枯草芽孢桿菌M4誘導(dǎo)獼猴桃抗病相關(guān)的防御酶系研究

任平+阮祥穩(wěn)+秦濤

摘要： 采用比色法測定枯草芽孢桿菌M4發(fā)酵液不同組分誘導(dǎo)獼猴桃葉片中苯丙氨酸解氨酶（PAL）、過氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）的活性變化。結(jié)果表明，接種M4發(fā)酵液、菌體懸液、上清液、LB培養(yǎng)基，獼猴桃葉片內(nèi)PAL、POD、PPO、SOD、CAT活性均高于對照無菌水，PAL、PPO、SOD的活性峰值多在接種后8 d出現(xiàn)，POD、CAT的活性峰值多在接種后12 d出現(xiàn)；接種M4發(fā)酵液、菌體懸液的PAL、POD、PPO、SOD、CAT活性均明顯高于接種上清液、LB培養(yǎng)基，且酶活變化趨勢相似，說明M4發(fā)酵液中主要有效誘導(dǎo)組分為菌體。

關(guān)鍵詞： 枯草芽孢桿菌；獼猴桃；多酚氧化酶；苯丙氨酸解氨酶；過氧化氫酶；超氧化物歧化酶；過氧化物酶

中圖分類號：S436.634 文獻標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）22-0111-03

由丁香假單胞菌獼猴桃致病變種（Pseudomonas syringae pv. actinidiae，Psa）引起的獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病往往發(fā)病嚴(yán)重，流行迅速，防治相當(dāng)困難。近年來，隨著獼猴桃栽培面積的不斷增加，細(xì)菌性潰瘍病快速蔓延，自2005年以來，已在世界主要獼猴桃產(chǎn)區(qū)造成嚴(yán)重危害，成為獼猴桃栽培過程中最具毀滅性的病害 。

生物防治是控制植物病害、減少化學(xué)農(nóng)藥污染的有效途徑，而誘導(dǎo)抗性又是植物病害生物防治的重要機理之一[3]，一些微生物可作為植物激活劑，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性而具有良好的防病效果[4]。植物的抗病性與木質(zhì)素及相關(guān)苯丙烷類代謝物質(zhì)的積累、病程相關(guān)蛋白（PRP）的表達、磷酸戊糖途徑、乙醛酸循環(huán)等生理過程密切相關(guān)[5-6]，參與植物抗病代謝的關(guān)鍵酶有苯丙氨酸解氨酶（PAL）、過氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）等，其活性變化是反映植物抗病能力強弱較直接和有效的指標(biāo)之一。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌（Bacillus ssp.）是生防菌的優(yōu)勢菌種，誘導(dǎo)植物抗性是其生防作用實現(xiàn)的重要機制之一[7-8]。陜西省科學(xué)院酶工程研究所微生物實驗室保藏的枯草芽孢桿菌M4對獼猴桃潰瘍病具有較好的生防效果，但該菌株是否具有誘導(dǎo)抗性作用，有關(guān)其不同組分對獼猴桃抗病相關(guān)酶活影響的研究國內(nèi)外還未見報道。因此，本研究選擇PPO、POD、PAL、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）這5種酶作為獼猴桃抗病性反應(yīng)指標(biāo)，研究M4菌株發(fā)酵液不同組分對獼猴桃葉片內(nèi)抗病相關(guān)防御酶系的影響，以期揭示其誘導(dǎo)抗病性機理，為指導(dǎo)其田間應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

枯草芽孢桿菌M4，陜西省科學(xué)院酶工程研究所微生物實驗室保藏；試驗植株為2年生盆栽秦美獼猴桃。LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母浸膏5 g，氯化鈉5 g，蒸餾水1 000 mL，pH值為7.0～7.2。

1.2 菌液的制備及接種

將菌株M4接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)24 h；將發(fā)酵液分成3份，1份保留，另2份合并，4 ℃ 10 000 r/min離心30 min；分別收集菌體和上清液；菌體用無菌水漂洗，再次離心收集，用無菌水稀釋成108 CFU/mL的菌液，而上清液用孔徑為0.22 μm的細(xì)菌過濾器過濾，待溫度升至室溫，備用。試驗設(shè)108 CFU/mL發(fā)酵液（F-0）、108 CFU/mL 菌體懸液（F-1）、無菌發(fā)酵上清液（F-2）3個處理，分別以無菌水、LB培養(yǎng)基處理為對照1（CK1）、對照2（CK2），選取長勢一致、健壯的秦美獼猴桃植株，采用葉面噴施接種法進行誘導(dǎo)抗性試驗，將菌液均勻噴在獼猴桃葉片上。

