輻射花粉授粉誘導(dǎo)西瓜單倍體

楊紅+顧妍+張朝陽(yáng)+孫玉東+羅德旭

摘要： 以Bonbon、嘉年華二號(hào)、先甜74、超玉4個(gè)西瓜品種為試驗(yàn)材料，采用輻射花粉授粉結(jié)合胚挽救技術(shù)，研究其對(duì)西瓜單倍體的誘導(dǎo)效果，結(jié)果表明，授粉11～12 d的西瓜果實(shí)相對(duì)較好，能得到較多的幼嫩種子；采用西瓜表面灼燒消毒再取種的方法簡(jiǎn)便易行，污染率極低。

關(guān)鍵詞： 單倍體；輻射花粉；胚挽救；授粉；誘導(dǎo)效果；西瓜

中圖分類號(hào)： S651.036 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）22-0159-03

γ射線是輻射花粉授粉誘導(dǎo)葫蘆科蔬菜作物單倍體的有效輻射源。近年來(lái)，通過(guò)輻射花粉誘導(dǎo)雌核發(fā)育獲得單倍體技術(shù)已應(yīng)用于育種中，并培育出黃瓜、西瓜、甜瓜等多種葫蘆科植物單倍體植株[1-3]。西瓜種子由雌花中的胚珠發(fā)育而來(lái)，一般普通種子是經(jīng)授粉后雙受精產(chǎn)生，而用輻射處理過(guò)的花粉進(jìn)行授粉無(wú)法完成雙受精過(guò)程而產(chǎn)生癟種，及時(shí)對(duì)其進(jìn)行胚挽救，可以更快得到單倍體。采用化學(xué)試劑處理可使雌花不經(jīng)授粉直接膨大，形成的種子就是單倍體。本試驗(yàn)采用輻射花粉授粉結(jié)合胚挽救技術(shù)，探討西瓜輻射花粉經(jīng)不同胚挽救處理對(duì)坐果和單倍體胚產(chǎn)生的影響，為西瓜單倍體材料的獲得奠定良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2012—2014年在江蘇徐淮地區(qū)淮陰農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所進(jìn)行，供試西瓜品種Bonbon、嘉年華二號(hào)、先甜74、超玉。Bonbon為日本引進(jìn)西瓜品種，超玉為江蘇徐淮地區(qū)淮陰農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所育成，這2個(gè)西瓜品種的種子略大；嘉年華二號(hào)和先甜74由先正達(dá)公司提供，均為小籽西瓜品種。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 γ射線輻照花粉授粉對(duì)西瓜種子形成的影響 用輻射處理過(guò)的花粉進(jìn)行授粉，標(biāo)明花粉輻射劑量及授粉時(shí)間；授粉后8～20 d，分別采集正常生長(zhǎng)的未成熟果實(shí)進(jìn)行胚挽救試驗(yàn)，調(diào)查種子發(fā)育情況，同時(shí)，嘗試用0.1%氯吡脲（重慶諾意）處理部分雌花，使其直接膨大，處理后8 d采集正常生長(zhǎng)的未成熟果實(shí)進(jìn)行胚挽救試驗(yàn)。胚挽救以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)添加2%蔗糖、2% D-甘露醇、7%瓊脂固化，pH值為 5.8；繼代培養(yǎng)以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)添加3%蔗糖、7%瓊脂固化，pH值為5.8。

1.2.2 不同消毒方式對(duì)西瓜幼胚的消毒效果 將未成熟西瓜果實(shí)中的種子取出，放入滅菌燒杯中，用0.1%氯化汞（HgCl2）溶液和不同濃度次氯酸鈉（NaClO）溶液分別浸泡 2～30 min（表1）；滅菌水沖洗5～6次，置于滅菌紙上吸干水分，接種于滅菌培養(yǎng)基上培養(yǎng)3～5 d，觀察是否污染以確定消毒效果。

將取回的西瓜果實(shí)用75%乙醇擦拭表面，放于鐵盤(pán)中，用少量的95%乙醇淋濕西瓜表面，用灼燒方法進(jìn)行滅菌；無(wú)菌手術(shù)刀切開(kāi)西瓜，將西瓜中的未成熟種子接種于滅菌培養(yǎng)基上培養(yǎng)3～5 d，觀察是否污染以確定消毒效果。

