葛志琪 ，劉亞剛 *， 陳 舜 ，朱德康 ，劉馬峰 ，汪銘書 ，賈仁勇 ，孫昆峰 ，楊 喬 ，吳 英 ，趙新新 ，程安春 *

（1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610041；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，預(yù)防獸醫(yī)研究所，成都 611130；3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，禽病防治與研究中心，成都 611130；4.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，動物疾病與人類健康四川省重點實驗室，成都 611130）

新型鵝細(xì)小病毒四川株的全基因組擴(kuò)增及遺傳進(jìn)化分析

葛志琪1，劉亞剛1*， 陳 舜2，3，4，朱德康2，3，4，劉馬峰2，3，4，汪銘書2，3，4，賈仁勇2，3，4，孫昆峰2，3，4，楊 喬2，3，4，吳 英2，3，4，趙新新2，3，4，程安春2，3，4*

（1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610041；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，預(yù)防獸醫(yī)研究所，成都 611130；3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，禽病防治與研究中心，成都 611130；4.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，動物疾病與人類健康四川省重點實驗室，成都 611130）

【目的】了解四川地區(qū)新型鵝細(xì)小病毒（Novel goose parvovirus，NGPV）的分子生物學(xué)特征及遺傳變異情況。【方法】根據(jù)GenBank中發(fā)表的新型鵝細(xì)小病毒的全基因組序列，設(shè)計5對兼并引物采用PCR方法分段擴(kuò)增新型鵝細(xì)小病毒四川株的全基因組序列，并利用DNAstar等生物信息分析軟件對獲得的基因組序列進(jìn)行分子特性與遺傳演變分析。【結(jié)果】獲得的新型鵝細(xì)小病毒四川株（命名為SC16）全長5109 nt，5′端ITR長408 nt，3′端ITR長407 nt，NS基因長1884 nt，VP基因長2199 nt。序列比對和遺傳進(jìn)化分析顯示，SC16株與山東分離株SDLC01（KT343253.1）及QH15（KT751090.1）的基因組核苷酸同源性高達(dá)99%，與兩者的親緣關(guān)系最近，基于NS及VP蛋白的氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果與此一致。但SC16株的5′端ITR還是發(fā)生了一定的變異：與SDLC01及QH15相比，多了幾個14 nt的插入片段?！窘Y(jié)論】研究結(jié)果豐富了NGPV的分子生物學(xué)資料。

新型鵝細(xì)小病毒；鴨短喙侏儒綜合征；全基因組擴(kuò)增；遺傳進(jìn)化分析

傳統(tǒng)的水禽細(xì)小病毒主要包括鵝細(xì)小病毒（Goose parvovirus，GPV）和番鴨細(xì)小病毒（Muscovy duck parvovirus，MDPV）[1]。鵝細(xì)小病毒對雛鵝和雛番鴨有較高的致病性，10日齡以內(nèi)的雛鵝的發(fā)病率和死亡率可高達(dá)100%[2]，主要病理特征是纖維素性滲出性腸炎和腸道形成堵塞物。番鴨細(xì)小病毒主要侵害1～3周齡的雛番鴨，俗稱“三周病”，臨診特征為腹瀉、喘氣和腳軟，具有高度傳染性，其發(fā)病率和死亡率都較高，易感動物除雛番鴨外，未見其他禽類或哺乳類動物發(fā)生本病。

自2015年以來，與鵝細(xì)小病毒密切相關(guān)的中等致病性的新型鵝細(xì)小病毒（Novel goose parvovirus，NGPV）在我國福建省[3]、山東省[4]、安徽省[5]等省份的半番鴨和櫻桃谷鴨中暴發(fā)流行，鴨群感染后臨床表現(xiàn)為發(fā)育遲緩、上下喙萎縮、舌頭外伸、腫脹、向下彎曲等，俗稱大（長）舌病、鴨短喙長舌綜合征、鴨短喙-侏儒綜合征（beak atrophy and dwarfism syndrome，BADS）等。該病多侵害10～30日齡的肉鴨,發(fā)病率10%～100%，死亡率2%～10%。雖然死亡率明顯低于鵝細(xì)小病毒感染和番鴨細(xì)小病毒感染，但感染鴨群料肉比顯著升高，患鴨出欄體重較健康鴨降低20%～30%[6]，嚴(yán)重者僅為正常體重的50%[7]。部分患鴨還出現(xiàn)單側(cè)行走困難、癱瘓等癥狀，在抓撲、屠宰過程中喙部、翅部骨骼和脛骨等易發(fā)生骨折。因此僵鴨淘汰率或殘鴨率高達(dá)20%～80%。目前，該病的發(fā)病區(qū)域不斷擴(kuò)大，給我國養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

