靳艷玲 劉國彥 莫善列 葉 蘭 張宇海

摘? ?要：目的? 研究蠣昆一號制劑對5-氟尿嘧啶（5-Fu）致小鼠骨髓抑制外周血中白細胞、血小板、淋巴細胞、單核細胞計數(shù)的影響。方法? 純系雄性BALB/c種小鼠60只，隨機分為對照組、5-Fu、5-Fu聯(lián)用重組人粒細胞集落刺激因子（rhG-CSF）、蠣昆一號制劑低、中、高劑量6個組。經(jīng)腹腔注射腫瘤化療藥5-Fu建立小鼠骨髓抑制模型，對照組注射等量生理鹽水;注射后第1天上午使用不同劑量的蠣昆一號制劑灌胃，對照組等量生理鹽水灌胃;給藥7 d后上午取眼球血進行血常規(guī)分析。結(jié)果? 小鼠在注射5-Fu造模后，外周血白細胞、血小板、淋巴細胞與對照組相比均有明顯降低（P<0.05），單核細胞比率與對照組相比明顯升高（P<0.05）;不同劑量的蠣昆一號制劑及陽性對照（rhG-CSF）均有效地升高小鼠外周血白細胞、血小板、淋巴細胞數(shù)值，且單核細胞比率也較模型組明顯降低，但以蠣昆一號制劑中劑量組的效果最為明顯，復方制劑高劑量組次之。結(jié)論? 蠣昆一號制劑能夠明顯改善5-Fu化療藥物所引起的小鼠骨髓抑制現(xiàn)象，增加骨髓抑制小鼠外周血白細胞、血小板、淋巴細胞數(shù)目;降低外周血中單核細胞比率，表明蠣昆一號制劑能夠有效的恢復骨髓抑制小鼠造血系統(tǒng)，提高造血活性。

關鍵詞：蠣昆一號制劑;5-氟尿嘧啶;骨髓抑制;血常規(guī)

中圖分類號：R285.5? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.21.015

文章編號：1006-1959（2018）21-0051-05

Efficacy of Marine Chinese Medicine Likun No.1 Preparation on Animal Bone Marrow Suppression Induced by 5-Fu Chemotherapy

JIN Yan-ling1，LIU Guo-yan2，MO Shan-lie3，YE Lan4，ZHANG Yu-hai5

（1.School of Basic Medical Sciences，Guizhou Medical University，Guiyang 550025，Guizhou，China;

2.School of Pharmacy，Xiamen University/Zhongshan Hospital，Xiamen University，Xiamen 361101， Fujian，China;

3.Institute of Pharmacy，Xiamen University-Huayin Science and Technology Cancer Prevention and Rehabilitation Center，Xiamen 361101，F(xiàn)ujian，China，;

4.College of Basic Medicine，Guizhou Medical University，Guiyang 550025，Guizhou，China;

5.Zhongshan Hospital，Xiamen University，Xiamen 361101，F(xiàn)ujian，China）

Abstract： Objective? To study the effects of Likun No. 1 preparation on the counts of leukocytes， platelets， lymphocytes and monocytes in peripheral blood of mice induced by 5-fluorouracil （5-Fu）. Methods? 60 male BALB/c mice were randomly divided into control group， 5-Fu， 5-Fu combined with recombinant human granulocyte colony-stimulating factor （rhG-CSF），Likun No. 1 preparation has 6 groups of low， medium and high doses. The mouse bone marrow suppression model was established by intraperitoneal injection of the tumor chemotherapeutic drug 5-Fu. The control group was injected with the same amount of normal saline. On the first day after the injection， different doses of the Likun No. 1 preparation were administered by the stomach， and the control group was given the same amount of normal saline. After 7 d of administration， eyeballs were taken for routine blood analysis. Results? After injection of 5-Fu， the peripheral blood leukocytes， platelets and lymphocytes were significantly lower than the control group （P<0.05）， and the monocyte ratio was significantly higher than that of the control group （P<0.05）. Different doses of Likun No. 1 preparation and positive control （rhG-CSF） effectively increased the peripheral blood leukocyte， platelet and lymphocyte values in mice， and the monocyte ratio was also significantly lower than that of the model group. The effect of the medium dose group of Likun No.1 preparation was the most obvious， followed by the high dose group of the compound preparation. Conclusion? Likun No.1 preparation can significantly improve the bone marrow suppression induced by 5-Fu chemotherapy drugs， increase the number of peripheral blood leukocytes， platelets and lymphocytes in mice， and decrease the percentage of monocytes in peripheral blood. Likun No. 1 preparation can effectively restore the hematopoietic system of myelosuppressive mice and increase hematopoietic activity.

