兩株珍珠龍躉病原性哈維弧菌(Vibrio harveyi)的分離與鑒定

蔣魁, 徐力文, 蘇友祿, 馬紅玲, 劉廣鋒, 郭志勛, 高芳, 馮娟

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兩株珍珠龍躉病原性哈維弧菌()的分離與鑒定

蔣魁, 徐力文, 蘇友祿, 馬紅玲, 劉廣鋒, 郭志勛, 高芳, 馮娟*

中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所, 農(nóng)業(yè)部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室, 廣東 廣州 510300

自海南陵水和廣東深圳養(yǎng)殖場患病珍珠龍躉(pearl gentian)分離到2株優(yōu)勢菌(X12XC30和X13SZ03), 經(jīng)回歸感染實驗證實2株菌是珍珠龍躉的病原菌, 對珍珠龍躉的半致死濃度(LD50)分別是6.58×106CFU·g-1和9.83×105CFU·g-1。對菌株進行形態(tài)、顏色和生長條件等常規(guī)生理生化實驗, 并進行,和等管家基因的序列分析綜合鑒定。結(jié)果顯示: 2株病原菌均為短桿狀革蘭氏陰性菌, TCBS生長為黃色, 對O/129(150 ug·片-1)敏感, 生理生化指標與哈維弧菌標準株一致;和序列在Genbank上檢索與哈維弧菌的同源性最高, 根據(jù)管家基因的序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹, 自然地與哈維弧菌分支聚類為一支, 確定這2株菌均為哈維弧菌。藥敏實驗發(fā)現(xiàn)2株哈維弧菌均耐呋喃唑酮, 而對諾氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星和氯霉素等藥物敏感。哈維弧菌具有較高的致死率, 在珍珠龍躉養(yǎng)殖業(yè)中存在潛在的威脅。

哈維弧菌; 珍珠龍躉; 鑒定

1 前言

海水養(yǎng)殖業(yè)中, 細菌病是影響廣泛的重要因素[1], 哈維弧菌()作為海水養(yǎng)殖業(yè)重要的致病菌[2–3], 可感染多種魚、蝦、蟹等并造成大量的死亡[4–7], 例如, 哈維弧菌感染牙鲆()[8–9]、斑節(jié)對蝦()[10–11]、凡納濱對蝦()[12]、尖吻鱸()[13]、刺尾魚()[14]和紅鰭東方鲀()[15]等水產(chǎn)養(yǎng)殖動物, 并導致其死亡的主要原因, 給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴重的經(jīng)濟損失。病原性哈維弧菌分布的養(yǎng)殖海域, 當細菌數(shù)量達到一個閾值, 則會觸發(fā)群體感應效應, 產(chǎn)生毒性變異, 對海洋生物造成細菌性侵染毒害, 擾亂海域生態(tài)環(huán)境。

珍珠龍躉(pearl gentian), 又稱珍珠斑或龍虎斑, 是由鞍帶石斑魚(♂)和棕點石斑魚(♀)雜交培育的新種。珍珠龍躉結(jié)合了棕點石斑魚抗病力強和鞍帶石斑魚生長快的優(yōu)點, 顯現(xiàn)出明顯的雜種優(yōu)勢[16]。2013年全中國石斑魚產(chǎn)量約為18.44萬噸, 其中廣東、福建、海南養(yǎng)殖量就高達8.24萬噸, 近兩年在天津、青島等地也都實現(xiàn)了珍珠龍躉的大規(guī)模養(yǎng)殖。目前, 珍珠龍躉的研究主要是育種和養(yǎng)殖技術(shù)[17–18], 隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大, 養(yǎng)殖過程中疾病的問題逐漸凸現(xiàn), 大量的魚在養(yǎng)殖過程中染病死亡[19–20], 但關(guān)于珍珠龍躉細菌性疾病的相關(guān)報道很少。

