻度，搖勻，即為100%點的溶液。分別精密量取供試品貯備液3份各1mL，分別置3組20mL容量瓶中，分別再向3組容量瓶中精密移取3份各1．4m L對照品貯備液，加50%乙腈稀釋至刻度，搖勻，作為120%點的溶液。精密量取對照品貯備液2．0m L各2份，分別置2組20mL容量瓶中，加50%乙腈稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液?；厥章试囼灲Y(jié)果見表3?；厥章史秶?8．32% ～100．86% 之 間 的 RSD ＝0．95% ， 98% ～102%[15]之間的 RSD≤2．0%，表明準(zhǔn)確度良好。

表3 回收率驗證結(jié)果表

3 討論

替格瑞洛作為首個可逆性P2Y12受體抑制劑，有更快、更強(qiáng)和更穩(wěn)定的血小板抑制作用，并能有效降低ACS患者的死亡率。抑制作用可逆是其最大特點，決定了替格瑞洛具有良好的市場前景。但關(guān)于其原料藥的含量檢測方法，目前文獻(xiàn)報道較少。為滿足產(chǎn)品上市，對含量的測定方法進(jìn)行研究。本研究中選擇了替格瑞洛常含的雜質(zhì)A和雜質(zhì)B作為研究對象，考慮到兩種雜質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)和替格瑞洛的相似度非常高（參見表1中雜質(zhì)A、雜質(zhì)B和替格瑞洛的化學(xué)結(jié)構(gòu)式），理化性質(zhì)很相似，在分析方法學(xué)開發(fā)中，常難以有效分離，是含量方法學(xué)研究中的主要難點。故本研究中以分離的雜質(zhì)A和雜質(zhì)B作為主要雜質(zhì)研究對象，探索它們與替格瑞洛的分離。

本研究中嘗試了不同的流動相體系，最終選擇乙腈與水的體系。經(jīng)乙腈與水不同比例的等度洗脫以及梯度洗脫方式試驗，結(jié)果乙腈起始比例低于30%時，基線波動均較大，影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性；比例高于30%，梯度緩和，可達(dá)到理想的分離效果，但主峰保留時間較長；用等度洗脫且乙腈與水的比例為50∶50時，既可滿足分離效果達(dá)到要求，同時檢測時間最短，操作也較為簡單。經(jīng)過方法驗證，結(jié)果顯示，進(jìn)樣精密度、專屬性滿足要求，在改變流速和流動相比例后耐用性也符合要求，特別是在更換目前常用的不同品牌的色譜柱后，耐用性也符合要求，證明方法通用性好，對色譜柱的依賴性小；重復(fù)性、中間精密度、回收率均符合要求。綜上所述，本方法可以用于替格瑞洛原料藥的含量測定，進(jìn)而對該產(chǎn)品的質(zhì)量進(jìn)行控制。

研究所建立的方法的優(yōu)勢在于，保證替格瑞洛含量能準(zhǔn)確測定的同時兼顧經(jīng)濟(jì)性與時效性，對色譜柱的要求不高，能用多種品牌的色譜柱檢測，均可達(dá)到檢測目的。另外，該方法檢測時間短，在提高檢測效率的同時減少了色譜溶劑的使用量，節(jié)約了試驗藥品的成本。

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Content Determination of Ticagrelor by HPLC

Guo Pan1， Lü Jiuan2， Zhang Kejun2， Zhang Kai1， Peng Xiaoming1， Chao Jianping1
（1．Beijing Institute of Petrochemical Technology， Beijing， China 102600； 2．Beijing Honghui Meditech Co．， Ltd．， Beijing， China 102600）

Objective To establish an HPLC method for content determination of Ticagrelor．Methods The Agilent ZORBAX SB－C18column（250 mm ×46 mm，5 μm） was adopted，the mobile phase was acetonitrile－water （50 ∶50），the detection wavelength was 254 nm，the column temperature was 35 ℃ ，and the flow rate was 1．0 mL ／min．Results The resolutions between the main peak and the front and back impurity peaks were 2．95 and 5．29，the RSD of sample precision was 0．07% ．When the chromatographic conditions change slightly，the resolutions between the main peak and the front and back impurity peaks were more than 1．5．The linear range of mass concentration was 0．03005－0．45075 g／L，and the linear regression equation was Y＝17202 X－29．492，R2＝ 0．9989．The RSD of the repeatability test was 0．10% ，and the RSD of the intermediate precision test was 0．21% ，the recovery rate was in the range of 98．32%－100．86% ， RSD ＝0．95%．Conclusion The method is simple，accurate and reproducible，which can be used to control the content of the active pharmaceutical ingredient（API） of Ticagrelor．

HPLC；ticagrelor；active pharmaceutical ingredient；content determination

R917；R973＋．2

A

1006－4931(2017)24－0019－04

10．3969 ／j．issn．1006－4931．2017．24．006

國家青年科學(xué)基金資助項目[21406015]。

郭盼（1992－），女，大學(xué)本科，主要從事藥物分析工作，（電子信箱）guopan＠ bipt．edu．cn。

晁建平（1963－），男，副教授，研究方向為藥物合成與質(zhì)量，（電子信箱）chaojp＠ bipt．edu．cn。

2017－04－10；

2017－09－03)