武 曦，張舒雯，蔡雨晴，馬凱婷

（長治學(xué)院 化學(xué)系，山西 長治 046011）

毛細(xì)管電泳法用于三種苦參生物堿的分離

武 曦，張舒雯，蔡雨晴，馬凱婷

（長治學(xué)院 化學(xué)系，山西 長治 046011）

文章通過優(yōu)化流動(dòng)相pH、流動(dòng)相中有機(jī)相種類以及比例、分離電壓等條件實(shí)現(xiàn)了槐果堿、氧化苦參堿以及苦參堿的有效分離。結(jié)果表明，本研究提出的方法具有更高的分離效率，在分離速度快的前提下，得到了可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

毛細(xì)管電泳；苦參堿；氧化苦參堿；槐果堿

苦參來源于豆科槐屬植物苦參的根部，具有清熱燥濕、殺蟲和利尿的功效，在我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中是一味常見的中藥。其中苦參堿類化合物是苦參中最重要的一類活性化合物，其對(duì)人體的消化系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)的部分疾病具有良好的治療效果，同時(shí)還具有一定的抗腫瘤作用[1]?？鄥A類化合物由苦參堿、氧化苦參堿、槐果堿等數(shù)十種化合物組成，成分十分復(fù)雜[2]。而且苦參堿類化合物存在分子結(jié)構(gòu)相似，分離難度大的問題，這使得對(duì)苦參中苦參堿類化合物的定性定量分析變成了一項(xiàng)及其困難的挑戰(zhàn)。

目前，以液相色譜（HPLC）和氣相色譜（GC）為代表的色譜技術(shù)由于其具有分離效率高，應(yīng)用范圍廣的優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于中藥活性成分的定性定量分析。Zeng等[3]利用超聲輔助提取接合HPLC，對(duì)錦雞兒植物中的酚酸進(jìn)行了提取分離，確定了錦雞兒植物中的酚酸主要為綠原酸、香草酸、咖啡酸和迷迭香酸。Stavrianidi等[4]則利用高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HPLC-MS）對(duì)含人參功能性食品中的皂苷進(jìn)行了定量分析，利用HPLC-MS技術(shù)，在不需要提供標(biāo)準(zhǔn)品的前提下，作者實(shí)現(xiàn)了16種人參皂苷的快速檢測(cè)。Yang等[5]利用GC結(jié)合氫火焰離子檢測(cè)器（FID）對(duì)廣藿香中的揮發(fā)油進(jìn)行了分析，作者對(duì)36個(gè)廣藿香樣品進(jìn)行了指紋圖譜分析，從而建立了一種對(duì)廣藿香進(jìn)行質(zhì)量控制的方法。此外，針對(duì)生物堿類化合物的分析，江林等[6]采用GC檢測(cè)了苦參及其制劑中的苦參堿和氧化苦參堿的含量。葉錦雄[7]等使用HPLC檢測(cè)了陽和膏中3種生物堿的含量。上述研究表明，采用色譜法對(duì)生物堿進(jìn)行分析是一項(xiàng)十分成熟的技術(shù)，然而，也需要注意到，應(yīng)用色譜法對(duì)生物堿進(jìn)行分析也存在一些不足，如GC法的應(yīng)用范圍窄，且樣品不可回收；HPLC的分離效能無法滿足復(fù)雜基質(zhì)樣品的分析，需要進(jìn)行復(fù)雜的樣品預(yù)處理排除雜質(zhì)干擾，并且還存在著試劑消耗大，分析時(shí)間長的缺點(diǎn)。

毛細(xì)管電泳法（CE）是以石英毛細(xì)管為分離部件、高壓電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，依據(jù)各組分之間淌度的差異實(shí)現(xiàn)對(duì)混合物的分離的分析技術(shù)。具有分析速度快，分離效率高、試劑消耗少和實(shí)驗(yàn)成本低等突出優(yōu)點(diǎn)。此外CE還有多種分離模式，大大擴(kuò)展了其應(yīng)用范圍。目前，CE也被廣泛應(yīng)用于藥物分析領(lǐng)域。張國慶等[8]采用CE法測(cè)定了3批次肝力保膠囊中苦參堿以及氧化苦參堿的含量，證明此法操作簡便,結(jié)果可靠。上述研究表明CE法在生物堿的分離分析中有良好的應(yīng)用前景。其中苦參堿、氧化苦參堿和槐果堿由于分子結(jié)構(gòu)相似（如圖1所示），因而分離難度大。文章通過CE技術(shù)對(duì)苦參中的苦參堿、氧化苦參堿和槐果堿三種生物堿進(jìn)行分離，優(yōu)化了其分離條件。結(jié)果表明：CE法分離苦參堿類化合物具有分析速度快，分離效率高等特點(diǎn)，可以為苦參中活性成分的快速檢測(cè)提供了一種新的途徑。

圖1 苦參堿、氧化苦參堿和槐果堿分子結(jié)構(gòu)

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

CL3030高效毛細(xì)管電泳儀（北京華陽利民儀器有限公司），石英毛細(xì)管（100 μm i.d./375 μm o.d.，河北鑫諾光纖公司），CEC-MSP-001手動(dòng)泵（上海通微分析技術(shù)有限公司），KQ5200DE數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），BSA124S-CW電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）。

