苗智+馬養(yǎng)民+孔陽+閆夢茹+王健

摘要： 為進(jìn)一步開發(fā)和利用夾竹桃的內(nèi)生真菌，對1株分離自夾竹桃莖部鏈格孢屬內(nèi)生真菌的代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究。利用硅膠柱色譜、Sephadex LH-20柱色譜等方法對該菌株的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行分離，再經(jīng)過重結(jié)晶純化，得到5個(gè)生物堿類化合物。對所得化合物的理化性質(zhì)和 1H-NMR、13C-NMR數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，確定這5個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)。采用最小抑菌濃度法和DPPH自由基法對所得化合物進(jìn)行抑菌活性和抗氧化活性測試。結(jié)果表明，這5個(gè)化合物分別為次黃嘌呤（1）、腺嘌呤（2）、尿囊素（3）、胸腺嘧啶脫氧核苷（4）、尿嘧啶核苷（5）。其中，化合物1、3、4、5 為首次從鏈格孢屬真菌的發(fā)酵物中分離得到?；衔?（尿囊素）具有一定的抑菌活性和抗氧化活性，化合物2（腺嘌呤）具有一定的抗氧化活性。夾竹桃鏈格孢屬內(nèi)生真菌具有一定的開發(fā)和利用價(jià)值。

關(guān)鍵詞： 夾竹桃；鏈格孢屬；內(nèi)生真菌；重結(jié)晶；生物堿類；抑菌活性；抗氧化活性

中圖分類號： S182 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）22-0314-03

生物堿類化合物是指生物體內(nèi)一類除了氨基酸、肽類、蛋白質(zhì)和維生素B以外含氮原子的有機(jī)化合物的總稱[1]。自19世紀(jì)初期出現(xiàn)關(guān)于生物堿的報(bào)道，至今已有200多年的歷史?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)1萬多種生物堿類化合物，它們具有抗菌[2-3]、抗氧化[4]、抗腫瘤[5-6]等生物活性。內(nèi)生真菌是指全部階段或一定階段生活在健康植物組織內(nèi)，對植物組織沒有造成明顯病害的真菌[7]，它們能夠產(chǎn)生生物堿類、黃酮類、萜類、甾體類、醌類、苯丙素類、肽類等多種類別的次生代謝產(chǎn)物，具有多種多樣的生物活性[8]，在醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)等行業(yè)中具有重大的應(yīng)用價(jià)值。因此，研究植物內(nèi)生真菌的活性成分具有十分重要的意義。夾竹桃（Nerium indicum）是夾竹桃科夾竹桃屬植物[9]，是強(qiáng)心類中藥，主要有強(qiáng)心利尿、鎮(zhèn)痛、祛痰定喘、祛瘀等功效[10]。 目前，國內(nèi)外對夾竹桃的研究多集中于其植株的化學(xué)成分，對其內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物的報(bào)道甚少。筆者所在課題組從夾竹桃植物中分離得到35株內(nèi)生真菌，并對1株分離自莖部的內(nèi)生真菌J14菌株進(jìn)行研究，從其發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到8個(gè)化合物，其中含有3個(gè)生物堿類化合物，分別為胸腺嘧啶、尿嘧啶、黃嘌呤[11]。因此，本試驗(yàn)繼續(xù)對該菌株的生物堿類代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究，以豐富國內(nèi)外對夾竹桃內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物的研究，為進(jìn)一步開發(fā)和利用夾竹桃內(nèi)生真菌奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株