鴨短喙長舌綜合征是近兩年來暴發(fā)流行的一種疾病，對其病原NGPV的研究目前還比較有限，特別是四川地區(qū)還未見報道。我們查閱GenBank后發(fā)現(xiàn)，目前僅獲得4個NGPV的全基因組序列，更多NGPV毒株的全基因序列測定將有助于理解NGPV的遺傳演化、病毒嗜性、致病機(jī)理及免疫應(yīng)答規(guī)律等相關(guān)信息，為鴨短喙長舌綜合征的防治及疫苗研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 病料來源

2016年11月，四川省峨眉山市某櫻桃谷鴨場暴發(fā)了疑似鴨短喙長舌綜合征，該鴨場鴨子的發(fā)病率為10%左右。送檢的鴨子均具有明顯的短喙、長舌、瘦小等癥狀。

1.2 試驗材料

1.3 病理解剖

對送檢的鴨子進(jìn)行病理解剖，分別采集心、肝、脾、小腸等組織備用，隨時觀察并記錄患鴨及死鴨的臨床癥狀及病理變化。

1.4 PCR檢測

1.4.1 引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank中發(fā)表的新型鵝細(xì)小病毒的全基因組序列，利用Primer Premier 5.0在NGPV VP3保守區(qū)設(shè)計一對特異性引物，引物序列如表1所示，由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。

1.4.2 DNA模板的提取

分別取病鴨及死鴨的肝臟和脾臟，按1∶5加入PBS，充分研磨，6000 r/min，離心 30 min，取上清，利用病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒提取病料中的DNA。

表1 鑒定引物序列Table1 Identification primer sequences

1.4.3 PCR擴(kuò)增

取1.4.2中提取的DNA作為PCR擴(kuò)增的模板。PCR 反應(yīng)體系為：DNA 模板 1 μL，PrimeSTARMax DNA Polymerase 25 μL，上下游引物各 1 μL，ddH2O補(bǔ)足至50 μL。PCR 反應(yīng)條件如下：98℃ 2 min，98℃30 s，60℃ 15 s，72℃ 5 s，30 個循環(huán)，72℃延伸 5 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，疑似陽性者，用DNA純化回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進(jìn)行液回收，然后分別連接pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌SURE株，菌落PCR鑒定陽性者送華大基因測序鑒定。

1.5 全基因組擴(kuò)增

1.5 .1 引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank中發(fā)表的新型鵝細(xì)小病毒的全基因組序列及結(jié)構(gòu)特征，并參照陳浩等人的引物設(shè)計方法[8]，利用Primer Premier5.0設(shè)計5對引物來擴(kuò)增全基因組，擴(kuò)增片段分別以P1～P5表示，引物序列如表2所示，由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。

表2 全基因組序列擴(kuò)增引物Table2 The primers of complete genome sequence amplification

1.5 .2 目的片段的分段擴(kuò)增

取1.4.2中提取的死鴨組織DNA作為PCR擴(kuò)增的模板。每個PCR反應(yīng)體系為50 μL：DNA模板1 μL，PrimeSTARMax DNA Polymerase 25 μL，上下游引物各 1 μL，ddH2O 補(bǔ)足至 50 μL。PCR 反應(yīng)條件參照PrimeSTAR高保真酶的產(chǎn)品說明書進(jìn)行：98 ℃ 2 min，98 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 5～15 s（根據(jù)擴(kuò)增片段長度做相應(yīng)調(diào)整），35個循環(huán)，最后72℃延伸5 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，疑似陽性者，用DNA純化回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進(jìn)行液回收，然后分別連接pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌SURE株，涂布含氨芐的LB固體培養(yǎng)板中，37℃培養(yǎng)過夜，每個片段分別挑取3個菌落PCR鑒定為陽性的單克隆進(jìn)一步送華大基因測序鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 病理剖解

病鴨除了外觀上的短喙長舌之外，剖檢發(fā)現(xiàn)沒有明顯的病變。死鴨體內(nèi)充血嚴(yán)重，肝臟、脾臟、腎臟、肺臟、小腸、胰臟等出現(xiàn)腫大，如圖1所示。