Key words：Li kun No.1 preparation;5-fluorouracil;Bone marrow suppression;Blood routine

化學治療是治療惡性腫瘤的主要方法之一，在化療過程中產(chǎn)生的不良反應越來越受到關注，尤其是骨髓抑制[1]。主要表現(xiàn)為外周血白細胞的減少，繼而出現(xiàn)血小板減少，骨髓增生降低，嚴重時可造成感染、出血等現(xiàn)象，甚至導致死亡。我國傳統(tǒng)中醫(yī)藥學并沒有“骨髓抑制”這一病名，后代醫(yī)家根據(jù)骨髓抑制患者的各種臨床表現(xiàn)，多將其歸入“虛勞”“血癥”的范疇[2]。圍繞惡性腫瘤發(fā)病機制，從中醫(yī)理論方面來說，腎為先天之本，腎虛則正氣不足;脾主運化，是為后天之本，脾虛則水谷精微運化受阻，易生痰濕，故臨床多以補腎健脾的方法進行治療。蠣昆一號制劑是根據(jù)大量臨床經(jīng)驗而來，主要由昆布、黃芪、女貞子、茯苓等中草藥組成。方中昆布、能軟堅散結(jié)，黃芪益氣扶正以助祛邪消腫、健脾，茯苓清利濕毒，諸藥合用，共奏軟堅散結(jié)，養(yǎng)血活血，清熱利濕，益氣健脾之功。本文通過觀察5-Fu對小鼠骨髓抑制外周血變化，探討蠣昆一號制劑對5-Fu造模小鼠骨髓抑制骨髓造血功能的影響，闡述其減弱小鼠骨髓抑制的作用，同時為臨床應用此類中藥復方制劑對腫瘤治療中骨髓抑制的影響提供科學的實驗數(shù)據(jù)依據(jù)。

1材料與方法

1.1實驗動物? 選用SPF級健康雄性BALB/c種小鼠60只，鼠齡6～8周，體重18～22 g，由廈門大學實驗動物中心提供[實驗動物生產(chǎn)許可證號 SCXK（滬）2017-0005]，且動物實驗員在動物中心培訓后即可獲得動物實驗相關資質(zhì)，動物適應性喂養(yǎng)1周后開始實驗。用Excel軟件對小鼠進行隨機分組編號。按動物飼養(yǎng)環(huán)境：廈門大學動物實驗中心，室內(nèi)潔凈，通風良好，環(huán)境溫度20～26℃。動物飼料：混合顆粒鼠飼料，購自廈門大學實驗動物中心。

1.2藥物? 蠣昆制劑由昆布、牡蠣、黃芪、女貞子、茯苓等中藥組成（已申請專利）。蠣昆一號制劑，為蠣昆復方制劑的一號制劑，簡稱蠣昆一號制劑，由昆布多糖、黃芪、女貞子、茯苓等中草藥組成。制法：提取昆布多糖，粉粹成粉末，備用;將黃芪、女貞子、茯苓等加水煎煮2次，每次1 h。合并煎液，噴霧干燥得到細粉，備用。將上述細粉按一定比例攪勻混勻后，即得。昆布、黃芪、茯苓、女貞子：購自安徽健成醫(yī)藥有限公司。5-氟尿嘧啶：購自天津金耀藥業(yè)有限公司;批準文號：國藥準字H12020959;產(chǎn)品規(guī)格：10 ml、0.25g。重組人粒細胞刺激因子（recombinant human granulocyte colony-stimulating factor，rhG-CSF）：陽性對照藥物，購自廈門特寶生物工程股份有限公司，產(chǎn)品批號：201710B16;國藥準字：S19990042;產(chǎn)品規(guī)格：300 μg。

1.3試劑? 0.9%氯化鈉注射液：購自廣東科倫藥業(yè)股份有限公司，批準文號：國藥準字H20045198;產(chǎn)品批號：H17111701;規(guī)格：500 ml。PBS 緩沖液：購自上海源培生物科技股份有限公司;規(guī)格：500 ml。乙醇、NaCO3、D-葡萄糖、苯酚、硫酸、均為國產(chǎn)分析純，購自西隴科學股份有限公司。