內(nèi)生真菌J14菌株，分離自秦嶺地區(qū)夾竹桃的莖部，經(jīng)鑒定為鏈格孢屬真菌，4 ℃條件下保存于筆者所在實(shí)驗(yàn)室。

1.2 試驗(yàn)儀器和試劑

SW-CJ-1FD 超凈工作臺，購自上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；YX280B 手提式壓力蒸汽滅菌鍋，購自上海三申醫(yī)療器械有限公司；DH5000B 電熱恒溫培養(yǎng)箱，購自天津市泰斯特儀器有限公司；HZQ-Q 全溫?cái)?shù)顯振蕩器，購自江蘇省金壇市瑞華儀器廠；BS224S 電子天平，購自賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；RE52CS-1 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，購自上海亞榮生化儀器廠；Bruker avance Ⅲ-400 Hz 超導(dǎo)核磁共振儀，購自布魯克（北京）科技有限公司；XT-5 顯微熔點(diǎn)測定儀，購自北京市科儀電光儀器廠；柱色譜硅膠200 ～ 300目，購自青島海洋化工廠分廠；柱色譜凝膠Sephadex LH-20，購自上海浩然生物技術(shù)有限公司；薄層色譜硅膠G，購自青島海浪硅膠干燥劑廠；試驗(yàn)所用化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基：20 g葡萄糖、1 000 mL 20%馬鈴薯浸汁，pH值自然；牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基：10 g蛋白胨、5 g牛肉膏、5 g NaCl、1 000 mL H2O，pH值自然；大米培養(yǎng)基：75 g大米+無糖察氏液體培養(yǎng)基（0.3 g NaNO3、0.1 g K2HPO4、0.05 g KCl、0.05 g MgSO4·7H2O、0.001 g FeSO4、1 00 mL H2O，pH值自然）。

1.4 測試菌

細(xì)菌：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、乳酸鏈球菌（Streptococcus lactis）、大腸桿菌（Escherichia coli）、綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）；植物病原菌真菌：小麥赤霉病病菌（Fusarium graminearum）、番茄灰霉病病菌（Botrytis cinerea）、煙草赤星病病菌（Alternaria alternata）、白菜黑斑病病菌（Alternaria brassicae）、辣椒疫霉病病菌（Phytophthora capsic）、蘋果樹腐爛病病菌（Valsa mali）、葡萄炭疽病病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、芍藥炭疽病病菌（Peony anthracnose）、玉米大斑病病菌（Setosphaeria turcica）、油菜菌核病病菌（Sclerotinia sclerotiorum）；均保存于 4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 菌株發(fā)酵和代謝產(chǎn)物的提取分離

試驗(yàn)菌株經(jīng)過活化后，采用大米培養(yǎng)基進(jìn)行固體發(fā)酵，于28 ℃靜置培養(yǎng)30 d。將發(fā)酵物陰干粉碎后分別用乙酸乙酯、甲醇溶液提取，提取液經(jīng)減壓濃縮后得到460 g浸膏。采用硅膠柱色譜對浸膏進(jìn)行分離，以石油醚、乙酸乙酯、甲醇為溶劑進(jìn)行梯度洗脫，得到4個(gè)組分。組分2（96.93 g）經(jīng)過多次硅膠柱色譜、Sephadex LH-20柱色譜分離，再經(jīng)過重結(jié)晶純化，依次得到30 mg化合物1、63 mg化合物2。組分3（133.83 g）經(jīng)過多次硅膠柱色譜、Sephadex LH-20柱色譜分離，再經(jīng)過重結(jié)晶純化，依次得到53 mg化合物3、136 mg化合物4、161 mg化合物5。endprint

1.6 代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定

對所得化合物的形狀、顏色等理化性質(zhì)進(jìn)行觀察，并測量其熔點(diǎn)，再采用核磁共振（1H-NMR、13C-NMR等）對所得化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，最后與相關(guān)參考文獻(xiàn)進(jìn)行對照，確定所得化合物的結(jié)構(gòu)。

1.7 抑菌活性測試

對所得化合物進(jìn)行抑菌活性測試，它們對微生物生長的抑制作用可通過最小抑菌濃度來判斷，具體操作[12]如下：（1）將斜面培養(yǎng)基上已活化的測試菌用無菌水沖洗下來，再用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基（細(xì)菌）、馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（真菌）將其配制成濃度為106 CFU/mL的菌懸液；（2）用二甲基亞砜將待測化合物溶解，使其濃度為 1 mg/mL；（3）在96孔板的第1孔至第12孔中均加入100 μL液體培養(yǎng)基，再向第1孔中加入100 μL待測化合物溶液，利用二倍稀釋法連續(xù)稀釋至第10孔，第11、第12孔分別留作液體培養(yǎng)基和二甲基亞砜的空白對照；（4）向上述96孔板中的每個(gè)孔中均加入 100 μL 測試菌菌懸液。重復(fù)上述試驗(yàn)操作，每組進(jìn)行3次平行試驗(yàn)。以青霉素鈉作為革蘭氏陽性菌的陽性對照，硫酸鏈霉素作為革蘭氏陰性菌的陽性對照，多菌靈作為植物病原真菌的陽性對照。將細(xì)菌試驗(yàn)組的96孔板在37 ℃下恒溫培養(yǎng)24 h、植物病原真菌試驗(yàn)組的96孔板在28 ℃下恒溫培養(yǎng) 48 h 后觀察并記錄試驗(yàn)結(jié)果。