2.2 PCR檢測

根據(jù)在VP3保守區(qū)域設(shè)計的特異性引物，以從病鴨和死鴨肝臟和脾臟提取的DNA為模板來擴(kuò)增目的片段。結(jié)果顯示，病鴨和死鴨體內(nèi)均能擴(kuò)增出約268 bp的特異性片段，如圖2所示。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行液回收，測序后發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增片段大小為268 bp，通過BLAST比對發(fā)現(xiàn)，兩者與具有短喙長舌癥狀的山東分離株SDLC01的相似性為100%。

圖1 死鴨臨床癥狀及病理剖解Figure1 The clinical symptoms and pathological anatomy of dead duck

圖2 268 bp的PCR擴(kuò)增圖Figure2 PCR amplification of 268 bp

2.3 全基因組擴(kuò)增

利用P1～P55對特異性引物，采用PCR方法擴(kuò)增得到各目的片段，如圖3所示。將各個目的片段回收純化后連接載體測序，測序后的各個片段經(jīng)DNAstar 5.0軟件分析、拼接，得到該病毒的全基因組序列。本株NGPV（命名為SC16）全長5109 nt，5′端回文序列（ITR）全長 408 nt，3′端 ITR 全長 407 nt，NS基因長1884 nt，推測編碼627個氨基酸。VP基因長2199 nt，推測編碼732個氨基酸。SC16株的全基因組序列已上傳至GenBank，登錄號為KY679174。

2.4 核苷酸序列同源性比對

為了探討本研究獲得的NGPV核苷酸序列與其他水禽細(xì)小病毒分離株的核苷酸序列的同源性，利用Sequence Demarcation Tool-version 1.2軟件（http://web.cbio.uct.ac.za/SDT）進(jìn)行了全基因組比對，根據(jù)核苷酸序列間的相似性構(gòu)建了二維彩色編碼矩陣圖，如圖4所示。同時該軟件分析結(jié)果顯示SC16株核苷酸序列與具有短喙長舌癥狀的山東分離株SDLC01、QH15的同源性分別達(dá)到了99.6%和99.3%，而與同樣具有短喙長舌癥狀的福建株M15的同源性僅為96.9%，與GPV分離株的同源性在95.4%～97%之間，而與MDPV分離株的同源性比較低，在81.9%～87%之間。涉及的水禽細(xì)小病毒分離株的詳細(xì)信息如表3所示。

圖3 SC16株的全基因組擴(kuò)增Figure3 Amplification of complete genome of SC16 strain

2.5 5′端回文序列（ITR）分析

利用Sequence Demarcation Tool-version 1.2軟件進(jìn)行了SC16株與其他水禽細(xì)小病毒分離株5′ITR核苷酸序列比對，如圖5所示。從圖可以看出，SC16株5′ITR的核苷酸序列仍然是與山東分離株SDLC01和QH15最接近。利用DNAMAN軟件分析發(fā)現(xiàn)，SC16株與SDLC01分離株的不同之處在于NGPV比SDLC01株多了3個長14 nt的插入片段（TCCGGTGAC GCACA、GGTGACGTGTTTCC、GGATGTGCGTCACC），除此之外僅有一個堿基發(fā)生了替換。其中插入片段TCCGGTGACGCACA、GGATGTGCGTCACC在QH15的5′ITR核苷酸序列中也未曾發(fā)現(xiàn)。

表3 水禽細(xì)小病毒分離株信息Table3 Description of waterfowl parvovirus isolates involved in this study

圖4 全基因組比對的2維編碼矩陣圖Figure4 The 2D color coded matrix of complete genome alignment

圖5 5′ITR序列比對的2維編碼矩陣圖Figure5 The 2D color coded matrix of 5′ITR alignment

2.6 NS及VP蛋白的遺傳進(jìn)化分析

使用MEGA5.0軟件 Boot-stapped Neighbor-Joining方法，對SC16株和其他水禽細(xì)小病毒的NS蛋白、VP蛋白的氨基酸序列分別構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹并進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，結(jié)果見圖6、圖7所示。由圖可知，不論是從NS蛋白的氨基酸序列還是從VP蛋白的氨基酸序列來看，SC16株都與山東分離株SDLC01和QH15在同一分支上，而與同樣具有短喙長舌癥狀的福建分離株M15的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。并且SC16株同其他NGPV一樣，與GPV分離株在同一亞支，而與MDPV分離株相距較遠(yuǎn)。同時通過Sequence Demarcation Tool-version 1.2軟件進(jìn)行NS蛋白的氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，SC16株的NS蛋白高度保守，其氨基酸序列與山東分離株QH15完全一致，與山東分離株SDLC01的同源性為99.5%。而VP蛋白的氨基酸序列與山東分離株SDLC01的同源性最高，為99.5%，與山東分離株QH15的同源性為98.9%。