1.4主要儀器? 離心機：購自湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司;全自動血球分析儀BC-2300 型：購自上海恒盛醫(yī)療器械有限公司;渦旋混合器：購自江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠;烘箱：購自上海-恒科學儀器有限公司;水浴鍋：購自北京科偉永興儀器有限公司;紫外分光光度計UV-1600：購自上海美普達儀器有限公司;膜分離設備：購自成都和誠過濾技術有限公司。

1.5藥物制備

1.5.1昆布多糖的提取? 取昆布，粉粹，過100目篩，于密封袋中備用。稱取一定量的昆布粉末，加10倍90%無水乙醇水浴2 h，濾渣按1：40加2% Na2CO3于55 ℃水浴消化2 h，離心濾液過1萬分子量分離膜，得濃液加3倍乙醇醇析，離心得沉淀物烘干即得昆布粗多糖。

1.5.2昆布多糖得率計算? 烘干后的粗多糖樣品稱重。粗多糖得率計算公式：多糖得率（%）=烘干昆布多糖（g）/昆布粉末（g）×100%。

1.5.3多糖含量測定? 本實驗采用苯酚-硫酸法[3]測定昆布多糖的含量。其原理是多糖在濃硫酸的作用下，先水解成單糖，并迅速脫水生成糖醛衍生物，與苯酚反應生成橙黃色溶液，在490 mm處有特征吸收，與標準系列峰比較，進而對多糖定量。

1.5.4多糖標準曲線繪制? 100 mg/L標準葡萄糖溶液：稱取0.100 g葡萄糖于100 ml燒杯中，加水溶解，定容于1000 ml，置4 ℃冰箱中貯存。 分別吸取0 ml、0.2 ml、0.4 ml、0.6 ml、0.8 ml、1.0 ml的標準葡萄糖置于2 0ml具塞試管中，用蒸餾水補至1.0 ml。向試液中加入1.0 ml苯酚溶液，然后快速加入5.0 ml硫酸（與液面垂直加入，勿接觸試管壁，以便與反應液充分混合），靜置10 min。使用渦旋振蕩器使反應液充分混勻，然后將試管放置于30 ℃水浴中反應20 min，490 nm測吸光度。以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，制定標準曲線。

1.5.5樣品多糖含量測定? 取干燥至恒重的昆布粗多糖，溶于蒸餾水，作適當稀釋后配成待測溶液。取1 ml多糖樣品待測溶液于試管中，加入5%苯酚1 ml，濃硫酸5 ml，使用渦旋振蕩器使反應液充分混合，然后將試管放置于30 ℃水浴中反應20 min，490 nm測吸光度。依據(jù)多糖標準曲線計算待測樣品多糖含量[4]。

1.5.6黃芪、女貞子、茯苓混合物提取? 黃芪、女貞子、茯苓粉碎成粗粉。第1次先加適量水提取（煮沸后保持沸騰1 h），過濾，收集濾液;濾渣再加入8倍水提?。ㄖ蠓泻蟊３址序v0.5 h），過濾得濾液。合并濾液，單效蒸發(fā)弄成至適量濃縮液，濃縮液噴霧干燥得粉末。

1.6動物模型建立及分組給藥? 參照文獻[5，6]對小鼠進行骨髓抑制模型造模。將 BALB/c 純系雄性小鼠隨機分為6組，即對照組、5-Fu組、5-Fu聯(lián)用rhG-CSF組、蠣昆一號制劑組低、中、高3個劑量，每組各10只;模型組小鼠腹腔注射5-Fu 0.25 g/kg（對照組腹腔注射等量生理鹽水），造模24 h（第1天）后開始給藥，連續(xù)給藥 7 d。按中藥藥理學研究方法[7]計算小鼠蠣昆一號制劑的等效劑量為 0.2002 g/（kg·d），并以此將蠣昆一號制劑分為低劑量組、中劑量組、高劑量組，灌胃劑量分別為0.133g/（kg·d），0.2002g/（kg·d），0.3003 g/（kg·d），體積為 20 ml/kg;對照組和5-Fu組灌胃等量生理鹽水;參照文獻[8]陽性對照組每只小鼠腹腔注射重組人粒細胞集落刺激因子（rhG-GSF）0.00025 g/kg/d，體積為10 ml/（kg·d）。

1.7外周血細胞計數(shù)? 各組小鼠最后一次給藥24 h后（第7天）取眼球血。左手拇指、食指和中指抓取小鼠的頸部頭皮，小指和無名指固定尾巴。輕壓需要摘取的眼部皮膚，使眼球充血突出，使用手術剪剪去小鼠的胡須，防止血從胡須處留下引起溶血，用鑷子夾取眼球并快速摘取，并使血液從眼眶內(nèi)流入EP管中?；靹蚝螅萌詣友毎治鰞x檢測外周血白細胞、血小板、淋巴細胞及單核細胞含量。