1.8 抗氧化活性測試

對所得化合物進(jìn)行清除DPPH自由基的抗氧化活性測試，具體操作[13]如下：（1）將待測化合物溶解于甲醇溶液中，使其濃度為2 mg/mL；（2）在酶標(biāo)板的第1、第2排的每個(gè)孔中均加入100 μL甲醇溶液，再向每排的第1孔中均加入 100 μL 待測化合物溶液，利用二倍稀釋法連續(xù)稀釋至第11孔，第12孔留作甲醇的空白對照；（3）向第1排的每個(gè)孔中均加入100 μL新配制的含0.2 mg/mL DPPH·的甲醇溶液，向第2排的每個(gè)孔中均加入100 μL甲醇。選用維生素C作為陽性對照，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)。將上述酶標(biāo)板于室溫下遮光放置30 min后，在波長為517 nm的酶標(biāo)儀中測定每個(gè)孔的吸光度。

抗氧化性能可以根據(jù)待測化合物對DPPH自由基的清除率來判斷，其計(jì)算公式如下：

式中：E為DPPH自由基清除率；D0為DPPH·溶液和甲醇溶液（第1排第12孔）的吸光度；D1為待測化合物溶液、DPPH·溶液和甲醇溶液（第1排前11個(gè)孔）的吸光度；D2為待測化合物溶液和甲醇溶液（第2排前11個(gè)孔）的吸光度。

根據(jù)公式（1）計(jì)算出不同濃度下化合物的自由基清除率。以化合物濃度為橫坐標(biāo)（x），自由基清除率為縱坐標(biāo)（y），繪制自由基清除率曲線圖，并對其進(jìn)行線性擬合。按照擬合方程計(jì)算出當(dāng)y=50時(shí)x的值，此時(shí)x的值就是化合物的半抑制濃度IC50。

2 結(jié)果與分析

2.1 代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定

從試驗(yàn)菌株的發(fā)酵物中分離得到5個(gè)生物堿類化合物，分別為次黃嘌呤（1）、腺嘌呤（2）、尿囊素（3）、胸腺嘧啶脫氧核苷（4）、尿嘧啶核苷（5），其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示。

化合物1，米黃色粉末，熔點(diǎn)> 350 ℃。1H-NMR（400 MHz，氘代二甲亞砜）δ：13.36[單峰（s），1H，7-H]，12.25（s，1H，1-H），8.13（s，1H，2-H），7.99（s，1H，8-H）。13C-NMR（100 MHz，氘代二甲亞砜）δ：155.34（6-C），153.15（4-C），144.65（2-C），140.16（8-C），119.07（5-C）?；衔?1 的核磁共振試驗(yàn)數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報(bào)道的數(shù)據(jù)基本一致，因此確定化合物1為次黃嘌呤（hypoxanthine）。

化合物2，米黃色粉末，熔點(diǎn)> 350 ℃。1H-NMR（400 MHz，氘代二甲亞砜）δ：12.84（s，1H，7-H），8.11（s，1H，2-H），8.10（s，1H，8-H），7.09（s，1H，6-NH2）。13C-NMR（100 MHz，氘代二甲亞砜）δ：155.14（6-C），152.39（2-C），150.91（4-C），139.53（8-C），117.35（5-C）?；衔?2 的核磁共振試驗(yàn)數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報(bào)道的數(shù)據(jù)基本一致，因此確定化合物2為腺嘌呤（adenine）。

化合物3，淡黃色粉末，熔點(diǎn)239～240 ℃。1H-NMR（400 MHz，氘代二甲亞砜）δ：10.55（s，1H，1-H），8.07（s，1H，3-H），6.90[d，耦合常數(shù)（J） = 8.2 Hz，1H，6-H]，581（s，2H，8-H），5.25[雙二重峰（dd），J=8.2，1.0 Hz，1H，4-H]。13C-NMR（100 MHz，氘代二甲亞砜）δ：173.57（5-C），15730（7-C），156.72（2-C），62.36（4-C）?；衔?3 的核磁共振試驗(yàn)數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]報(bào)道的數(shù)據(jù)基本一致，因此確定化合物3為尿囊素（allantoin）。