1.3 PAL、POD、PPO、SOD、CAT活性的測定

接種后0、4、8、12、16、20 d分別采樣，測定獼猴桃葉片PAL、POD 、PPO、SOD、CAT的活性。PAL提取及活性測定參照薛應(yīng)龍等的方法[9]進行，以1 g鮮質(zhì)量D290 nm值變化0.01所需酶量為1個酶活力單位（U）。POD提取及活性測定參照張龍翔等的方法[10]進行，以1 g鮮質(zhì)量1 min內(nèi)D470 nm值變化0.01作為1個酶活力單位（U）。PPO提取及活性測定參照朱廣廉等的方法[11]進行，以1 g鮮質(zhì)量1 min內(nèi)D525 nm值變化0.01為1個酶活力單位（U）。SOD提取及活性測定參照朱廣廉等的方法[11]進行，以抑制氮藍(lán)四唑（NBT）還原的50%酶量為1個酶活力單位，以不加酶液而用緩沖液代替酶液的處理為空白對照，酶活計算公式為：

N=2×（D560 nm空白-D560 nm處理）/D560 nm空白。

CAT提取及活性測定參照李合生的方法[12]進行，采用紫外吸收法，以1 g鮮質(zhì)量1 min內(nèi)D240 nm減少0.1的酶量為1個酶活單位（U）。

2 結(jié)果與分析

2.1 M4菌株對苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性的影響

由圖1可知，獼猴桃葉片接種發(fā)酵液不同組分，其PAL活性均高于對照無菌水（CK1）；菌株M4發(fā)酵液（F-0）接種后8 d，獼猴桃葉片內(nèi)PAL活性值達到最高峰，為 74.42 U/（g·h），比CK1提高53.0%；菌體懸液（F-1）接種后12 d，獼猴桃葉片內(nèi)PAL活性相對較高，為 72.65 U/（g·h），比CK1提高了51.7%，后緩慢下降；接種后20 d，接種M4發(fā)酵液、菌體懸液、上清液的獼猴桃葉片PAL活性仍高于CK1、CK2；接種后4～20 d，發(fā)酵液、菌體懸液處理的PAL活性總體高于上清液、無菌水、LB培養(yǎng)基；接種M4發(fā)酵液、菌體懸液處理的PAL活性變化趨勢相似，接種上清液、LB培養(yǎng)基處理的PAL活性及其變化趨勢相似。菌株M4發(fā)酵液和菌體懸液處理能明顯提高獼猴桃植株內(nèi)PAL活性。

2.2 M4菌株對過氧化物酶（POD）活性的影響

由圖2可知，與CK1相比，接種M4發(fā)酵液（F-0）、菌體懸液（F-1）、上清液（F-2）、LB培養(yǎng)基（CK2）的獼猴桃葉片，在接種后0～12 d內(nèi)能明顯提高葉片內(nèi)POD活性；菌體懸液處理的獼猴桃葉片POD活性在接種后8 d達到最大值，為27.02 U/（g·min），M4發(fā)酵液處理的獼猴桃葉片POD活性在接種后12 d達到峰值，為27.67 U/（g·min），后呈下降趨

勢；接種M4發(fā)酵液、菌體懸液、上清液后12 d，獼猴桃葉片POD活性分別比CK1提高62.4%、48.6%、19.7%；接種M4發(fā)酵液、菌體懸液后4～20 d，獼猴桃葉片POD活性總體高于上清液、無菌水、LB培養(yǎng)基，上清液和LB培養(yǎng)基處理的POD活性變化趨勢相似。菌株M4發(fā)酵液和菌體懸液處理能明顯提高獼猴桃植株內(nèi)POD活性。

2.3 M4菌株對多酚氧化酶（PPO）活性的影響

由圖3可知，接種M4發(fā)酵液（F-0）和菌體懸液（F-1）后0～8 d，獼猴桃葉片內(nèi)的PPO活性有明顯提高，并在接種后8 d達到最高峰，PPO活性分別為7.79、6.93 U/（g·min），比CK1分別提高90.9%、69.9%；接種后8～12 d，葉片內(nèi)的PPO活性開始下降，接種后12～20 d內(nèi)的獼猴桃葉片PPO活性變化差異不明顯；接種后4～20 d，M4發(fā)酵液、菌體懸液處理的PPO活性總體上高于清液、無菌水、LB培養(yǎng)基，上清液與LB培養(yǎng)基處理的PPO活性變化趨勢相似。M4發(fā)酵液和菌體懸液處理能明顯提高植株內(nèi)PPO活性。