2012年9月中下旬, 海南陵水縣新村灣周邊池塘養(yǎng)殖的珍珠龍躉, 魚體出現(xiàn)爛身, 死亡, 體長15—17 cm, 體重125—140 g, 鹽度32—34 PPT, 水溫29—32 ℃, 每天死亡率0.5%—1.0%, 分離病原菌X12XC30。2013年10月上中旬, 廣東深圳大鵬某水泥池養(yǎng)殖的珍珠龍躉, 體長13—15 cm, 體重90—120 g, 鹽度28—30, 水溫27—29 ℃,每天死亡率0.6%—1.4%, 分離病原菌X13SZ03。患病魚表現(xiàn)的主要癥狀相似: 體側(cè)脫鱗, 尾柄潰瘍, 以口腔上下顎潰瘍明顯, 部分魚眼膜發(fā)白, 鰓輕度貧血狀, 部分魚有少量瓣體蟲寄生。腎臟腫大軟化, 脾臟腫大, 肝臟邊緣有壞死狀淺色斑塊, 胃和腸道無食物, 積有少量淺色膿液狀物。從肝、腎和腦分離到優(yōu)勢菌落。

本研究分離來自不同地區(qū)珍珠龍躉的疑似病原菌X12XC30和X13SZ03, 并從兩株菌的形態(tài)、生理生化特征、生物學分類以及致病性進行研究, 以期為防治珍珠龍躉養(yǎng)殖中弧菌病的爆發(fā)提供生物學科學依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 病原菌的分離

本實驗室于2012年和2013年分別在海南陵水與廣東深圳養(yǎng)殖場的患病珍珠龍躉分離的2株病原菌(表1)。

2.2 回歸感染實驗

自海南三亞一養(yǎng)殖場購得珍珠龍躉幼魚, 體長(10±0.5) cm, 體重(11.8±1) g, 在5 m3的水泥池中暫養(yǎng)一周。每株菌設5個實驗組和1個對照組, 每組3個平行, 每個平行10尾魚, 分別飼養(yǎng)于1 m3的水泥池中。將待檢菌株接種于2216E斜面培養(yǎng)12—16 h, 用無菌生理鹽水(0.9% NaCl)洗脫, 制成菌懸液, 10倍稀釋五個濃度梯度(菌懸液涂布法計數(shù)), 實驗組每尾魚腹腔注射0.2 ml菌懸液, 對照組注射等量生理鹽水。每天正常喂養(yǎng), 觀察記錄實驗魚的死亡情況, 直到實驗魚穩(wěn)定3天以上不出現(xiàn)死亡為止, 取實驗組瀕死魚肝臟、腎臟劃線分離細菌。

采用寇氏法計算LD50, 公式如下:

lg LD50=-(Σ-0.5)

式中:死亡率為100%組的對數(shù)劑量

對數(shù)組距

表1 菌株來源及編號

Tab.1 Sources of strains and serial number

Σ各組死亡率之和

2.3 菌株形態(tài)及生理生化特征分析

對菌株X12XC30和X13SZ03及感染后分離株進行革蘭氏染色, 用油鏡觀察細菌形態(tài)及染色情況。將純化后的菌株接種到2216E液體培養(yǎng)基培養(yǎng), 根據(jù)常規(guī)生理生化鑒定測定方法[21], 同時做API(32E)系統(tǒng)鑒定。

2.4 分子生物學鑒定

將兩株病原菌接種于營養(yǎng)肉湯中, 28 ℃過夜培養(yǎng)12—16 h。取2 mL菌懸液, 根據(jù)細菌基因組DNA提取試劑盒說明書方法提取DNA為PCR模板, 保存于–20 ℃?zhèn)溆?。選取1和三個管家基因進行PCR擴增。設計引物, 送上海生工合成(見表2)。2×Premix Taq購自Takara公司。DL 2000 Maker購自廣州東盛生物科技有限公司。