化合物4，白色粉末，熔點(diǎn)為185 ～ 187 ℃。 1H-NMR（400 MHz，氘代二甲亞砜）δ：11.28（s，1H，3-H），7.71[雙峰（d），J=1.0 Hz，1H，6-H]，6.17[三重峰（t），J=6.9 Hz，1H，1′-H]，5.26（d），J=4.1 Hz，1H，3′-OH），5.06（t，J=5.1 Hz，1H，5′-OH），4.25[多重峰（m），1H，3′-H]，3.76（dd，J=6.6，3.6 Hz，1H，4′-H），3.57（m，2H，5′-H），2.07（m，2H，2′-H），1.77（s，3H，5-CH3）。13C-NMR（100 MHz，氘代二甲亞砜）δ：163.72（4-C），150.43（2-C），136.10（6-C），109.32（5-C），8721（1′-C），83.69（4′-C），7039（3′-C），61.28（5′-C），39.36（2′-C），12.22（5-CH3）?；衔?4 的核磁共振試驗(yàn)數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]報(bào)道的數(shù)據(jù)基本一致，因此確定化合物4為胸腺嘧啶脫氧核苷（thymidine）。endprint

化合物5，白色粉末，熔點(diǎn)為164 ～ 165 ℃。1H-NMR（400 MHz，氘代二甲亞砜）δ：11.32（s，1H，3-H），7.89（d，J=8.1 Hz，1H，6-H），5.78（d，J=5.4 Hz，1H，1′-H），565（d，J=8.2 Hz，1H，5-H），5.40（d，J=4.6 Hz，1H，2′-OH），5.12（s，2H，3′，5′-OH），4.02（d，J=4.5 Hz，1H，2′-H），397（d，J=4.6 Hz，1H，3′-H），3.84（dd，J=6.7，3.2 Hz，1H，4′-H），3.59（m，2H，5′-H）。13C-NMR（100 MHz，氘代二甲亞砜）δ：163.10（4-C），150.72（2-C），140.70（6-C），101.71（5-C），87.62（1′-C），84.79（4′-C），73.50（3′-C），69.84（2′-C），60.80（5′-C）?；衔?5 的核磁共振試驗(yàn)數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]報(bào)道的數(shù)據(jù)基本一致，因此確定化合物5為尿嘧啶核苷（uridine）。

2.2 抑菌活性的測試結(jié)果

以4株細(xì)菌和10株植物病原真菌作為測試菌，分別選用青霉素鈉、硫酸鏈霉素、多菌靈作為陽性對照，對所得化合物進(jìn)行抑菌活性測試。由表1可知，化合物 3（尿囊素）對這4株細(xì)菌和10株植物病原真菌均有一定的抑制作用；化合物 1（次黃嘌呤）、化合物 2（腺嘌呤）分別對辣椒疫霉病病菌、煙草赤星病病菌具有一定的選擇性抑制作用。

2.3 抗氧化活性測試結(jié)果

對所得化合物進(jìn)行清除DPPH自由基的抗氧化活性測試，其擬合方程和IC50值如表2所示，與對照維生素C的測試結(jié)果相比，化合物1～化合物5均沒有較強(qiáng)的抗 氧化活性，但化合物 2（腺嘌呤）和化合物 3（尿囊素）具有一定的抗氧化活性。

3 結(jié)論與展望

對1株分離自夾竹桃莖部的鏈格孢屬內(nèi)生真菌的代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究，從中分離得到5個(gè)生物堿類化合物，分別為次黃嘌呤（1）、腺嘌呤（2）、尿囊素（3）、胸腺嘧啶脫氧核苷（4）、尿嘧啶核苷（5）。其中，化合物1、3、4、5 為首次從鏈格孢屬真菌的發(fā)酵物中分離得到?；衔?（尿囊素）具有一定的抑菌活性和抗氧化活性，化合物2（腺嘌呤）具有一定的抗氧化活性。因此，該菌株具有一定的開發(fā)利用價(jià)值。因此，可以對分離自夾竹桃植物中的其他內(nèi)生真菌的代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究，以豐富國內(nèi)外對夾竹桃內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物的研究報(bào)道，從而進(jìn)一步開發(fā)和利用夾竹桃內(nèi)生真菌。

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