cAMP 反應(yīng)元件結(jié)合蛋白( cAMP response element binding protein， CREB)是一種存在于真核生物細(xì)胞核內(nèi)蛋白， CREB 與真核生物 cAMP 反應(yīng)元件結(jié)合，啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄，又稱之為轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)因子。 CREB 功能表現(xiàn)在生命活動(dòng)的各個(gè)方面，如調(diào)節(jié)細(xì)胞周期， 影響胎兒 T 細(xì)胞的發(fā)育，影響肝臟代謝、影響神經(jīng)元細(xì)胞的存活和再生等。在培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元中，利用 siRNA 及基因敲除等技術(shù)證明，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子通過(guò) MSK-1 激活 CREB 促進(jìn)神經(jīng)元的存活。研究表明 CREB 對(duì)心腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用[1]。視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的小鼠視網(wǎng)膜中神經(jīng)元的丟失主要集中在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層(retinal ganglion cells,RGC)。我們觀察了視網(wǎng)膜缺血1 h再灌注后，中長(zhǎng)期( 7、 14、21 d)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情況。 CREB 在腦組織缺血再灌注的研究結(jié)果顯示對(duì)神經(jīng)元具有保護(hù)作用，因此，我們檢測(cè)了 CREB 在該模型中的表達(dá)改變，研究其與視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞之間的關(guān)系。

資料與方法

一、材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：取健康清潔的 8 周齡 C57/BL6J 小鼠 90 只，雌雄兼有(我院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)。所有動(dòng)物均在我院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心的 SPF 環(huán)境下飼養(yǎng)。所有動(dòng)物的飼養(yǎng)與處死均按照美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院( National Institutes of Health， NIH )的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理及使用指南》進(jìn)行。

主要試劑與抗體：Trizol Invitrogen， 15596-018)；顯影定影試劑 谷歌生物；Actin santa cruz；BCA 蛋白定量檢測(cè)試劑盒 Bio-rad；cDNA 第一鏈合成試劑盒， Fermentas #K1622；SYBR Green/Flourescein qPCR Master Mix(2X)： Fermentas ， #K0242；Ex TaqTM TAKARA， DRR100A；DL2000 DNA Marker TAKARA， D502A；引物合成 金斯瑞；CREB CST， #9197。

二、方法

1.視網(wǎng)膜缺血再灌注模型的建立用前房加壓灌注方法，將 200 ml 生理鹽水輸液袋懸于距大鼠眼球 1.36 m 高處。麻醉后，在顯微鏡下用 32G×6 mm 胰島素針頭穿刺入前房，此時(shí)眼壓 相當(dāng)于 100 mmHg(136 cm H20=100 mmHg， 1 kPa=7.5 mmHg ， 100 mmHg=13.3 kPa)，觀察若出現(xiàn)瞳孔逐漸散大，虹膜、視網(wǎng)膜缺血，角膜逐漸水腫呈霧狀，則視網(wǎng)膜缺血再灌注模型構(gòu)建成功。灌注持續(xù) 1 h。造模過(guò)程中頻點(diǎn)可樂(lè)必妥滴眼液，灌注后實(shí)驗(yàn)眼涂眼膏。

2.實(shí)驗(yàn)分組隨機(jī)將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為正常對(duì)照組( CON)、視網(wǎng)膜缺血再灌注模型組(RIR)。兩組均在造模后 7、 14、 21 d取材。每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn) 30 只眼球。實(shí)驗(yàn)采用雙眼造模。

3.全視網(wǎng)膜鋪片免疫熒光每組每時(shí)間點(diǎn)取小鼠4只眼球，行頸椎脫臼法處死小鼠，取出眼球。去除眼前節(jié)、晶狀體和玻璃體的視杯在新鮮配制的4%多聚甲醛中固定1 h，4個(gè)鐘點(diǎn)位做松解切口，去除鞏膜，玻璃體面朝上行視網(wǎng)膜鋪片，在封閉液BSAT中進(jìn)行室溫孵育2 h，封閉液用PBS配制，含5%牛血清白蛋白(BSA)、6%的驢血清和0.2%的TritonX-100。用封閉液按1:200稀釋山羊來(lái)源的Brn3a抗體，及小鼠來(lái)源的GFAP抗體。4 ℃孵育48 h，用PBST洗滌5次，每次5 min，用Cy3標(biāo)記的驢抗山羊IgG(1:80稀釋)和FITC標(biāo)記的驢抗小鼠IgG(1:80稀釋)室溫孵育4 min，用p-phenylenediamine封片，進(jìn)行拍照。

