張寶秀，張淑萍，蘇 靜

（長(zhǎng)治學(xué)院 化學(xué)系，山西 長(zhǎng)治 046011）

巰基-烯復(fù)合物與巰基交換反應(yīng)的可控調(diào)節(jié)

張寶秀，張淑萍，蘇 靜

（長(zhǎng)治學(xué)院 化學(xué)系，山西 長(zhǎng)治 046011）

合成了兩種不同pKa巰基的巰基-烯復(fù)合物模板分子EtSCN2和PhSCN2，通過超高效液相色譜研究了50 M的模板分子與1 mM還原型谷胱甘肽的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，二者與GSH加成-消除反應(yīng)的Halflife分別為14.8 min和1.5 min，相差將近十倍。初步實(shí)現(xiàn)了巰基與巰基-烯復(fù)合物的交換反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)控制。

巰基；交換反應(yīng)；動(dòng)力學(xué)控制

1 引言

作為調(diào)控細(xì)胞內(nèi)外氧化還原環(huán)境、維持蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的重要物種[1-6]，GSH含量變化與老年癡呆癥、癌癥、心腦血管疾病等多種疾病有關(guān)，是細(xì)胞內(nèi)最豐富的硫醇小分子（1-10 mmol/L）[7]，但其在腫瘤組織細(xì)胞外的濃度僅為1-10 μmol/L8],因此根據(jù)腫瘤細(xì)胞內(nèi)外谷胱甘肽含量的差異，很多含有可被巰基交換的含硫藥物遞送體系被設(shè)計(jì)出來。但是不同的腫瘤組織微環(huán)境內(nèi)巰基物種的含量是不同的，為了能夠根據(jù)需要釋放藥物或者探針分子，需要調(diào)控巰基交換的反應(yīng)性能，但是目前為止調(diào)控巰基交換性能的工作還鮮有報(bào)道。文章以巰基-烯烴復(fù)合物為母體，通過調(diào)節(jié)含有不同pKa的巰基連接單元，初步實(shí)現(xiàn)了交換反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)控制。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

對(duì)羧基苯硫酚（AR），丙二腈（AR），原戊酸三甲酯（AR），無水乙腈（AR），三乙胺（AR），碳酸氫鈉（AR），無水乙醚。

Waters半制備型色譜儀，Bruker AV 500 MHz核磁共振儀，Esquire 3000 plus電噴霧離子肼質(zhì)譜儀，Waters超高效液相色譜儀。

2.2 模型分子的合成與表征

（1）2-（甲氧基苯基）亞甲基）丙二腈（MeOCN2）的合成

圖1 MeOCN2合成路線

0.66 g（10 mmol）溶于5 mL乙酸酐，攪拌下加入1.62 g（10 mmol）原戊酸三甲酯，體系回流反應(yīng)15 h，冷卻至室溫后用水稀釋，混合液用乙醚萃取三次，有機(jī)相用飽和碳酸氫鈉和飽和氯化鈉洗滌，無水硫酸鈉干燥，旋蒸后得到目標(biāo)產(chǎn)物1.39 g，產(chǎn)率75%；1H NMR（500 MHz,DMSO）δ 7.74-7.60（m, 5H），3.89（s,3H）.MS（m/z）184.25（M+H）+.（2）2-（乙硫基苯基）亞甲基）丙二腈（EtSCN2）的合成

圖2 EtSCN2合成路線

將90 mg（0.5 mmol）化合物1和63 mg（1 mmol）乙硫醇溶于2 ml無水乙腈，加入200 mL三乙胺，室溫下攪拌過夜，制備色譜分離純化；MS（m/z）214.35（M+H）+。（3）2-（對(duì)羧基苯硫酚基苯基）亞甲基）丙二腈（PhSCN2）的合成

圖3 PhSCN2合成路線

將90 mg（0.5 mmol）化合物1和154 mg（1 mmol）乙硫醇溶于2 mL無水乙腈，加入200 L三乙胺，室溫下攪拌過夜，制備色譜分離純化；MS（m/z）306.10（M+H）+。

2.3 實(shí)驗(yàn)方法

合成了兩種具有不同巰基釋放活性的藥物載體分子，通過核磁和質(zhì)譜表征了其結(jié)構(gòu)，通過液相色譜儀研究了雙鍵上不同pKa的巰基取代載體作為受體單元與GSH的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。

2.3.1 溶液配制

（1）10 mmol/L EtSCN2母液的配制：稱量4.3 mg，溶于2 mL乙腈；（2）10 mmol/L PhSCN2配制：稱量6.1 mg，溶于2 mL乙腈；（3）稱量39 mg還原型谷胱甘肽（GSH）溶于5 mL純水（氮吹去氧）中；（4）PB（100 mmol/L，pH=7.4）：A液（0.2 M Na2HPO4）配制：稱量14.32 g Na2HPO4-12H2O，溶于200 ml純水；B液 （0.2M NaH2PO4） 配制：稱取 6 g NaH2PO4-2H2O，溶于200 mL純水，將38 mL B液和162 mL A液混合，并用純水稀釋一倍，用pH測(cè)定儀測(cè)定pH，NaOH和HCl溶液調(diào)節(jié)pH=7.4，本文所使用緩沖液均為該緩沖液。

