響應(yīng)曲面法優(yōu)化枸骨總皂苷的提取工藝及抗氧化活性

趙玲艷+張紅芳+陳崇蓮+陳曄

摘要： 為優(yōu)化枸骨總皂苷的提取工藝，研究枸骨總皂苷的抗氧化活性。用超聲-微波協(xié)同萃取法，以提取時(shí)間、提取功率、料液比為考察因素，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)曲面法（response surface methodology，簡稱RSM）Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化枸骨總皂苷的提取工藝；采用清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picryylhydrazyl，簡稱DPPH）自由基能力分析枸骨總皂苷的抗氧化活性。結(jié)果表明，采用超聲-微波協(xié)同萃取法，在提取時(shí)間180 s、提取功率 100 W、料液比1 g ∶ 30 mL、乙醇體積分?jǐn)?shù)80%的條件下，枸骨總皂苷的提取率為 3.739 3%；抗氧化試驗(yàn)結(jié)果表明，枸骨總皂苷濃度為62.24 μg/mL時(shí)，對DPPH自由基的清除率為 24.22%，表明響應(yīng)曲面法優(yōu)化了枸骨總皂苷的提取工藝，枸骨總皂苷具有一定的抗氧化活性。

關(guān)鍵詞： 枸骨總皂苷提取工藝；超聲-微波協(xié)同萃取法；響應(yīng)曲面法；抗氧化活性；DPPH自由基

中圖分類號： R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）22-0205-05

枸骨（Ilex cornuta）為冬青科冬青屬常綠植物，主要分布于長江流域、秦嶺山脈的局部及以南各地，是苦丁茶的主要植物來源之一 。枸骨葉中含有多種對人體有益的成分包括氨基酸、維生素、苦味素、脂多糖和多種微量元素[3]。其根、枝、葉和果實(shí)均可入藥，具有清火解毒、止渴生津的功效，主要的活性成分是三萜皂苷：枸骨葉含有冬青苷Ⅰ甲酯（ilexosideⅠ methy lester）、冬青苷Ⅱ（ilexoside Ⅱ）、苦丁茶苷等皂苷類化合物[4-6]。皂苷廣泛存在于植物體內(nèi)，具有廣泛的生物活性和功能，如抗菌消炎、抗腫瘤、抗病毒、抗生育、免疫調(diào)節(jié)、降血脂、保肝活性等作用[3，6-7]。

超聲-微波協(xié)同萃取是近年來發(fā)展的一門新技術(shù)，用于枸骨總皂苷的提取，不但操作簡便、副產(chǎn)物少，而且能縮短提取時(shí)間、增加提取率，還能降低操作費(fèi)用，符合環(huán)境保護(hù)的要求[8]。響應(yīng)曲面法（response surface methodology，簡稱RSM）可以采用二次回歸方程擬合多個(gè)因素與多個(gè)響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過回歸方程分析尋求最佳工藝參數(shù)。響應(yīng)曲面法具有周期短、回歸方程精度高、能研究多種因素間交互作用等優(yōu)點(diǎn)[8]。

關(guān)于枸骨葉皂苷提取的研究還很少[9-10]，本研究擬通過超聲-微波的提取方法和響應(yīng)曲面法確定枸骨葉中皂苷提取的最佳工藝條件，并對其抗氧化作用進(jìn)行探討，為進(jìn)一步開發(fā)利用枸骨葉提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：2016年7月于江西省九江市南湖公園采集枸骨葉片，烘干，粉碎，過60目篩，備用。

試劑：齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品（上海如吉生物科技公司）；維生素C對照品（BTH，德國進(jìn)口）；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picryylhydrazyl，簡稱DPPH，南京奧多福尼生物科技有限公司）；無水乙醇、正丁醇、過氧化氫（30%）、香草醛、冰醋酸、高氯酸，均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