PCR擴增體系如下:

2×Premix Taq 25uL

Primer-F 2uL

Primer-R 2uL

DNA 2uL

ddH2O up to 50uL

PCR擴增條件: 95 ℃ 5 min; 95 ℃ 30 s, 50—60 ℃ 40 s, 72 ℃ 1 min, 35個循環(huán); 72 ℃ 10 min。

取5 uL PCR產(chǎn)物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳, 陽性產(chǎn)物送英濰捷基公司測序, 得到基因序列, 利用MEGA 6.0 軟件構(gòu)建NJ系統(tǒng)進化樹, 分析結(jié)果[22]。

2.5 菌株對藥物的敏感性實驗

據(jù)NCCL實驗操作標準, 采用紙片擴散K-B法檢測菌株X12XC30和X13SZ03對藥物的敏感性, 取100 μL菌懸液(濃度約為108CFU·mL-1)涂布于MHA培養(yǎng)基上, 10 min后貼藥敏紙片, 藥敏紙片為12種常見的抗生素(均于杭州天和微生物試劑有限公司購得): 頭孢克肟、慶大霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、氯霉素、復方新諾明、利福平、呋喃唑酮、阿莫西林、紅霉素和恩諾沙星。于28 ℃下培養(yǎng)24 h后, 觀察并測量抑菌圈直徑。根據(jù)抑菌圈直徑大小判斷菌株對藥物的敏感性[23–25]。

3 結(jié)果

3.1 菌株X12XC30和X13SZ03致病性

回歸感染顯示, X12XC30和X13SZ03對珍珠龍躉具有強致病性, 引起宿主死亡。其表現(xiàn)病征為腎臟腫大軟化, 脾臟腫大, 胃和腸道無食物, 肝門有出血等。根據(jù)實驗魚死亡結(jié)果, 計算得到LD50分別是6.58×106CFU·g-1和9.83×105CFU·g-1(見表3)。對感染后的珍珠龍躉魚肝臟、腎臟組織重分離細菌、純化, 菌株分別標記為X12XC30-1和X13SZ03-1。

3.2 生理生化檢測

經(jīng)生理生化以及染色鑒定, 革蘭氏染色為紅色, 呈短桿狀的陰性菌(圖1)。TCBS生長為黃色, 對O/129(150 ug·片-1)敏感; 在28 ℃和35 ℃均能生長, 需要NaCl; 利用葡萄糖, 對氧化酶與過氧化氫酶均呈陽性, 實驗菌株在利用甘露醇、肌醇及淀粉等項目中與哈維弧菌標準株有差異(見表4)。對照《伯杰氏細菌鑒定手冊》(第九版)[26], 參照有關(guān)文獻[27–28], 確定兩株病原菌歸屬于弧菌屬。

表2 引物信息

Tab.2 Information of the primers

表3 菌株X12XC30和X13SZ03對珍珠龍躉的回歸感染結(jié)果

Tab.3 Pathogenicity of Strains X12XC30 and X13SZ03 to pearl gentian

注: “C”為0.9%生理鹽水對照組。

圖1 X12XC30革蘭氏染色結(jié)果

3.3 分子生物學鑒定

分別將和串聯(lián)基因與弧菌屬參考菌株, 利用MEGA 6.0 軟件構(gòu)建NJ系統(tǒng)進化樹, 進行同源性分析(圖2, 3, 4, 5)。結(jié)果顯示兩株病原菌X12XC30和X13SZ03的基因與哈維弧菌自然聚類;和等管家基因均自然聚類于哈維弧菌分支, 結(jié)合形態(tài)學和生理生化鑒定結(jié)果, 可確定這兩株病原菌為哈維弧菌。