3 討論

3.1 NGPV SC16株的全基因組擴(kuò)增

水禽細(xì)小病毒的基因組均為線性、單鏈DNA，大小約為5 kb。雖然基因組較小，但兩端的末端倒置重復(fù)序列（ITR）的結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，是擴(kuò)增全基因組的難點。Zádori Z等[9]在測定GPV和MDPV的全基因組時發(fā)現(xiàn)，GPV基因組的兩端存在著由444個核苷酸形成的高GC含量的、相同的ITR結(jié)構(gòu)：ITR的前407個核苷酸可形成“U”型發(fā)夾結(jié)構(gòu)，發(fā)夾結(jié)構(gòu)中有181個核苷酸形成無錯配“莖”部和一個44 nt的“泡”區(qū)，外形如“箭”狀，在“箭頭”有一個SphI限制性內(nèi)切酶位點，形成2分對稱中心。MDPV的基因組結(jié)構(gòu)類似于GPV。ITR是發(fā)生高頻重組的熱點區(qū)，在細(xì)菌細(xì)胞基因組缺乏主要的重組基因時，“泡”區(qū)都可能發(fā)生“翻”“轉(zhuǎn)”互變現(xiàn)象，因此ITR完整的“泡”區(qū)克隆到E.coli中，會發(fā)生“翻”“轉(zhuǎn)”方向的互變，造成測序困難。并且ITR形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)使得聚合酶難以通過，PCR方法一次性擴(kuò)增基因組難以實現(xiàn)[10]。因此，在設(shè)計引物時需要考慮將ITR結(jié)構(gòu)剖開，而不是一次性擴(kuò)增完整的ITR序列。本實驗參考GenBank上發(fā)表的具有短喙長舌癥狀的NGPV的全基因組序列及基因組結(jié)構(gòu)特征，通過核苷酸比對后，選擇基因組中相對較保守的區(qū)域設(shè)計了5對兼并引物來分段擴(kuò)增，并且使擴(kuò)增相鄰片段有重疊，PCR擴(kuò)增后分別得到了長204 bp、1397 bp、1489 bp、2419 bp、1461 bp的片段，經(jīng)過軟件拼接后獲得NGPV四川株的全基因組，全長為5109 nt,豐富了GenBank數(shù)據(jù)庫，為NGPV的分子生物學(xué)研究奠定一定的基礎(chǔ)。

圖6 基于NGPV NS蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.6 Phylogenetic tree of NGPV NS protein

圖7 基于NGPV VP蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹Figure7 Phylogenetic tree of NGPV VP protein

3.2 NGPV SC16株的遺傳變異情況

NGPV SC16株的基因組全長為5109 nt，其5′端ITR由408個核苷酸組成，比NGPV的山東分離株SDLC01株多了3個長14 nt的插入片段。細(xì)小病毒基因組兩端的ITR在病毒DNA復(fù)制和包裝過程中起重要作用[11]。有推測稱ITR的長短和病毒毒力有關(guān)，且ITR較短的多為低致病力毒株或疫苗株[12]。但此推測卻與萬春和等[13]的研究結(jié)果不盡一致。目前，關(guān)于水禽細(xì)小病毒全基因組特征的研究特別是NGPV全基因組的研究有限，所以此推測仍需進(jìn)一步研究驗證。