超聲-微波協(xié)同萃取儀（CW-2000，新拓分析儀器科技有限公司）；電子天平（BSA124S，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；低速臺式大容量離心機(jī)（TDL-40B，上海安亭科學(xué)儀器廠）；可見分光光度計(jì)（721，天津普瑞斯儀器有限公司）；水浴鍋等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精確稱量齊墩果酸0.005 g，用無水乙醇溶解定容至10 mL；精準(zhǔn)移取濃度為0.5 mg/mL的齊墩果酸樣品0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液于6支10 mL的試管中，水浴蒸干后分別加入0.3 mL新配置的5%香草醛-冰醋酸溶液及1.0 mL高氯酸溶液，將它們置于 60 ℃ 水浴鍋中加熱20 min，取出后用流水冷卻至室溫后在試管中分別加入5.0 mL冰醋酸，搖勻。在560 nm波長處測吸光度[10-11]。以吸光度為縱坐標(biāo)、齊墩果酸濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程為y=0.262x+0.131 4（r2=0.998 6）。

1.3.2 枸骨葉皂苷提取流程 提取流程：枸骨葉烘干—粉碎—過60目篩—超聲-微波協(xié)同萃取儀提取枸骨中的皂苷（2次）—抽濾、合并提取液—水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)—加入正丁醇—水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)—加入過氧化氫—水浴加熱（99 ℃）—定容至10 mL得樣品溶液[12-15]。取樣品溶液0.2 mL，采用“1.3.1”節(jié)的方法測定吸光度，按上述回歸方程，計(jì)算總皂苷的含量。

提取率=m2/m1×100%。

式中：m2為提取到的枸骨總皂苷的質(zhì)量（g）；m1為枸骨葉粉末的質(zhì)量（g）。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

在開啟超聲波的條件下，以乙醇體積分?jǐn)?shù)80%為溶劑[9]、固定提取時(shí)間為240 s、提取功率為 180 W，分析料液比分別為1 ∶ 20、1 ∶ 30、1 ∶ 40、1 ∶ 50、1 ∶ 60（g ∶ mL）對枸骨總皂苷提取率的影響；固定提取時(shí)間為 240 s、料液比為 1 g ∶ 30 mL，考察微波功率分別為60、120、180、240、300 W對枸骨總皂苷提取率的影響；固定提取功率為120 W、料液比為 1 g ∶ 30 mL，考察提取時(shí)間分別為120、180、240、300、360 s對枸骨總皂苷提取率的影響。

1.3.4 響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù) Box-benhnken Design中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以提取時(shí)間、提取功率、料液比為自變量，以枸骨總皂苷提取率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3個(gè)因素3個(gè)水平的響應(yīng)曲面分析試驗(yàn)，建立枸骨總皂苷提取工藝條件的二次模型。因素水平見表1。endprint

1.3.5 抗氧化試驗(yàn)

本試驗(yàn)采用的方法是通過測定皂苷清除DPPH自由基的能力判斷枸骨總皂苷的抗氧化能力[12-20]。

溶液的制備：（1）DPPH溶液的制備：取0.002 0 g DPPH固體，用95%乙醇溶液溶解，定容至25 mL搖勻，現(xiàn)配現(xiàn)用；維生素C對照品（BTH）溶液的制備：取0.002 2 g BTH固體，用95%乙醇溶液溶解，定容至50 mL，現(xiàn)配現(xiàn)用。

枸骨總皂苷抗氧化性試驗(yàn)：吸取2 mL DPPH溶液于試管中，加入2 mL樣品溶液，搖勻，常溫下避光反應(yīng)45 min，在517 nm波長處測定其吸光度，記為樣品吸光度DA1；取樣品溶液2 mL，加入80%乙醇溶液，搖勻，常溫下避光反應(yīng)45 min，測其吸光度；記為干擾吸光度DA2；取2 mL 80%乙醇溶液，再加入2 mL DPPH溶液，搖勻，常溫下避光反應(yīng)45 min，測定其吸光度，記為對照吸光度DA0。樣品設(shè)有6組濃度梯度，每組3個(gè)平行。清除率=1-（DA1-DA2）/DA0×100%。