2.3.1 GSH取代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

在兩個(gè)1.5 mL的離心管離用乙腈分別從母液稀釋配制200 mol/L的EtSCN2溶液與200 mol/L的 PhSCN2溶液各 500L。從母液稀釋得到 4 mmol/L谷胱甘肽的PB溶液于1.5 mL離心管中。分別取500 L GSH加入到200 mol/L的EtSCN2溶液與200 mol/L的PhSCN2溶液中去并開始計(jì)時(shí)。小分子最終濃度為50mol/L，GSH最終濃度為1 mmol/L。分別在計(jì)取點(diǎn)時(shí)間時(shí)取兩溶液各50 μL加入到10%偏磷酸中猝滅反應(yīng)，并使用UPLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程。

3 結(jié)果與討論

圖4 50 mol/L EtSCN2與1 mml/L GSH反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

首先考察了乙硫醇作為取代基團(tuán)時(shí)1 mmol還原型谷胱甘肽對(duì)模板分子EtSCN2的取代動(dòng)力學(xué)。該模板分子是由乙硫醇與與MeOCN2通過親核加成-消除反應(yīng)所得，由于乙硫醇具有較大的pKa值，巰基活性較低，當(dāng)其作為親核試劑加成并消除掉甲氧基形成新的巰基-烯烴取代產(chǎn)物后，雙鍵碳上電子云密度較大，GSH作為新的親核試劑加成到雙鍵上較為困難。同時(shí)當(dāng)GSH的加成產(chǎn)物形成后，由于較高的pKa，乙硫醇離去較為困難，因此在動(dòng)力學(xué)上表現(xiàn)為較大的半衰期。其取代半衰期Halflife為14.38 min，完全釋放用時(shí)兩個(gè)多小時(shí)，如果我們選取具有更高pKa的巰基取代物作為連接藥物的連接單元，會(huì)得到更久的釋放動(dòng)力學(xué)。

圖5 50 mol/L EtSCN2與1 mml/L GSH反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

作為對(duì)照，接下來考察了苯硫酚作為取代單元時(shí)（PhSCN2）體系對(duì)1 mmol還原型谷胱甘肽的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。苯硫酚相較于乙硫醇具有更低的pKa（pKa=7.8），其巰基活性更高，作為離去基團(tuán)時(shí)也更容易離去。但是相較于乙基，苯環(huán)具有更大的剛性和體積，因此當(dāng)GSH作為親核試劑進(jìn)攻時(shí)，位阻會(huì)稍大于乙硫醇，這不利于反應(yīng)的進(jìn)行，兩者綜合起來如圖5所示。相較于EtSCN2，苯硫酚的低pKa使得該模板分子與GSH有更快的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，其取代半衰期Halflife=1.5 min，完全釋放用時(shí)不到十分鐘，這比EtSCN2快了10倍左右。

4 總結(jié)與展望

通過調(diào)控雙鍵上連接鍵巰基的pKa和位阻，能夠進(jìn)而調(diào)控其作為載體時(shí)修飾的藥物或探針分子的釋放行為，這為利用生命體系細(xì)胞內(nèi)外，不同組織，不同細(xì)胞器巰基物種多少的差異來實(shí)現(xiàn)可控、原位釋放藥物或者攜帶探針熒光成像提供了理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)支持。

［1］GO Y M,JONES D P.Biochimica et Biophysica Acta,2008,1780（11）:1273-1290.

［2］CIRCU M L,AW T Y.Free Radical Biology& Medicine,2010,48（6）:749-762.

［3］CAIRNS R A,HARRIS I S,MAK T W. Nature Reviews Cancer,2011,11（2）:85-95.

［4］Peng H J,Chen W X,Cheng Y F,et al.Sensors, 2012,12:15907-15946.

［5］CASTALDO S A,FREITAS J R,CONCHINHA N V,et al.Oxidative Medicine and Cellular Longevity,2016,2016（3）:1-17.

［6］BRULISAUER L,GAUTHIER M A,LEROUX J C.Journal of Controlled Release,2014,195: 147-154.

［7］CHAISWING L,OBERLEY T D.Antioxidants &Redox Signaling,2010,13（4）:449-465.

［8］SCHAFER F Q,BUETTNER G R.Free Radical Biology&Medicine,2001,30（11）:1191–1212.

The Dynamic Control of the Exchange Reaction between Sulfhydryl and Mercapto-ene Compounds

Zhang Bao-xiu,Zhang Shu-ping,Su Jin
（Department of Chemistry Changzhi University,Changzhi Shanxi 046011）

Two mercapto-ene compounds with different pKa of thiol were synthesized.The reaction kinetics of 50 M molecular templates with 1 mM GSH was then studied by UPLC and the results showed that there was a ten times difference in Halflife with 14.8 min and 1.5 min.The dynamic control of the exchange reaction between sulfhydryl andmercapto-ene compound is preliminarily implemented.

thiol;exchange reaction;dynamic control

O62

A

1673-2014（2017）05-0021-03

長(zhǎng)治學(xué)院校級(jí)課題（201417）；山西省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目（2014432）

2017—06—11

張寶秀（1964— ），女，山西陵川人，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，主要從事藥物化學(xué)方面研究。

（責(zé)任編輯 周成勇）