1.2.3 不同接種方法的接種效果 試驗(yàn)設(shè)4個(gè)處理：切去種子遠(yuǎn)胚端約1/3后，將近胚端朝下插入培養(yǎng)基；切去種子遠(yuǎn)胚端約1/3后，將胚平放于培養(yǎng)基上；種子近胚端朝下插入培養(yǎng)[HJ1.4mm]基；種子平放于培養(yǎng)基上。接種時(shí)種子為白色或淡黃色，待種子轉(zhuǎn)綠，轉(zhuǎn)接至普通MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)2～5周，種子鼓起、表皮變褐或子葉長(zhǎng)出時(shí)去除種皮，轉(zhuǎn)接至分化培養(yǎng)基上。

1.2.4 6-BA濃度對(duì)西瓜未成熟胚生長(zhǎng)的影響 將消毒西瓜種子接種于含有不同濃度6-BA的培養(yǎng)基上培養(yǎng)4 d，觀察并記錄種子轉(zhuǎn)綠過(guò)程及萌發(fā)狀態(tài)。

1.2.5 西瓜種子幼胚觀察及倍性鑒定 西瓜種子萌發(fā)前，對(duì) 種子幼胚進(jìn)行切片觀察；種子萌發(fā)至子葉展開(kāi)，切取頂芽，轉(zhuǎn)接入含有6-BA的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng)，每個(gè)品種擴(kuò)繁3～4瓶；取部分芽、葉，采用醋酸洋紅法進(jìn)行倍性鑒定。

1.2.6 不同西瓜品種胚挽救效果 調(diào)查不同西瓜品種的胚挽救效果，對(duì)胚已萌發(fā)但未成苗進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 γ射線輻照處理對(duì)西瓜種子形成的影響

分別用授粉后8～20 d的西瓜種子進(jìn)行胚挽救試驗(yàn)，結(jié)果表明，授粉后10 d內(nèi)的西瓜種子過(guò)于幼嫩，接種時(shí)損傷較大，而授粉超過(guò)15 d的西瓜種子未成熟胚基本死亡，發(fā)育趨于成熟的又都是二倍體種子；授粉11～12 d的西瓜種子相對(duì)較好，可得到較多的幼嫩種子用于胚挽救。經(jīng)氯吡脲處理的西瓜雌花，坐果率較低，但獲得的可用種子數(shù)較多，而氯吡脲的效果受溫度影響較大，試驗(yàn)效果不明顯。

2.2 不同消毒方式對(duì)西瓜幼胚的消毒效果

由表1可見(jiàn)，各濃度的次氯酸鈉溶液對(duì)西瓜幼胚的消毒效果不理想，污染率為21.1%～86.5%；隨消毒時(shí)間的延長(zhǎng)，氯化汞溶液對(duì)西瓜幼胚的消毒效果較次氯酸鈉有顯著提高，污染率顯著降低（P<0.05）；灼燒外皮的消毒方法也相對(duì)較好，污染率較低，為2.6%。

2.3 不同接種方法的接種效果

試驗(yàn)表明，由于培養(yǎng)基中加入瓊脂后具有一定的彈性，種子插入培養(yǎng)基后會(huì)慢慢滑出，成為平放于培養(yǎng)基的狀態(tài)；種子插入過(guò)深，則因組培瓶?jī)?nèi)水分較大，形成無(wú)氧狀態(tài)，種子迅速死亡。切去種子遠(yuǎn)胚端約1/3后接種，因組培瓶?jī)?nèi)水分較大，種子極易變黑死亡；將完整種子直接接種，在種子種皮變白或變褐、種子中間膨起或看到子葉時(shí)，將種子去除種皮進(jìn)行轉(zhuǎn)接，該方法接種效率相對(duì)較高，污染較少，但也會(huì)出現(xiàn)有部分種子因無(wú)法撐破種皮或種子內(nèi)水分較高而死亡。

2.4 6-BA濃度對(duì)西瓜未成熟胚生長(zhǎng)的影響

由表2可見(jiàn)，Bonbon、嘉年華二號(hào)、先甜74、超玉在6-BA濃度為5 μmol/L時(shí)的種子轉(zhuǎn)綠比例相對(duì)最高，分別為44.70%、43.48%、20.11%、60.28%；種子轉(zhuǎn)綠與萌發(fā)之間沒(méi)有明顯關(guān)系，大部分轉(zhuǎn)綠的種子并沒(méi)有萌發(fā)，萌發(fā)的種子大多從種皮已褐變的種子萌發(fā)而來(lái)；嘉年華二號(hào)在6-BA為 10 μmol/L 時(shí)種子萌發(fā)比例相對(duì)最高，為7.19%。endprint

