劉 艷，金 鵬，王惠民

（淮安市食品藥品檢驗(yàn)所，江蘇 淮安 223300）

普魯卡因慶大霉素口服溶液為復(fù)方制劑，其組分為每200 mL含硫酸慶大霉素160萬單位（按慶大霉素計(jì)）與鹽酸普魯卡因2 g。生產(chǎn)企業(yè)原標(biāo)準(zhǔn)中無主藥成分的含量測定，為建立較為完整的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，達(dá)到有效控制產(chǎn)品質(zhì)量的目的，我們增加了硫酸慶大霉素的含量測定方法。本法參考相關(guān)書籍文獻(xiàn)建立了抗生素微生物檢定法測定硫酸慶大霉素含量，用于多批樣品的測定。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

ZY-300IV多功能微生物自動(dòng)測量分析儀（北京先驅(qū)威鋒技術(shù)開發(fā)公司）；PYZ-DHS型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）；XS205電子天平（Mettler公司）；高壓蒸汽滅菌鍋（Panasonic公司）。

1.2 試藥

短小芽孢桿菌[CMCC（B）63 202]；慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品（每毫克相當(dāng)于630單位，批號為130326-201015，中國食品藥品檢定研究院）；3批普魯卡因慶大霉素口服溶液（200 mL：硫酸慶大霉素16萬單位（按慶大霉素計(jì)）與鹽酸普魯卡因2 g，批號分別為160831、160901、160902，由生產(chǎn)廠家提供）；陰性樣品（由生產(chǎn)廠家提供）；抗生素檢定I號培養(yǎng)基（高pH），批號為3105457，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗(yàn)條件

2.1.1 菌懸液的制備

取經(jīng)過預(yù)試驗(yàn)的試驗(yàn)菌液適量加至培養(yǎng)基中，搖勻，備用。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

精密稱取慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品適量，加滅菌水溶解并制成約1000單位/mL的溶液，精密量取適量，用滅菌磷酸鹽緩沖溶液（pH7.8）稀釋成約12單位/mL（S2）和3單位/mL（S1）的溶液。

2.1.3 樣品溶液的制備

精密量取樣品5 mL，置40 mL量瓶中，用滅菌水稀釋至刻度，搖勻，精密量取適量，用滅菌磷酸鹽緩沖溶液（pH7.8）稀釋成約12單位/mL（T2）和3單位/mL（T1）的溶液。

2.1.4 陰性樣品溶液的制備

精密量取不含硫酸慶大霉素的陰性樣品，同“樣品溶液的制備”方法配制。

2.1.5 培養(yǎng)與測試

照抗生素微生物檢定法（《中國藥典》2015年版四部通則1201[1]）測定。方法中高、低劑量為1:4，培養(yǎng)溫度35～37℃，培養(yǎng)時(shí)間14～16小時(shí)；

2.2 對新方法的驗(yàn)證

按《中國藥典》2015年版四部通則9101藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則[2]、《中國藥典分析檢測技術(shù)指南》抗生素微生物檢定法[3]與《藥品微生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)》抗生素微生物鑒定法[4]對新建方法進(jìn)行驗(yàn)證。

2.2.1 專屬性

取陰性樣品溶液，按上述培養(yǎng)方法進(jìn)行測定，未產(chǎn)生抑菌圈，對結(jié)果無干擾，表明該方法專屬性良好。

2.2.2 線性與范圍

根據(jù)硫酸慶大霉素的對數(shù)濃度（劑量）與抑菌圈（反應(yīng)）關(guān)系的直線范圍內(nèi)，選擇一個(gè)中心濃度C0為5單位/mL；按劑距為1:0.8，各劑量按等比級數(shù)稀釋成系列濃度，每個(gè)濃度為一組，設(shè)10組，每組5個(gè)碟子；在各雙碟菌層培養(yǎng)基表面，按等角距位置安置4枚鋼管；在各組每個(gè)雙碟鋼管相隔的鋼管內(nèi)，均滴加中心濃度溶液，其余兩個(gè)鋼管內(nèi)滴加C1、C2、…Cn各濃度組溶液；滴加完畢后，將雙碟在規(guī)定溫度下培養(yǎng)14～16小時(shí)后，測定各抑菌圈直徑，計(jì)算。得出線性回歸方程y=0.6968+0.2192（X-17.7440）（r=0.9984），硫酸慶大霉素在濃度1.8225單位/mL～13.5790單位/mL范圍內(nèi)與抑菌圈成線性關(guān)系，平均可信限率為6.7。

2.2.3 準(zhǔn)確度

向不含硫酸慶大霉素的陰性樣品中加入已知量的硫酸慶大霉素對照品進(jìn)行測定。精密稱取硫酸慶大霉素對照品制成每1 mL中分別約含80單位、100單位、120單位的溶液，分別用pH7.8的磷酸鹽緩沖液按1:4的比例稀釋成高低濃度溶液，作為對照品溶液。精密稱取硫酸慶大霉素對照品，分別加陰性樣品，用pH7.8的磷酸鹽緩沖液按1:4的比例稀釋成高低濃度溶液，為回收測試樣品溶液。普魯卡因慶大霉素口服溶液中硫酸慶大霉素含量約為1%，根據(jù)指導(dǎo)原則，回收率限度應(yīng)為92～105%。取上述各溶液，按上述效價(jià)方法測定，結(jié)果為97～104%，在規(guī)定范圍內(nèi)。

2.2.4 精密度

根據(jù)指導(dǎo)原則，精密度RSD應(yīng)≤2%。取同一批號6份樣品，制備樣品溶液，按上述方法測定，計(jì)算結(jié)果分別為100.0%，100.8%，100.2%，100.3%，100.3%，100.5%，可信限率均不大于7%，平均值為100.4%，RSD為0.3%，在規(guī)定范圍之內(nèi)。

2.2.5 穩(wěn)定性

分別在0 h、24 h和48 h測定對照品溶液和樣品溶液抑菌圈，計(jì)算結(jié)果，含量分別為100.4%、100.4%、100.0%，RSD為0.3%，表明樣品在48h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3 樣品測定

取不同批號三批樣品，按以上擬定的含量測定方法檢驗(yàn)，計(jì)算硫酸慶大霉素含量，測定結(jié)果為100.0%，101.3%，100.7%，可信限率均不大于7%。

3 討 論

本研究根據(jù)硫酸慶大霉素特點(diǎn)，并結(jié)合短小芽孢桿菌生長特性，建立了抗生物微生物二劑量法測定硫酸慶大霉素含量，該方法中形成的抑菌圈邊緣清晰大小符合規(guī)定，可以使用抑菌圈測量儀進(jìn)行測量，可以大大提高測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。通過系統(tǒng)的方法學(xué)驗(yàn)證，證明了新方法的可靠性，該方法可以作為普魯卡因慶大霉素口服溶液中硫酸慶大霉素含量的常規(guī)質(zhì)量控制方法。