4.免疫組化剪除眼前節(jié)和玻璃體，將視杯放在用磷酸鹽緩沖液(PBS)新鮮配制的4%多聚甲醛(PA)中固定30 min，梯度脫水：10%和20%的蔗糖溶液中4 ℃各放置2 h，30%溶液中4 ℃過(guò)夜，蔗糖溶液用PB緩沖液配制。標(biāo)本在30%溶液沉降到底說(shuō)明脫水完成。用OCT膠包埋后放置-80 ℃冰箱速凍，垂直視網(wǎng)膜面以12 μm厚度行冰凍視網(wǎng)膜切片。選取經(jīng)過(guò)視神經(jīng)的視網(wǎng)膜冰凍切片，PBST洗去OCT膠；在封閉液中孵育2 h后，用封閉液以1:200稀釋山羊源的Brn3a抗體，及1:400小鼠來(lái)源的GFAP，濕盒中4 ℃冰箱過(guò)夜；用PBST洗滌3次，每次10 min。用Cy3標(biāo)記的驢抗山羊IgG(1:80稀釋)和FITC標(biāo)記的驢抗小鼠IgG(1:80稀釋)溫避光孵育2 h，用PBST洗滌3次，每次10 min。用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染核15 min，用PBST洗滌3次，每次10 min；用p-phenylenedia-mine封片。進(jìn)行拍照。

5.Western blot 法檢測(cè)視網(wǎng)膜組織中 CREB 的表達(dá)具體步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，用酶標(biāo)儀測(cè)定 595nm 的光吸收 OD 值。

6.Real-Time PCR 法檢測(cè)視網(wǎng)膜組織 CREB 的 mRNA 表達(dá)每組每時(shí)間點(diǎn)取小鼠眼球8只，于冰上操作并取出視網(wǎng)膜。存放于用DEPC水處理過(guò)的EP管中，放置-80 ℃冰箱保存。realtimePCR引物設(shè)計(jì)：MusCreb217bp；MusCrebFTCAGCCGGGTACTACCATTC；MusCrebRCTCTCTCTTCCGTGCTGCTT；PCR反應(yīng)體系:b-240F(10uM)0.5 μl；b-240R(10uM)0.5 μl；dNTP(2.5mM)2 μl；ExTaq0.25 μl；10×ExTaqEbuffer2.5 μl;cDNA1補(bǔ)充ddH2O至25 μl；反應(yīng)條件：94 ℃4 min；94 ℃30 s，54 ℃30 s，72 ℃25 s；30cycles，72 ℃4 min，4 ℃4 min。本實(shí)驗(yàn)采用2(-ΔΔct)相對(duì)定量法計(jì)算擴(kuò)增倍數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

7.視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞計(jì)數(shù)：將視網(wǎng)膜分為4個(gè)象限，每個(gè)象限以視乳頭為中心分3等份，每象限處在3等份中選取3個(gè)部位進(jìn)行神經(jīng)節(jié)細(xì)胞計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)倍率為200×倍，并用熒光顯微鏡進(jìn)行照相，算得總數(shù)除以視網(wǎng)膜總面積，為單位面積內(nèi)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的數(shù)目。

8.視網(wǎng)膜內(nèi)核層、外核層、總核層測(cè)量：用 Photoshop CS 對(duì)視網(wǎng)膜切片核層進(jìn)行測(cè)量，每張切片選取3個(gè)位置取平均值，如 RIR 模型 7 d內(nèi)核層的測(cè)量，選取 4 只眼球共 8 張切片。每張切片3個(gè)部位。共 24 個(gè)數(shù)據(jù)取平均值。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用 SPSS16.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，正常對(duì)照組與視網(wǎng)膜缺血再灌注組神經(jīng)節(jié)計(jì)數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05 作為差異有無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、RIR 損傷對(duì)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層的影響

如圖1所示，用 Brn3a對(duì)視網(wǎng)膜切片及鋪片染色，觀察對(duì)照組及造模后神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量在不同時(shí)間點(diǎn)的改變。由鋪片可見(jiàn)，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞在造模前后數(shù)量有明顯丟失。如表1所示，計(jì)算各個(gè)象限內(nèi)相同面積的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的個(gè)數(shù)，結(jié)果示統(tǒng)計(jì)對(duì)照組與造模組有顯著性差異(P<0.05)。

表1 造模前后視網(wǎng)膜鋪片神經(jīng)節(jié)細(xì)胞計(jì)數(shù)