2.4 M4菌株對超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響

由圖4可知，接種發(fā)酵液不同組分后4～8 d，獼猴桃葉片內(nèi)的SOD活性呈增加趨勢；接種發(fā)酵液（F-0）后8 d，獼猴桃葉片內(nèi)的SOD活性達最大值，為32.22 U/（g·min），比CK1提高86.1%；接種菌體懸液（F-1）后12 d，獼猴桃葉片內(nèi)的SOD活性達最大值，為 30.21 U/（g·min），比CK1提高 72.3%；接種后4～20 d，接種M4發(fā)酵液的葉片SOD活性高于其他處理，M4發(fā)酵液、菌體懸液處理的SOD活性總體高于上清液、無菌水、LB培養(yǎng)基。M4發(fā)酵液和菌體懸液處理能明顯提高植株內(nèi)SOD活性。

2.5 M4菌株過氧化氫酶（CAT）活性的影響

由圖5可知，接種發(fā)酵液不同組分后4～8 d，獼猴桃葉片內(nèi)的CAT活性呈增加趨勢，其中接種菌體懸液（F-1）的獼猴桃葉片CAT活性高于其他處理，且再接種后8 d CAT活性達最大值，為30.64 U/（g·min）；接種M4發(fā)酵液（F-0）后 12 d 獼猴桃葉片的CAT活性達最大值，為33.78 U/（g·min）， 比CK1提高176.7%；接種后4～20 d，M4發(fā)酵液、菌體懸液處理的CAT活性總體高于上清液、無菌水、LB培養(yǎng)基，菌體、上清液處理的CAT活性變化趨勢相似。M4發(fā)酵液和菌體懸液處理能明顯提高植株內(nèi)CAT活性。

3 結(jié)論與討論

研究枯草芽孢桿菌M4發(fā)酵液、菌體懸液、上清液、LB培養(yǎng)基處理后獼猴桃葉片內(nèi)的苯丙氨酸解氨酶（PAL）、過氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）的活性變化發(fā)現(xiàn)，與清水處理（CK1）相比，獼猴桃葉片內(nèi)這5種酶的活性有明顯提高，并在達到峰值后呈下降趨勢；PAL、PPO、SOD的活性峰值多在接種后8 d出現(xiàn)，POD、CAT的活性峰值多在接種后12 d出現(xiàn)。比較不同組分接種處理誘導(dǎo)產(chǎn)生的酶活性強弱發(fā)現(xiàn)，接種M4發(fā)酵液、菌體懸液的5種酶活性均明顯高于接種上清液、LB培養(yǎng)基，且酶活變化趨勢相似，說明M4發(fā)酵液中主要有效誘導(dǎo)組分為菌體。

植物病害生物防治機制包括抗生作用、溶菌作用、重寄生作用、競爭作用、交互保護作用及促生作用，誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性也被認(rèn)為是生防菌的一種重要防病機制。植物的誘導(dǎo)抗病包括木質(zhì)化、防御酶活性、病程相關(guān)蛋白、植保素等多種生理生化因子的合成。有大量研究表明，參與植物體內(nèi)多種防衛(wèi)反應(yīng)的PAL、PPO、POD等酶系與植物抗病性密切相關(guān)[13]，這些酶的活性與植株抗病性呈正相關(guān)，在植物的抗病反應(yīng)中起到非常重要的作用。獼猴桃植株接種M4發(fā)酵液和菌體懸液，防御酶活性升高，說明菌株M4誘導(dǎo)的系統(tǒng)抗性可使植株內(nèi)酶活性增強，這可能是其生物防治作用的機制之一。

枯草芽孢桿菌M4發(fā)酵液不僅具有抑菌作用，還可以通過誘導(dǎo)植物防御酶活性的提高，從而增強植株的抗病性，這些防御酶在拮抗獼猴桃潰瘍病菌的過程中可能激活了獼猴桃本身的抗病代謝過程，使獼猴桃植株體內(nèi)發(fā)生一系列的生理生化反應(yīng)，產(chǎn)生相關(guān)抗性物質(zhì)，誘導(dǎo)抗病效果明顯，但是，植株體內(nèi)產(chǎn)生何種抵抗物質(zhì)尚未明確，有待進一步研究。

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