不論從全基因組比對情況還是基于NGPV NS和VP蛋白的遺傳進(jìn)化分析來看，SC16株都與山東分離株SDLC01和QH15親緣關(guān)系最近，相似性都高達(dá)99%左右。通過調(diào)查發(fā)現(xiàn)，送檢的病死鴨的鴨苗均購買自山東省。Chen H.等[14]發(fā)現(xiàn)NGPV在自然狀況下有垂直傳播的可能，可以從種鴨傳至鴨胚和雛鴨。因此，我們推測，本研究分離的NGPV四川株很可能來自山東省，但隨著時間、空間等的改變，病毒不斷發(fā)生遺傳演化，且VP基因上的遺傳進(jìn)化速度較NS基因更快，這與GPV分離株GoPV[13]的遺傳演變情況相似，有報道稱這可能與宿主免疫系統(tǒng)的壓力有關(guān)[15]。NS蛋白主要參與病毒復(fù)制以及基因表達(dá)，這部分結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定可以很好地維持DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄等活動的穩(wěn)定進(jìn)行。而VP蛋白的作用不僅在于病毒顆粒衣殼蛋白的合成及子代病毒的裝配釋放，而更主要的作用是作為配體與相關(guān)的宿主細(xì)胞表面的受體結(jié)合，是病毒感染過程中最為重要的一個因素。因此，病毒為了成功感染宿主細(xì)胞，VP基因可能發(fā)生了一些利于自身生存的變異，從而逃避宿主免疫系統(tǒng)的攻擊。

本研究成功獲得了NGPV四川株的全基因組序列，比較了NGPV四川株與山東分離株及與其他水禽細(xì)小病毒分離株的共性與特性，解釋了引起鴨短喙長舌綜合征的病原在四川的發(fā)生及變異情況，豐富了新型鵝細(xì)小病毒的分子生物學(xué)資料，為該病的流行病學(xué)調(diào)查及防控奠定了理論基礎(chǔ)。

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Amplification and Phylogenetic Analysis of Novel Goose Parvovirus Sichuan Strain

GE Zhi-qi1，LIU Ya-gang1*，CHEN Shun2，3，4，ZHU De-kang2，3，4，LIU Ma-feng2，3，4，WANG Ming-shu2，3，4，JIA Ren-yong2，3，4，SUN Kun-feng2，3，4，YANG Qiao2，3，4，WU Ying2，3，4，ZHAO Xin-xin2，3，4，CHENG An-chun2，3，4*
（ 1.College of Life Science and Technology，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041，China；2.Institute of Preventive Veterinary Medicine，Sichuan Agricultural University，Chengdu 611130，China；3.Avian Disease Research Center，College of Veterinary Medicine of Sichuan Agricultural University，Chengdu 611130，China；4.Key Laboratory of Animal Disease and Human Health of Sichuan Province，Sichuan Agricultural University，Chengdu 611130，China)

【Objective】The aim of this study was to learn the molecular biological characteristics and genetic variation of novel goose parvovirus（NGPV）in Sichuan area.【Methods】5 pairs of degenerate primers were designed to amplify the whole genome sequence of NGPV Sichuan strain using PCR method，according to the genome sequences of the NGPV deposited in GenBank.Then，the study usd DNAstar and other bioinformatics softwares to analyze the molecular characteristics and genetic evolution of the obtained sequences.【Results】The genomic sequence of Novel goose parvovirus from Sichuan(named SC16)was 5109 nucleotides(nt)in length.The inverted terminal repeats(ITRs)at the 5′and 3′end of the genome were 408 nt and 407 nt respectively.The NS protein was encoded by 1884 nt and the VP protein was encoded by 2199 nt.Sequence alignment and phylogenetic analysis demonstrated that the nucleotide identities of SC16 genome and Shandong isolates SDLC01(KT343253.1)andQH15(KT751090.1)was up to 99%，showing a very close genetic relationship with them.The phylogenetic tree analyses of amino acids of NS and VP protein were consistent with this result.However，SC16 still had some genetic variations：compared with SDLC01 and QH15，SC16 had two or three 14-nt extra fragments at the 5′end of the genome.【Conclusion】These findings will enrich the molecular biology information of NGPV.

novel goose parvovirus；beak atrophy and dwarfism syndrome of duck；whole genome amplification；phylogenetic analysis

S834+8

A

1000-2650（2017）04-0574-07

10.16036/j.issn.1000-2650.2017.04.018

2017-05-02

“十二五”國家科技支撐計劃（2015BAD12B05）；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（水禽）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項（CARS-43-8）；國家重點研發(fā)計劃“家禽重要疫病診斷與檢測新技術(shù)研究”（2016YFD0500800）；四川省重點實驗室專項（2016JPT0004）。

葛志琪，碩士研究生。*責(zé)任作者：劉亞剛，教授，博士，主要從事獸醫(yī)免疫學(xué)的研究，E-mail：LYG_068@163.com；程安春，教授，博士，主要從事禽病學(xué)的研究，E-mail：chenganchun@vip.163.com。

（本文審稿：陳宗艷；責(zé)任編輯：秦碧雯；英文編輯：劉益平）