圖1 RIR 模型導(dǎo)致神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷(×200)

二、RIR 模型損傷致視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生

在對(duì)照組中， GFAP 的熒光信號(hào)主要分布在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層(圖 2)，屬于正常GFAP 表達(dá)。而造模后，可見(jiàn) GFAP 熒光明顯增強(qiáng)，熒光信號(hào)分布于大部分視網(wǎng)膜視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增殖，在視網(wǎng)膜內(nèi)側(cè)呈柵欄狀排列。于 14 d時(shí)表達(dá)最為明顯。增殖肥大的 Müller 細(xì)胞形成的膠原纖維鞘包裹受損的神經(jīng)元。

圖2 RIR 模型中 Müller 細(xì)胞增殖情況(×200)

三、視網(wǎng)膜各核層比例改變

RIR 組 GCL層和 INL層細(xì)胞排列紊亂(圖3)。統(tǒng)計(jì)內(nèi)核層/外核層(INL/ONL)、內(nèi)核層/總核層(INL/TL)的的厚度比(表2)。發(fā)現(xiàn)造模后 INL/ONL 呈降低趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。造模后INL/TL呈上升趨勢(shì)，組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 RIR模型不同組別的 INL/ONL及INL/TL結(jié)果

圖3 RIR 模型導(dǎo)致視網(wǎng)膜各核層比例改變(×200)

四、CREB 的表達(dá)變化

本實(shí)驗(yàn)用 Western Blot 定量檢測(cè) CREB 在造模前后不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)水平(圖4)。發(fā)現(xiàn)造模后 7 d、 14 d CREB 表達(dá)下降， 21 d表達(dá)上調(diào)。 7、 14 d分別與對(duì)照組21 d組有顯著性差異。 Real-time PCR 結(jié)果顯示(圖 3)：各組 CREB 基因均較對(duì)照組下調(diào)，與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在 RIR 模型 14 d時(shí) CREB 基因相對(duì)表達(dá)量最低。其中 7 d、14 d相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表3 CREB 的表達(dá)變化

討 論

目前視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷在心腦血管疾病中的作用中研究較多[2-4]。CREB是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。I/HPC時(shí)細(xì)胞內(nèi)CREB表達(dá)增加，保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞免于凋亡。CREB激活后可通過(guò)上調(diào)BDNF、BCL-2等一些目的基因的表達(dá)，來(lái)減輕心臟缺血再灌注損傷[5]。眾所周知，視網(wǎng)膜來(lái)源于間腦，其許多功能和結(jié)構(gòu)特征與大腦相似。其發(fā)生缺血再灌注的病理生理過(guò)程與腦部相似。但是視網(wǎng)膜和大腦相比，最大的顯著性差異是視網(wǎng)膜對(duì)局部缺血損傷抵抗性較強(qiáng)。盡管因使用不同的動(dòng)物模型和種屬差異使得缺血性視網(wǎng)膜與大腦相比抵抗倍率缺乏一致性，但視網(wǎng)膜缺血時(shí)細(xì)胞存活率長(zhǎng)于大腦已是普遍共識(shí)。視網(wǎng)膜是非常薄的組織，當(dāng)其血管發(fā)生阻塞時(shí)，可以從玻璃體獲取部分能量，這也可能是視網(wǎng)膜具有缺血抵抗性的部分原因。

有研究發(fā)現(xiàn)對(duì)大鼠視網(wǎng)膜缺血損傷作定量分析，發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜缺血30 min時(shí)基本正常;而60 min時(shí)，內(nèi)層視網(wǎng)膜變薄，外核層基本沒(méi)有變化;90 min，節(jié)細(xì)胞層和內(nèi)核層的細(xì)胞幾乎不存在，外核層仍然相對(duì)地完整[6，7]。對(duì)于RGC的減少，本實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)類似變化。另外，從視網(wǎng)膜鋪片中觀察到神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的減少呈現(xiàn)區(qū)域化，即在鋸齒緣及視乳頭附近RGC的損傷程度較赤道輕微，可能是因?yàn)镽GC細(xì)胞在視網(wǎng)膜本身分布不均勻，及視網(wǎng)膜所受壓力不均的原因。加上本身小鼠視網(wǎng)膜的細(xì)胞構(gòu)成和厚度就有區(qū)域性差異，同時(shí)RIR模型后視網(wǎng)膜細(xì)胞存在代謝差異，比如靠近血管部位的神經(jīng)元更容易收到再灌注時(shí)炎性因子的損害。從而視網(wǎng)膜缺血再灌注后，視網(wǎng)膜損傷出現(xiàn)的差異性改變。缺乏上游神經(jīng)細(xì)胞的信息傳入，位于下游的外核層細(xì)胞自然的受到影響。有研究表明[6]，不同時(shí)間的RIR模型所引起的視網(wǎng)膜病變范圍是不同的。視網(wǎng)膜在缺血60 min時(shí)不單引起內(nèi)核層的神經(jīng)退行性改變，還會(huì)引起外核層光感受器的損害。而在缺血45 min時(shí)，主要對(duì)內(nèi)核層細(xì)胞產(chǎn)生影響。還有研究發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜缺血再灌注120 min時(shí)，內(nèi)核層及內(nèi)網(wǎng)層損傷較外核層明顯[7]。這些結(jié)果都提示，視網(wǎng)膜內(nèi)外核層具體的損傷程度因種屬和模型而異。視網(wǎng)膜對(duì)缺血再灌注損傷程度有區(qū)域化改變。