維生素C標(biāo)準(zhǔn)品對照試驗(yàn)：分別吸取BTH溶液2.5、33、5.0、6.6、8.3、9.1、10.0 mL用95%乙醇溶液定容至 25.0 mL，搖勻。分別取2.0 mL于具塞試管中，加入2.0 mL DPPH溶液，搖勻，避光反應(yīng)45 min，測其吸光度，記為樣品吸光度DB1；取稀釋液各2.0 mL于具塞試管中，分別加入 2.0 mL DPPH溶液，搖勻，避光反應(yīng)45 min，測其吸光度，記為干擾吸光度DB2；取 2.0 mL 95%乙醇溶液，再加入2.0 mL DPPH溶液，搖勻，常溫下避光反應(yīng)45 min，測定其吸光度，記為對照吸光度DB0。清除率=1-（DB1-DB2）/DB0×100%。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理 采用Origin 8.0軟件作圖，Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 料液比對枸骨總皂苷提取率的影響

在微波功率 180 W、提取時(shí)間240 s的條件下，分析不同料液比對枸骨總皂苷提取率的影響。如圖1所示，當(dāng)料液比小于1 g ∶ 30 mL時(shí)，隨著料液比的增加，枸骨總皂苷含量呈上升趨勢。提取劑的增加，更有利于枸骨總皂苷的溶出，這是因?yàn)槿軇┖驮祥g的濃度差越大，其提取效率就越高，目標(biāo)物質(zhì)就越容易溶出，當(dāng)料液比超過1 g ∶ 30 mL時(shí)，枸骨總皂苷含量有下降的趨勢，可能是由于溶劑過大，超聲波協(xié)同微波的能量在相同時(shí)間提供的熱量被提取劑吸收的比例增加以及空化效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)等效應(yīng)的強(qiáng)度減弱等影響了提取效率。因此選擇液料比 1 g ∶ 30 mL于后面的試驗(yàn)繼續(xù)考察。

2.1.2 微波功率對枸骨總皂苷提取率的影響

由圖2可知，在微波功率為120 W之前，枸骨總皂苷提取率呈上升趨勢，隨后就開始下降?？赡苡捎陔S著微波功率的增加，物質(zhì)的加熱程度也隨之增加，使枸骨總皂苷更容易被提取出來，即皂苷提取效率增加。在微波功率達(dá)到120 W之后，枸骨總皂苷提取率有減少趨勢，這可能是由于高微波功率導(dǎo)致的熱效應(yīng)使枸骨總皂苷分解。因此，120 W為最佳微波功率。

2.1.3 超聲-微波協(xié)同提取時(shí)間對枸骨總皂苷提取率的影響

由圖3可知，在超聲-微波協(xié)同提取時(shí)間為180 s之前，枸骨總皂苷不能充分地轉(zhuǎn)移到溶液中，隨著提取時(shí)間的延長，枸骨總皂苷的提取率增加，在180 s時(shí)達(dá)到峰值，提取時(shí)間繼續(xù)延長，枸骨總皂苷提取率明顯下降，這可能是因?yàn)殡S著微波時(shí)間的延長，溫度急劇升高，導(dǎo)致皂苷分解。因此，180 s為最佳提取時(shí)間。

2.2 響應(yīng)曲面法分析枸骨總皂苷的提取工藝

2.2.1 響應(yīng)曲面法分析枸骨總皂苷的提取工藝試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以提取時(shí)間、微波功率和液料比為自變量，按表1中的因素、水平，利用Design-Expert 8.0.6軟件，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)響應(yīng)曲面試驗(yàn)方案。如表2所示，共17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中12個(gè)為析因點(diǎn)，5個(gè)為零點(diǎn)，析因點(diǎn)為自變量取值在A、B、C所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)；零點(diǎn)為區(qū)域的中心點(diǎn)，其中零點(diǎn)試驗(yàn)重復(fù)5次，用以估算試驗(yàn)誤差。

2.2.2 響應(yīng)曲面法分析枸骨總皂苷提取工藝模型的建立及顯著性檢驗(yàn)

利用Design Expert 8.0.6軟件通過逐步回歸對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到枸骨總皂苷提取率對提取 時(shí)間、提取功率、料液比的回歸方程為