1.8統(tǒng)計學分析? 采用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。計量資料采用（x±s）表示，各組數(shù)據(jù)進行方差齊性檢驗，組間比較采用單因素方差（One-Way ANVA）分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義，P<0.01表示統(tǒng)計學意義顯著，P<0.001表示統(tǒng)計學意義極顯著。

2結(jié)果

2.1昆布多糖含量測定結(jié)果? 以0 mg/ml、0.003 mg/ml、0.006 mg/ml、0.009 mg/ml、0.011 mg/ml、0.014 mg/ml葡萄糖標準溶液的濃度為橫坐標，490 nm下測定得到標準液濃度的吸光度值為縱坐標，繪制多糖標準曲線如圖1所示，求得標準曲線方程為：y=61.93x+0.114（R2=0.9954），式中y為490 nm下吸光度值，x為葡萄糖標準品濃度。用苯酚-硫酸法測定昆布多糖樣品在490 nm吸光值，代入標準曲線方程計算，求得昆布多糖含量為37.32%，昆布粗多糖提取率為11.99%。隨后與黃芪、女貞子、茯苓等制成蠣昆一號制劑，以探究蠣昆一號制劑對骨髓抑制的影響。

2.2 5-Fu小鼠骨髓抑制模型? 外周血分析結(jié)果顯示，小鼠在注射5-Fu造模后，白細胞、淋巴細胞、血小板與對照組相比均有降低（P<0.05），單核細胞比率（MO%）升高（P<0.05），造模成功，見表1。

2.3蠣昆一號制劑對骨髓抑制小鼠外周血象的影響

2.3.1對骨髓抑制小鼠外周血白細胞的影響? 與5-Fu組相比，蠣昆一號制劑及rhG-CSF組外周血白細胞均升高（P<0.05）。以制劑中劑量效果更顯著（P<0.01）。表明蠣昆一號制劑可促進外周血白細胞含量的升高，見圖2。

2.3.2對骨髓抑制小鼠外周血淋巴細胞的影響? 與5-Fu組相比，蠣昆一號制劑及rhG-CSF組外周血淋巴細胞均升高（P<0.05）。中、高劑量組間無差異，如圖3。

2.3.3對骨髓抑制小鼠外周血血小板的影響? 與5-Fu對照組相比，低劑量組及rhG-CSF組并未有明顯地增加血小板效果，研究表明rhG-CSF主要作用為促進白細胞增生藥，不具有促進血小板生成的作用。其中，蠣昆一號制劑中、高劑量血小板均升高（P<0.01），見圖4。

2.3.4對骨髓抑制小鼠外周血單核細胞比率的影響? 與5-Fu對照組相比，蠣昆一號制劑及rhG-CSF組外周血淋巴細胞比率均降低（P<0.05），并以制劑中、高劑量效果更為顯著（P<0.01），見圖5。

3討論

骨髓抑制是多數(shù)化療藥的常見毒性反應，大多數(shù)化療藥均可引起有不同程度的骨髓抑制，使外周血中血細胞數(shù)量減少。血細胞由多種成分組成，每一種成分都對人體起著不可缺少的作用，任何一種成分的減少都使機體產(chǎn)生相應的副反應。外周血血細胞減少是骨髓抑制的主要癥狀，外周血中的血細胞可間接顯示骨髓的造血功能。我國傳統(tǒng)醫(yī)學認為，腎為先天之本、五臟之根，腎主骨生髓，腎的精氣充養(yǎng)骨骼，生髓;脾為后天之本、氣血生化之源。惡性腫瘤發(fā)病與臟腑功能失調(diào)、病邪瘀毒在體表或體內(nèi)蘊結(jié)有關?；熕幬镌诳鼓[瘤、祛邪毒治療過程中，損傷臟腑功能，脾腎愈虛，氣血生化無源，致氣血不足、腎精虧虛[10]。在中醫(yī)辯證論治、整體觀念為原則的理論基礎下，結(jié)合臨床及基礎研究進展，昆布、丹參、黃芪、茯苓等在中藥食療制劑配伍在中醫(yī)理論上是可行的。昆布味酸、咸，能軟堅散結(jié)、消痰、利水;丹參味苦、微寒，有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩、涼血消癰的功能;黃芪味甘、微溫，其功能是補氣升陽、固表止汗、利水消腫、生津養(yǎng)血、行滯通痹;茯苓味甘、性淡，具有解毒、除濕、通利關節(jié)的功能。從它們的性味歸經(jīng)看，含昆布、丹參、黃芪、茯苓的配伍是“相須”和“相使”作用，是具有相互促進作用，是增強療效而使用的配伍方法。本文蠣昆一號制劑復方中以這幾味藥聯(lián)合使用，以藥物歸經(jīng)結(jié)合藥物性味、功能作為指導，使組方選藥更有針對性;使其相互協(xié)同，提高療效，或使其相互抑制，降低不良作用，更好地發(fā)揮藥物的效能。