表4 菌株X12XC30和X13SZ03的主要生理生化指標檢測結(jié)果

Tab.4 Main phenotypic traits of X12XC30 and X13SZ03 strains

續(xù)表

注: “＋”表示結(jié)果為陽性; “－”表示結(jié)果為陰性; “ND”表示沒有可提供的數(shù)據(jù); “d”表示有差異。

圖2 基于16S rDNA基因構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹

圖3 基于rctB基因構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹

圖4 基于toxR基因構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹

圖5 rctB-toxR串聯(lián)序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹

3.4 菌株耐藥性檢測

致病菌X12XC30與X13SZ03對12種抗菌藥物敏感性的檢測結(jié)果, 顯示2株哈維弧菌均耐呋喃唑酮; 對諾氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星和氯霉素等藥物敏感。而對慶大霉素、四環(huán)素、阿莫西林、利福平、復方新諾明、紅霉素和頭孢克肟等藥物的敏感性存在明顯差異(見表5)。

4 討論

經(jīng)人工感染實驗, 分離到X12XC30和X13SZ03對應菌株X12XC30-1和X13SZ03-1, 對這四株菌進行形態(tài)以及常規(guī)生理生化鑒定, 結(jié)果顯示為革蘭氏陰性短桿菌, TCBS上呈黃色, O/129(150 ug·片-1)敏感。生理生化鑒定結(jié)果與哈維弧菌特征極為相近, 與其他研究者的鑒定結(jié)果, 部分鑒定項存在差異[29–30], 如實驗菌株在利用甘露醇、肌醇及淀粉等項目中與哈維弧菌標準株有差異, 不能完全確定這兩株菌是否為哈維弧菌。另外, 對X12XC30和X13SZ03進行了分子生物學鑒定, 1[31],和管家基因建立的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示兩株菌與哈維弧菌聚類到一支。根據(jù)曾德乾等[22]研究結(jié)果, 將兩個基因序列串聯(lián)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹, 能夠快速有效的鑒別哈維弧菌, X12XC30和X13SZ03的基因串聯(lián)構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹, 均自然地聚類到哈維弧菌分支。綜合生理生化與分子生物學鑒定結(jié)果, 可確定這兩株菌為哈維弧菌。

表5 致病菌X12XC30與X13SZ03對不同抗菌藥物的敏感性

注: R為耐藥; I為中度敏感; S為高度敏感

沈錦玉等[32]從浙江患病大黃魚分離的哈維弧菌病原株GYC1108-1回歸感染大黃魚實驗, 該菌LD50為1.1×108CFU·g-1, 對原宿主致病性較強。梅冰等[33]從海南三亞患病的斜帶石斑魚分離的哈維弧菌, 人工感染后得到的LD50為1.05×104CFU·g-1, 表明哈維弧菌有強致病性。本文中, 從患病珍珠龍躉分離到病原菌X12XC30和X13SZ03, 經(jīng)過人工感染實驗確認, 均具有強致病性, 其LD50分別為6.58×106CFU·g-1和9.83×105CFU·g-1。感染后的珍珠龍躉體表有潰瘍, 取瀕死實驗魚解剖發(fā)現(xiàn)肝臟、脾臟不同程度腫大, 與分離菌株的患病魚癥狀表現(xiàn)一致, 證明這兩株菌具備重復感染的能力, 且具有強毒性。證實哈維弧菌在海水養(yǎng)殖魚類中, 是一個重要的細菌性病原, 具有強致病性, 能造成海水魚的死亡。