鹽酸（永飛化學(xué)試劑有限公司），氫氧化鈉（天津市凱通化學(xué)試劑有限公司），乙酸（天津市大茂化學(xué)藥劑廠），無水乙酸鈉（天津市大茂化學(xué)藥劑廠），乙醇（天津市凱通化學(xué)試劑有限公司），異丙醇（天津市凱通化學(xué)試劑有限公司），以上試劑均為分析純。乙腈（色譜純，天津奧普升化工有限公司），實(shí)驗(yàn)用水為哇哈哈純凈水，購自當(dāng)?shù)爻?。苦參堿、氧化苦參堿和槐果堿標(biāo)準(zhǔn)品均由山西振東制藥有限公司提供。

1.2 電泳條件

在本研究中，選擇醋酸/醋酸鈉緩沖溶液做為流動(dòng)相水相，乙腈為流動(dòng)相有機(jī)相，采用紫外檢測(cè)器，紫外檢測(cè)波長210 nm，采用位差進(jìn)樣，分離電壓為15 kV。石英毛細(xì)管（100 μm i.d.，375 μm o.d.）有效長度為50 cm，每次使用前，需用0.1 mol/L的鹽酸沖洗至少15 min，然后使用去離子水沖洗10 min，隨后用0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液沖洗15 min，再用去離子水沖洗10 min，使用前用流動(dòng)相沖洗10 min。分析過程中，兩次分析間同樣使用流動(dòng)相沖洗5 min。所有溶液使用之前全部用超聲波清洗脫氣1 min，并用微孔濾膜過濾。樣品在使用前超聲脫氣10 min，微孔濾膜過濾后進(jìn)樣，電泳運(yùn)行時(shí)間為30 min。同一樣品在相同條件下重復(fù)測(cè)試至少三次。

1.3溶液的配制

緩沖溶液的配制：量取2.86 mL的乙酸，轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶中并用去離子水定容，得到200 mM的乙酸溶液；稱取4.10 g的乙酸鈉固體，溶解并轉(zhuǎn)移至250 mL的容量瓶中并用去離子水定容，得到200 mM的乙酸鈉溶液，實(shí)驗(yàn)中根據(jù)需要稀釋使用。

模擬樣品的配制：取苦參堿、氧化苦參堿和槐果堿標(biāo)準(zhǔn)瓶適量，加流動(dòng)相稀釋10倍，低溫保存于具塞樣品瓶中。

2 結(jié)果與討論

2.1 有機(jī)相種類對(duì)三種生物堿分離效果的影響

苦參中生物堿的主要成分為苦參堿、氧化苦參堿以及槐果堿，在研究中，我們將三種生物堿混合，作為模擬樣品，考察影響其分離的因素，篩選出了最佳的毛細(xì)管電泳條件。為了研究流動(dòng)相中有機(jī)相種類對(duì)生物堿CE分離的影響，筆者選用了異丙醇，乙醇，乙腈作為流動(dòng)相的有機(jī)相進(jìn)行考察。在考察過程中，筆者使用的鹽濃度為20 mM，pH為6.0，電泳電壓15 kV，醋酸/醋酸鈉緩沖溶液作為背景電解液水相（85%），檢測(cè)波長210 nm，采用位差進(jìn)樣。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，圖中譜峰1、2、3分別為苦參堿、氧化苦參堿以及槐果堿。從圖中可以看出，當(dāng)使用乙醇作為有機(jī)相時(shí)，苦參堿與氧化苦參堿的分離度較差，沒有達(dá)到基線分離。使用異丙醇以及乙腈作為有機(jī)相時(shí)，三種生物堿均實(shí)現(xiàn)了基線分離。但是乙腈作為有機(jī)相時(shí)，分析時(shí)間明顯更短，分離效果更佳，峰形更為對(duì)稱、尖銳。因此，文章采用乙腈作為背景電解液的有機(jī)相來分離這三種苦參生物堿。

圖2 有機(jī)相種類對(duì)三種生物堿分離效果的影響

2.2 流動(dòng)相pH對(duì)苦參活性成分分離的影響

文章進(jìn)一步考察了背景電解液pH值對(duì)三種生物堿電泳分離的影響。在考察過程中，采用了醋酸鹽緩沖溶液：乙腈（85∶15）為流動(dòng)相，緩沖溶液鹽濃度為20 mM，運(yùn)行電壓為15 kV，紫外檢測(cè)波長為210 nm，位差進(jìn)樣。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。從圖中可以看出，在12 min內(nèi)就完成了對(duì)三種生物堿的分離，圖中譜峰1、2、3分別為苦參堿、氧化苦參堿以及槐果堿。其中槐果堿與其他組分均有良好的分離效果，然而當(dāng)流動(dòng)相pH為5.0時(shí)，苦參堿與氧化苦參堿的分離沒有達(dá)到基線分離。而當(dāng)緩沖溶液pH分為6.0以及7.0時(shí)，苦參堿與氧化苦參堿的分離效果良好，如圖中譜峰1和譜峰2所示，可以看出兩者實(shí)現(xiàn)了基線分離，顯然當(dāng)pH為6.0時(shí)，苦參堿與氧化苦參堿的分離效果更好，因此，筆者認(rèn)為用CE分離這三種生物堿時(shí)，流動(dòng)相的最佳pH為6.0。