Y（%）=3.67-0038A- 0.42B+0.19C+0.006A×B-0.24A×C+0.12B×C-113A2-0.59B2-0.71C2。

對模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。由表3可知，該模型具有高度顯著性（P<0.01），失擬項(xiàng)不顯著（P=0.73），R2adj=0.912 6，R2=0.938 7，信噪比為11.910，遠(yuǎn)大于4，可知回歸方程擬合度和可信度均較高，說明這種試驗(yàn)方法是準(zhǔn)確可靠的，使用該方程模擬真實(shí)的3個(gè)因素3個(gè)水平的分析是可行的。在所選的各因素水平范圍內(nèi)，對結(jié)果的影響排序?yàn)槲⒉ㄌ幚砉β?液料比>提取時(shí)間。模型的復(fù)相關(guān)系數(shù)R2為93.87%，大于90%，說明模型擬合程度良好，試驗(yàn)誤差小，該模型是合適的。因此可以用該模型方程來分析和預(yù)測不同提取條件下枸骨總皂苷提取率的變化。由表3的P值可知，方程中B、A2、B2、C2對枸骨總皂苷提取率Y值的影響極顯著，表明試驗(yàn)因素對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系，二次項(xiàng)對響應(yīng)值也有很大的影響，交互項(xiàng)作用的影響較小。這與模擬回歸中線性和二次項(xiàng)影響顯著相對應(yīng)。

2.2.3 枸骨總皂苷提取工藝的響應(yīng)曲面分析與優(yōu)化

根據(jù)二次模型得到的等高線及響應(yīng)曲面可以評價(jià)試驗(yàn)因素之間的endprint

交互作用強(qiáng)度，確定各因素的最佳水平范圍。從圖4至圖9中的響應(yīng)曲面最高點(diǎn)及其等高線可知，在所選范圍內(nèi)存在極值，即響應(yīng)曲面最高點(diǎn)，同時(shí)也是等高線最小橢圓的中心點(diǎn)。

由圖4、圖5可知，當(dāng)料液比為1 g ∶ 30 mL時(shí)，在提取時(shí)間 120～180 s的范圍內(nèi)皂苷提取率先迅速增加，在180 s之后皂苷提取率有下降的趨勢。在微波處理功率60～120 W范圍內(nèi)，皂苷提取率不斷增加，之后隨著提取時(shí)間的延長，皂苷提取率有下降的趨勢。隨著提取時(shí)間和微波功率的增加，皂苷提取率先迅速增加，達(dá)到最高點(diǎn)之后略有下降的趨勢。

從圖6、圖7可以看出，當(dāng)微波處理功率為120 W時(shí)，隨時(shí)間的延長、液料比的增大，皂苷提取率逐漸升高，達(dá)到最高點(diǎn)之后有下降的趨勢。

由圖8、圖9可知，當(dāng)提取時(shí)間為180 s時(shí)，在料液比 1 g ∶ （20～30） mL范圍內(nèi)，皂苷提取率不斷增加，之后隨著微波功率的增大，皂苷提取率有下降趨勢。微波處理功率在60～120 W范圍內(nèi)，提取率不斷增加，之后隨著液料比的增大，皂苷提取率有下降趨勢。

從圖4至圖9中的響應(yīng)曲面及其等高線可以看出，等高線呈橢圓，說明提取時(shí)間和微波功率、微波功率和液料比、料液比和提取時(shí)間之間交互影響明顯，響應(yīng)曲面陡峭說明枸骨總皂苷提取率受提取時(shí)間、微波功率和料液比的變化敏感，也表明各因素對枸骨總皂苷的影響不是簡單的線性關(guān)系。

通過軟件分析，得到皂苷提取的最佳條件為提取時(shí)間179.96 s，微波處理功率98.84 W，料液比1 ∶ 30（g ∶ mL），在此條件下皂苷提取率的理論值為3.7429%。為檢驗(yàn)響應(yīng)曲面法所得結(jié)果的可靠性，采用上述優(yōu)化提取條件進(jìn)行皂苷提取率提取，考慮到實(shí)際操作的便利，將提取工藝參數(shù)修正為提取時(shí)間180 s、微波處理功率100 W、料液比1 ∶ 30（g ∶ mL），5次平行試驗(yàn)皂苷提取率分別為3.731 2%、3.740 8%、3.741 3%、3.744 1%、3.739 2%，平均皂苷提取率為 3.739 3%，數(shù)據(jù)重現(xiàn)性良好，偏差不大，吸光度測量值穩(wěn)定，說明每次測定的皂苷含量穩(wěn)定，證明該結(jié)果是合理可靠的。

2.3 抗氧化活性試驗(yàn)