我們根據(jù)蠣昆一號制劑生血的功能，驗證能否改善腫瘤患者貧血的癥狀。通過本實驗研究可以得出結(jié)論，以5-Fu為對照，對小鼠給藥以低、中、高劑量的蠣昆一號制劑后，骨髓抑制小鼠的外周血淋巴細胞、血小板均有明顯升高，表明蠣昆一號制劑可促進骨髓造血功能的恢復，綜合表現(xiàn)為以蠣昆一號制劑的中高劑量較為明顯的促進骨髓造血功能的恢復，5-Fu化療藥物能夠顯著降低外周血白細胞數(shù)、升高單核細胞比率，表明 5-Fu對機體細胞免疫和非特異性免疫均有抑制作用。蠣昆一號制劑聯(lián)合治療組白細胞數(shù)增多、單核細胞比率降低，單核細胞比率=單核細胞數(shù)/白細胞數(shù)，由此可見單核細胞比率與白細胞數(shù)密切相關，單核細胞還參與免疫反應，在吞噬抗原后將所攜帶的抗原決定簇轉(zhuǎn)交給淋巴細胞，誘導淋巴細胞的特異性免疫性反應。表明蠣昆一號制劑可提高機體特異性和非特異性免疫功能[11]。由此可見，蠣昆一號制劑對小鼠骨髓抑制治療效果良好。

我國海洋醫(yī)藥具有堅實的資源基礎，海洋生物遺傳資源多樣性豐富，海洋中藥發(fā)展前景越來越廣闊。我們將以此研究為基礎，借助經(jīng)典中醫(yī)藥典籍的臨床療效和實踐經(jīng)驗，進一步探索昆布等海洋中藥的醫(yī)用價值，以期開發(fā)出良效的海洋中藥口服復方產(chǎn)品，幫助改善腫瘤術后病人的生活質(zhì)量，延長生存期，具有一定的的臨床應用價值。

參考文獻：

[1]Brenet F，Kermani P，Spektor R，et al.TGF-β restores hematopoietic homeostasis after? myelosuppressive chemotherapy[J].J Exp Med，2013，210（3）：623-639.

[2]楊佩穎，李想，賈英杰.補益類中藥治療化療后骨髓抑制的實驗機制研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2014，25（6）：1456-1458.

[3]中國實驗動物學會.實驗動物環(huán)境及設施：GB 14925-2001[S].北京：中國標準出版社，2002：26.

[4]中華人民共和國衛(wèi)生部.SN/T 4206-2015 出口植物源食品中粗多糖的測定[S].北京：中國出版社，2015.

[5]張文清，左萍萍，徐辰，等.海帶中巖藻多糖的分離純化與結(jié)構(gòu)分析[J].食品科學，2012，33（1）：68-71.

[6]Kopp HG，Avecilla ST，Hooper AT，et al.Tie2 activation contributes to hemangiogenic regeneration after myelosuppression[J].Blood，2005，106（2）：505-513.

[7]盧俊欽，孫文立，毛文偉.骨髓抑制-再生小鼠模型的建立及組織學改變的動態(tài)觀察[J].上海交通大學學報（醫(yī)學版），2010，30（7）：758-762.

[8]陳奇.中藥藥理研究方法學[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2011.

[9]沈倍奮，楊子義，許錦良，等.重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子的研究[J].中華醫(yī)學雜志，1996，76（9）：654-657.

[10]賈英杰，于健春，楊佩穎，等.中醫(yī)藥防治化療致骨髓抑制的臨床研究概況[J].遼寧中醫(yī)雜志，2014，41（10）：2253-2255.

[11]栗敏，馬洪宇，沈繼朵，等.復方阿膠漿對H22肝癌荷瘤小鼠5-FU化療的增效減毒作用[J].中國實驗方劑學雜志，2012，18（20）：216-219.