2.5 西瓜種子幼胚觀察及幼苗倍性鑒定

對(duì)西瓜種子幼胚進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，西瓜種子幼胚存在不同形態(tài)，由于西瓜種子相對(duì)較小，種皮較硬，在剝種子的時(shí)候極易損傷幼胚，目前得到心形胚、球形胚、子葉形胚3種形態(tài)的西瓜種子幼胚（圖1）。普通二倍體西瓜的染色體為2n=22。由圖2可見(jiàn)，組培苗根尖組織細(xì)胞內(nèi)含有11條染色體，確定該組培苗材料為單倍體。

2.6 不同西瓜品種胚挽救效果及胚萌發(fā)但未成苗原因統(tǒng)計(jì)分析

由表3可見(jiàn)，嘉年華二號(hào)西瓜種子的萌發(fā)率及成苗率明顯高于其他品種，而B(niǎo)onbon西瓜品種的種子卻沒(méi)有1個(gè)萌發(fā)

成苗。由表4可見(jiàn)，萌發(fā)的胚沒(méi)有生長(zhǎng)點(diǎn)是其不能繼續(xù)生長(zhǎng)的主要原因，其異常常見(jiàn)為萌發(fā)后的胚異常膨大、表面布滿白色絨毛等；嘉年華二號(hào)未成苗原因相對(duì)最為復(fù)雜，除胚無(wú)生長(zhǎng)點(diǎn)外，還有擴(kuò)繁失敗及培養(yǎng)時(shí)玻璃化、褐化、污染、生長(zhǎng)異常等現(xiàn)象發(fā)生。

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，以輻射花粉授粉11～12 d的西瓜果實(shí)相

對(duì)較好，可得到較多的幼嫩種子，且西瓜果實(shí)須當(dāng)天采當(dāng)天用，否則無(wú)論是室溫還是低溫條件下儲(chǔ)存，都不能保證試驗(yàn)材料的鮮活。目前，已知成功獲得西瓜的單倍體植株是由花藥培養(yǎng)或胚珠培養(yǎng)[4-7]得來(lái)，其消毒方法均采用藥劑消毒。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，西瓜未成熟種子的胚較幼嫩，種皮很薄，用試劑消毒對(duì)西瓜未成熟種子損傷較大，且消毒不徹底；完好的西瓜幼瓜內(nèi)部近似于無(wú)菌狀態(tài)，采用75%乙醇浸泡并灼燒外皮法消毒并取種，其污染率極低。由于花粉輻射受環(huán)境限制較大，本試驗(yàn)嘗試用氯吡脲處理西瓜，使其不經(jīng)授粉直接膨大，其幼胚一旦萌發(fā)得到的便是單倍體，但采用氯吡脲處理西瓜雌花坐果率較低，接種數(shù)千粒種子僅得到幾個(gè)單倍體材料，加上其過(guò)于嬌嫩，未能獲得加倍材料。氯吡脲處理西瓜并進(jìn)行胚挽救，獲得西瓜單倍體的方法只需靜待其萌發(fā)，前期處理和接種工作量相對(duì)較大，但篩選工作量大大減少。

適用于葫蘆科作物的培養(yǎng)基配方多不適于西瓜，而在基礎(chǔ)MS培養(yǎng)基中適當(dāng)增加鹽酸硫胺素含量有助于西瓜的生長(zhǎng)。西瓜幼嫩種子在含有5～10 μmol/L 6-BA、添加2%蔗糖和2%甘露醇的MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)3～7 d，轉(zhuǎn)至無(wú)6-BA而添加2～3%蔗糖、1～2%甘露醇的MS培養(yǎng)基上繼續(xù)生長(zhǎng)（添加6-BA含量會(huì)影響種子生長(zhǎng)）而產(chǎn)生愈傷組織；待西瓜種子的子葉長(zhǎng)出可在含有1～10 μmol/L 6-BA、添加3%蔗糖的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖（6-BA 1 μmol/L和5 μmol/L交替使用可防止玻璃化苗的出現(xiàn)），在含有5 μmol/L IBA、添加3%蔗糖的1/2 MS培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)。吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）不適用于西瓜單倍體培養(yǎng)，而在培養(yǎng)基中加入0.1%～0.2%的活性炭可能夠促進(jìn)其生長(zhǎng)。

Ertan等對(duì)南瓜種子的幼胚進(jìn)行觀察，得出8種形態(tài)的南瓜種子幼胚，且認(rèn)為球形胚和心形胚能夠培養(yǎng)得到的是單倍體材料，子葉形胚培養(yǎng)得到的是二倍體材料，而其他形態(tài)的胚則無(wú)法正常發(fā)育[8]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，西瓜種子球形胚經(jīng)培養(yǎng)得到的是單倍體材料，子葉形胚得到的是二倍體材料，而其他形態(tài)的胚則沒(méi)有發(fā)育。

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