本文選取的12種抗菌藥物包括國標漁藥, 及以前可用或禁用的藥物, 可用于借鑒分析養(yǎng)殖中抗菌藥物的使用, 抗菌藥物風險及耐藥性污染的評估工作[34]。2株哈維弧菌均耐呋喃唑酮; 而對諾氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星和氯霉素等藥物敏感。在養(yǎng)殖生產(chǎn)中, 哈維弧菌泛濫, 毒害水產(chǎn)養(yǎng)殖動物, 可使用原粉諾氟沙星等藥物拌飼料投喂, 緩解、去除哈維弧菌病害, 保護養(yǎng)殖動物。哈維弧菌所處環(huán)境的差異, 使得其對慶大霉素、四環(huán)素、阿莫西林、利福平、復方新諾明、紅霉素和頭孢克肟等藥物的敏感性存在明顯的差異。有研究發(fā)現(xiàn), 水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境分離的哈維弧菌對頭孢菌素類的頭孢噻吩(KF)等和新型β-內(nèi)酰胺單酰胺環(huán)類的氨曲南(AZT)等多種抗生素耐藥[35]; 而自然海域分離的哈維弧菌耐藥譜為DOX/AMP/PEN/GEN/CIP/NOR/AK、DOX/AMP/PEN/ GEN/CIP[36]。環(huán)境影響細菌的耐藥性, 而抗生素的過度使用, 導致細菌對抗菌藥物產(chǎn)生更多的耐性, 污染養(yǎng)殖及自然海域, 擾亂海域的生態(tài)系統(tǒng)平衡。

X12XC30和X13SZ03分別分離自海南和廣東, 其表現(xiàn)出相似的毒性與癥狀, LD50無明顯差異, 可能與珍珠龍躉的幼苗來源有關(guān), 廣東珍珠龍躉魚苗從海南購買的魚苗攜帶有哈維弧菌, 通常情況下是正常菌群, 而當外界環(huán)境改變導致哈維弧菌大量繁殖, 產(chǎn)生毒性, 致使珍珠龍躉死亡, 說明哈維弧菌具有廣泛的毒性作用[37–38]。通過對珍珠龍躉患病魚分離的哈維弧菌的致病性、生物學鑒定分析及藥敏實驗, 為我國魚類弧菌病的防治及流行病學提供生物學基礎, 為水產(chǎn)細菌性病害的用藥提供理論基礎。

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Isolation and identification of two pathogeneticstrains from pearl gentian

JIANG kui, XU liwen, SU youlu, MA hongling, LIU guangfeng, GUO zhixun, GAO fang, FENG juan*

South China Sea Fisheries Research Institute, China Academy of Fishery Science; Key Laboratory for Exploitation and Utilization of Marine Fisheries Resource in South China Sea, Ministry of Agriculture, Guangzhou 510300, China

In this study, two bacterial strains (X12XC30 and X13SZ03) were isolated from pearl gentian cultured in Guangdong and Hainan province. The analysis of regression experimental infection test confirmed they were brachychronic pathogenicasthe LD50of X12XC30 and X13SZ03 to pearl gentian was 6.58×106CFU·g-1and 9.83×105CFU·g-1, respectively. The results showed that the two strains wereGram-negative and short rod in shape, exhibited yellow in TCBS and were susceptible toO/129 (150ug·tablet-1) with their phenotypic and molecular characteristics studied, which were similar tomorphologically, physiologically and biochemically. Their,andgenes were highly similar to those ofretrieved from Genbank. In the phylogenetic trees based onandsequences, the two strains all merged within a branch, and they were identified as. The susceptibility test showed that two strains ofwere resistant to furazolidone, while were sensitive to norfloxacin, enrofloxacin, ciprofloxacin and chloramphenicol.is highly pathogenic to pearl gentian and has a potential threat in breeding and culturing

; pearl gentian; identification

10.14108/j.cnki.1008-8873.2017.06.003

S941.42

A

1008-8873(2017)06-016-09

2016-10-18;

2016-12-29

海南省科技興海項目(2015XH03), 廣東省級魚病防治專項資金項目(2015), 廣東省海洋漁業(yè)科技與產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項資金(A201501B14)

蔣魁(1990—), 男, 碩士研究生, 主要從事海水魚類弧菌病害研究, E-mail: jiangkui0514@163.com

馮娟(1973—), 女, 博士, 研究員, 從事魚類疾病的防治研究, E-mail: jannyfeng@163.com