圖3 流動(dòng)相pH對(duì)三種生物堿分離效果的影響

2.3 流動(dòng)相中乙腈含量對(duì)苦參活性成分分離的影響

進(jìn)一步考察流動(dòng)相中乙腈含量對(duì)電泳分離苦參生物堿的影響。在考察過程中，筆者使用的乙腈在流動(dòng)相中的體積比分別為15%，20%，25%，鹽濃度為20 mM，pH為6.0，電壓為15 kV，檢測(cè)波長210 nm，采用位差進(jìn)樣。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。圖中譜峰1、2、3分別為苦參堿、氧化苦參堿以及槐果堿。從圖中可以看出，當(dāng)乙腈含量為15%時(shí)，三種生物堿取得了良好的分離效果。但隨著乙腈在背景電解液中含量的增加，三種生物堿的分離效果逐漸變差，因此，可以認(rèn)為背景電解液中乙腈含量較低時(shí)，有利于三種苦參生物堿的分離。此外需要說明的是，當(dāng)乙腈含量低于15%時(shí)，由于電流較大，焦耳熱效應(yīng)使毛細(xì)管中的流動(dòng)相產(chǎn)生氣泡，造成斷流現(xiàn)象，因此，本實(shí)驗(yàn)中乙腈含量低于15%的條件沒有進(jìn)行考察。

圖4 乙腈含量對(duì)三種生物堿分離效果的影響

2.4 分離電壓對(duì)苦參活性成分分離的影響

圖5 分離電壓對(duì)三種生物堿分離效果的影響

分離電壓對(duì)毛細(xì)管電泳的分離有較大影響，因此在對(duì)生物堿電泳分離條件的優(yōu)化過程中，分離電壓的選擇也是一個(gè)重要的工作。在考察過程中，我們使用的分離電壓分別為15 kV，17 kV，19 kV，21 kV，鹽濃度為20 mM，pH為6.0，醋酸鹽緩沖溶液作為流動(dòng)相水相（85%），乙腈為流動(dòng)相有機(jī)相（15%），紫外檢測(cè)波長210 nm，位差進(jìn)樣。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，圖中譜峰1、2、3分別為苦參堿、氧化苦參堿以及槐果堿。從圖中可以看出，使用較高的分離電壓時(shí)組分出峰時(shí)間早，分離速度快，但苦參堿以及氧化苦參堿的分離效果也隨之下降。當(dāng)分離電壓降低時(shí)，苦參堿以及氧化苦參堿的分離度以及峰形得到明顯改善。當(dāng)分離電壓為15 kV時(shí)，三種生物堿實(shí)現(xiàn)了基線分離且峰形良好。因此，在保證分離速度盡可能快的前提下，我們選擇15 kV作為最佳分離電壓來對(duì)三種生物堿進(jìn)行分離。

3 總結(jié)

文章通過優(yōu)化分離電壓、流動(dòng)相pH、有機(jī)相種類以及水相有機(jī)相的比例四個(gè)條件實(shí)現(xiàn)了苦參堿、氧化苦參堿以及槐果堿的有效分離。首先，我們考察了流動(dòng)相pH對(duì)苦參生物堿CE分離效果的影響，結(jié)果表明當(dāng)緩沖溶液pH為6.0時(shí)，三種生物堿的分離效果更好。其次，在緩沖溶液中加入了三種常用的有機(jī)溶劑，異丙醇、乙醇以及乙腈，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用乙醇以及異丙醇作為流動(dòng)相有機(jī)相時(shí)，三種生物堿的分離效果差。乙腈作為背景電解液的有機(jī)相時(shí)，分析時(shí)間最短，且譜峰峰形更好，得到的分離效果最佳。因此，本研究選擇乙腈作為背景電解液的有機(jī)相。然后，優(yōu)化乙腈在背景電解液中的比例，在保證系統(tǒng)電流不過大的前提下，發(fā)現(xiàn)隨著乙腈比例的增大，三種生物堿的分離度逐漸降低，因此綜合考慮各項(xiàng)因素，本研究選擇乙腈在背景電解液中的比例為15%。最后，我們采用四種不同的分離電壓，考察了電壓對(duì)CE分離三種生物堿的影響，發(fā)現(xiàn)隨著電壓的升高，苦參堿以及氧化苦參堿的分離效果越來越差。因此，在保證分離速度盡可能快的前提下，選擇15 kV作為最佳分離電壓來對(duì)三種生物堿進(jìn)行分離。

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O657.8

A

1673-2014（2017）05-0013-04

山西省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目“中藥黨參HPLC指紋圖譜研究”（2015434）

2017—03—21

武曦（1984— ），男，山西長治人，副教授，博士，主要從事復(fù)雜體系分析方法研究。

（責(zé)任編輯 周成勇）