由圖10可知，枸骨總皂苷在10～65 μg/mL濃度范圍內(nèi)，隨著枸骨總皂苷濃度的升高，對DPPH清除率增強(qiáng)，當(dāng)枸骨總皂苷濃度為65 μg/mL時(shí)清除率達(dá)最大值，為25%；之后隨著枸[CM（25]骨總皂苷濃度的升高，對DPPH清除效果有下降趨勢。從

圖11可知，維生素C在低濃度的條件下即可對DPPH表現(xiàn)出很強(qiáng)的清除能力，當(dāng)維生素C濃度超過16 μg/mL時(shí)隨濃度的升高清除率下降。

總之，枸骨總皂苷具有較強(qiáng)的抗氧化能力，但它對DPPH的清除效果要小于維生素C的作用效果，這可能是因?yàn)槭褂描酃强傇碥沾痔嵛镞M(jìn)行抗氧化試驗(yàn)，含有較多的其他化合物，從而影響了其對DPPH的清除效果。

3 結(jié)論與討論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)曲面法對枸骨總皂苷超聲-微波協(xié)同提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化研究，選擇超聲-微波協(xié)同提取時(shí)間、微波功率以及料液比為自變量，總皂苷提取率為響應(yīng)值，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)方法，研究各自變量及其交互作用對總皂苷提取率的影響。利用Design Expert軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到二次多項(xiàng)式回歸方程的預(yù)測模型。結(jié)[CM（25]果表明， 枸骨總皂苷超聲-微波協(xié)同提取的優(yōu)化工藝條件

為超聲-微波協(xié)同提取時(shí)間180 s、微波功率100 W、料液比 1 ∶ 30（g ∶ mL）。在此工藝條件下枸骨總皂苷理論提取率為3.742 9%，實(shí)測提取率為3.739 3%。張風(fēng)禮等利用浸提法，通過乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取溫度、提取時(shí)間等單因素和正交試驗(yàn)法優(yōu)化枸骨葉總皂苷的提取工藝，結(jié)果以80%乙醇水溶液為溶劑，料液比1 g ∶ 10 mL，65 ℃浸提取1.5 h時(shí)總皂苷提取率高提取率達(dá)4.51%[10]。雖然利用該工藝提取枸骨葉總皂苷提取率達(dá)4.51%，但該工藝提取時(shí)間長，耗能較高，而本試驗(yàn)利用超聲-微波協(xié)同提取枸骨葉總皂苷的方法具有操作簡便、提取時(shí)間短、耗能較少等特點(diǎn)。

枸骨葉是苦丁茶的主要源植物之一，作為日常保健飲品，具有減肥、強(qiáng)身健體的功效，近年來多數(shù)學(xué)者對枸骨葉藥理學(xué)進(jìn)行了研究[3，6]。結(jié)果表明，枸骨葉具有抗心肌缺血、降血脂、抗菌、免疫、抑制抗生育和抗氧化等廣泛的藥理作用[20-27]。曠春桃等在新鮮肥肉熬制的豬油中分別添加自制的0.02%枸骨葉多酚類提取物，來檢測枸骨葉多酚類提取物的抗氧化能力，結(jié)果表明枸骨葉多酚類提取物能有效抑制豬油的氧化，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性[19]。本試驗(yàn)通過對DPPH的清除力來檢測不同濃度的枸骨總皂苷體外抗氧化活性，結(jié)果顯示枸骨總皂苷濃度為62.24 μg/mL時(shí)，對DPPH自由基的清除率為24.22%，進(jìn)一步說明枸骨葉有較強(qiáng)的抗氧化能力。

參考文獻(xiàn)：

[1] 國家藥典委員會(huì). 中華人民共和國藥典：一部[S]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010：233.

[2]謝宗萬. 全國中草藥匯編（上冊）[M]. 2版.北京：人民衛(wèi)生出版社，1996：602.

[3]李國文，吳 弢，謝 燕，等. 中藥枸骨葉研究進(jìn)展[J]. 國際藥學(xué)研究雜志，2011，38（5）：356-361.

[4]張 潔，喻 蓉，吳 霞，等. 枸骨葉的化學(xué)成分研究[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2008，20（5）：821-823.