就我們的模型而言，對(duì)視網(wǎng)膜進(jìn)行DAPI染色統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，RIR 60 min造模后，內(nèi)外核層發(fā)生相似比例變化，內(nèi)總核層比例在造模前后也無(wú)明顯改變。在視網(wǎng)膜受到損傷時(shí)，Müller細(xì)胞立即活化，即Müller細(xì)胞反應(yīng)性膠質(zhì)化，Müller細(xì)胞活化會(huì)高表達(dá)GFAP，視網(wǎng)膜的免疫保護(hù)機(jī)制被啟動(dòng)。增生的Müller細(xì)胞軸突包繞受損傷的神經(jīng)細(xì)胞，形成長(zhǎng)駐狀結(jié)構(gòu)，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免收免疫因子的攻擊，在視網(wǎng)膜受損后的重塑起重要作用。本實(shí)驗(yàn)中對(duì)照組GFAP在GCL層有少量表達(dá)，是星形膠質(zhì)細(xì)胞的顯現(xiàn)。在RIR后，可見(jiàn)GFAP表達(dá)明顯增強(qiáng)，近似貫穿整個(gè)視網(wǎng)膜，與對(duì)照組相比有明顯差異。這是Müller受損后誘導(dǎo)表達(dá)GFAP。因此，RIR后可以激活Müller細(xì)胞。對(duì)與müller細(xì)胞在視網(wǎng)膜缺血再灌注中所以的作用，目前有兩種意見(jiàn)，一方面其能增生包裹神經(jīng)元免受免疫攻擊，同時(shí)卻阻礙神經(jīng)再生及形成瘢痕?；罨腗üller細(xì)胞還可通過(guò)釋放COX-2[8]、NO[9]，加重RGC的損傷。

我們用Westernblot定量方法，觀察造模前后CREB的表達(dá)情況。發(fā)現(xiàn)造模后7 d、14 d CREB表達(dá)下降，與對(duì)照組有顯著性差異。21 d CREB反而上升。有研究證實(shí)[10-12]，在動(dòng)物腦缺血損傷中CREB高表達(dá)，提示在腦缺血缺氧環(huán)境下對(duì)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。在視網(wǎng)膜缺血/低氧預(yù)適應(yīng)(I/HPC)中，有研究觀察到誘導(dǎo)性上調(diào)CREB具有對(duì)RGC的神經(jīng)保護(hù)作用[13]。在眼內(nèi)壓輕度增高時(shí)(28～35 mmHg)，因?yàn)锳kt激活受限，CREB表達(dá)下降[14]。有研究從觀察CRER的磷酸化來(lái)檢測(cè)腦缺血90 min CREB激活情況[15]，發(fā)現(xiàn)：缺血周?chē)鷧^(qū)有持續(xù)增強(qiáng)的磷酸化的CREB，有明顯的BCL-2表達(dá)，而缺盤(pán)中心區(qū)沒(méi)有檢測(cè)到BCL-2蛋白，這與該區(qū)神經(jīng)元丟失并出現(xiàn)梗死有關(guān)。對(duì)于CREB蛋白在損傷后21 d表達(dá)出現(xiàn)上升情況，可能是因?yàn)閺? d開(kāi)始視網(wǎng)膜處于損傷恢復(fù)期，至21 d后CREB恢復(fù)至正常水平。

綜上所述，本文研究發(fā)現(xiàn)，視網(wǎng)膜缺血再灌注會(huì)引起視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞大量喪失，CREB呈現(xiàn)下調(diào)表現(xiàn)。

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