[5]Tsutomu N，Hiroko T，Masao N，et al. Tow triterpeniod glycosides from leaves of Ilex cornuta[J]. Phytochemistry，1982，21（6）：1373-1377.endprint

[6]彭國全，楊冬梅. 枸骨的藥物功效與保健作用[J]. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2011，23（6）：79-82.

[7]Qin W J，Wu X E，Zhao J J，et al. Triterpenoid glycosides from leaves of Ilex cornuta[J]. Phytochemistry，1986，25（4）：913-916.

[8]潘青友，童群義. 響應(yīng)曲面法優(yōu)化超聲-微波協(xié)同提取百合殘?jiān)锌傇碥展に嚨难芯縖J]. 食品工業(yè)科技，2012，33（16）：273-276.

[9]周國莉，舒 柯，聶驪曉，等. 不同產(chǎn)地中藥材枸骨葉中總皂苷的含量測定[J]. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，30（7）：33-35.

[10] 張風(fēng)禮，曾超珍，劉志祥. 枸骨葉總皂苷的提取工藝的研究[J]. 中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，30（9）：194-197.

[11]吳劍峰，王 寧. 天然藥物化學(xué)[M]. 2版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2013：164-177.

[12]沈雅婕，張榕文，黃凱偉，等. 響應(yīng)曲面法優(yōu)化墨旱蓮三萜總皂苷提取工藝研究[J]. 環(huán)球中醫(yī)藥，2014，7（5）：341-345.

[13]杜靜婷，陳 超，范三紅. 響應(yīng)面法優(yōu)化藜麥糠皂苷的提取及抗氧化活性[J]. 山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（7）：932-937.

[14]孫冀平，裘愛泳，胡學(xué)煙. 茶皂素的脫色研究[J]. 中國油脂，2003，28（4）：42-45.

[15]梁翠霞，吳麗霞. 三七皂苷加壓提取工藝優(yōu)化與抗氧化活性研究[J]. 中國醫(yī)學(xué)工程，2015，23（6）：203-204.

[16]令狐晨，阿依吐倫·斯馬義. 皂苷提取純化及其抗氧化活性的研究進(jìn)展[J]. 廣州化工，2015，43（6）：7-9，22.

[17]王 晶，劉春明，白鶴龍，等. 中藥中皂苷類化合物的抗氧化活性評價(jià)研究[J]. 時(shí)珍國醫(yī)醫(yī)藥，2010，21（6）：1485-1487.

[18]張猛猛，田冰潔，洪秀云. 純化的絞股藍(lán)皂苷的抗氧化活性研究[J]. 生物技術(shù)，2013，23（1）：76-78.[HJ1.75mm]

[19]曠春桃，陳如鋒，吳 斌，等. 枸骨葉中多酚類物質(zhì)的提取及抗氧化性能分析[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，48（2）：427-429.

[20]周 萍，廖慶文. 大孔樹脂富集枸骨葉中總皂苷的研究[J]. 湖南中醫(yī)雜志，2002，18（1）：51.

[21]李維林，吳菊蘭，任冰如，等. 枸骨中3種化合物的心血管藥理作用[J]. 植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào)，2003，12（3）：6-10.

[22]林 晨，譚玉波，張 晶，等. 枸骨葉不同溶媒萃取物對小鼠體外T淋巴細(xì)胞活化增殖的影響[J]. 暨南大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2006，27（2）：199-203.

[23]邢瑩瑩，岑穎洲，王一飛，等. 瑤藥枸骨葉不同溶劑組分體外抑菌活性比較[J]. 暨南大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2004，25（1）：119-121.

[24]程 林. 枸骨冬青秋季光合生理特性研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（12）：221-223.

[25]張 晶，林 晨，岑穎洲，等. 枸骨葉抗真菌作用初探[J]. 中國病理生理雜志，2003，19（11）：1562.

[26]魏成武，楊翠芝，任華能，等. 枸骨抗生育作用[J]. 中藥通報(bào)，1988，13（5）：48-50.

[27]李路軍，杜 鵬，孫珂煥，等. 華中枸骨葉的化學(xué)成分及其腫瘤細(xì)胞毒作用[J]. 中國中藥雜志，2013，38（3）：354-357.endprint